从人诱导多能干细胞生成 3D 中脑类器官

摘要

该协议描述了一种从人类诱导多能干细胞创建 3D 中脑类器官的新方法，指导它们的形成以模拟天然中脑组织，从而有助于研究发育和疾病。

摘要

从人类多能干细胞 （hPSC） 开发中脑类器官 （MO） 代表了在理解大脑发育、促进精确疾病建模和推进治疗研究方面的重大进步。该协议概述了一种使用诱导多能干细胞 （iPSC） 生成中脑特异性类器官的方法，采用战略分化方法。关键技术包括抑制 SMAD 信号传导的双重 SMAD 抑制、成纤维细胞生长因子 8b （FGF-8b） 的给药以及使用激动剂 purmorphamine 激活 Sonic Hedgehog 通路，引导 iPSC 走向中脑命运。

通过这种方法产生的类器官直径可达 2 mm，并包含多种神经上皮细胞类型，反映了中脑固有的细胞多样性。验证这些类器官是否为真实的中脑结构涉及中脑特异性标志物的表达，以确认它们的身份。这种方法的一个显着结果是 iPSC 有效分化为多巴胺能神经元，这是中脑的特征。

该协议的意义在于它能够产生功能成熟的中脑特异性类器官，这些类器官紧密复制中脑的基本方面，为深入探索中脑发育过程和相关疾病（如帕金森病）的病理生理学提供了有价值的模型。因此，该协议是寻求增强我们对人脑的理解并为神经退行性疾病开发新疗法的研究人员的重要资源，使其成为神经学研究领域不可或缺的工具。

引言

人脑具有错综复杂的结构以及复杂的细胞和分子组成，在神经科学研究中提出了艰巨的挑战，尤其是在疾病建模和细胞疗法开发的背景下¹。由于真正代表人脑复杂性的复杂体外模型的可用性有限，这些挑战变得更加复杂。然而，人类诱导多能干细胞 （iPSC） 技术的最新进展能够控制分化为特定神经元亚型，为探索人类大脑发育、疾病发病机制和基于细胞的治疗策略开辟了有希望的途径。

传统上，源自 iPSC 的二维 （2D） 神经元培养物一直是旨在模拟人类神经元生理学和病理学的体外研究的基石。这些单层培养物有助于增强我们对神经系统疾病的理解和发现神经保护剂 2,3,4,5,6,7。尽管它们很实用，但这些 2D 系统在模拟人脑的真实细胞多样性和三维 （3D） 结构方面存在不足。

脑类器官技术的出现代表了体外建模的重大飞跃，提供了一种在生理相关框架内紧密模拟人脑复杂生物学的工具⁸。脑类器官发育的早期技术利用 iPSC 的固有调节特性自发形成外胚层衍生物，从而模拟大脑发育的早期阶段 5,9,10,11,12。鉴于神经元与其他神经元和非神经元细胞形成的复杂网络，3D 建模对于准确研究神经退行性疾病至关重要。与 2D 培养相比，3D 培养物提供了更具代表性的体内环境，促进了神经元分化和网络形成 12,13,14，并促进了神经元基因的更广泛表达¹⁵。在 3D 环境中发育的神经元获得的形态和生理属性更让人想起它们的体内对应物¹⁶。

3D 大脑模型的最新进展对于更有效地捕捉人脑的空间和功能复杂性至关重要。在过去十年中，用于生成全脑类器官和区域特异性大脑模型^{11、17、18、19、20、21、22} 的多样化方案的进步被证明在模拟神经系统疾病（如小头症¹¹、阿尔茨海默病^14、23 和帕金森病²⁴）方面具有不可估量的价值.该协议的目标是开发和改进一种创建源自人类 iPSC 的 3D 人类 MO 的方法。该协议专门针对生成富含多巴胺能神经元的类器官，并以紧密模拟人类中脑的自然结构和功能的方式进行空间组织。这些类器官的主要目的是作为研究帕金森病的高级 体外 模型，为探索与该病症相关的神经发育过程和病理提供更准确和生理相关的系统。通过利用患者来源的 iPSC 生成这些中脑特异性类器官，该方案旨在增强对帕金森病机制的理解，促进潜在治疗靶点的发现，并改善基于细胞的疗法的开发。通过这种创新方法，该方案旨在克服传统 2D 神经元培养物的局限性，并通过为 体外 疾病建模和探索新治疗策略提供有力工具，为神经退行性疾病研究领域做出重大贡献。

在过去的 10 年里，各种研究团队开发了中脑类器官 （MO）8,21,25,26,27,28，利用了几个关键相似性的方法。为了加深对帕金森病的理解，我们开发了一种创建源自人类 iPSC 的 3D 人类 MO 的方案。这些类器官富含空间排列的多巴胺能神经元，为研究帕金森病提供了理想的模型。我们对中脑特异性类器官方案的开发和改进产生了先进的体外模型，这些模型为我们对神经发育过程和神经退行性疾病的理解做出了重大贡献。这些模型，特别是当应用于患者来源的 MO 时，已经证明了它们作为体外疾病建模的有效工具的有效性，为高级 3D 细胞培养领域提供了新的视角和方法。

研究方案

如前所述，由人正常成纤维细胞 Detroit 551 和人胚胎干细胞 （ESC） hESC 系 360 产生的 iPSC⁴.iPSC 是在挪威西部伦理健康研究委员会 REK nr 的批准下获得的。2012/919. 使用 MycoAlert 支原体检测试剂盒定期监测所有细胞的支原体污染。 材料表 包含有关本协议中使用的所有材料、试剂和设备的信息。 表 1 介绍了使用的介质和其他库存。

1. iPSC 解冻

1. 基质包被板和 essential 8 （E8） 培养基制备
   1. 将基底膜基质样品瓶在冰上解冻过夜。在冷的高级 Dulbecco 改良 Eagle 培养基 （DMEM）/Ham 的 F12 DMEM/F12（终浓度为 1%）中以 1：100 稀释（参见 材料表 和 表 1）。将等分试样储存在 -20 °C 以供长期使用。
   2. 在 4 °C 下解冻稀释的基底膜;在 6 孔板中涂上每孔 1 mL 溶液。在 37 °C 孵育 1 小时。
   3. 从培养箱中取出板，使其平衡至室温 （RT）。
      注意：板最多可冷藏 2 周（确保在使用前加热至 RT）。如需延长储存时间，请在涂层板中加入 1 mL E8 培养基（参见 材料表 和 表 1），以避免凝胶变干。
2. E8 培养基制备
   1. 在无菌环境中，将 E8 基础培养基与 E8 补充剂混合（参见 材料表 和 表 1）。
      注意：这可以在 4 °C 下储存 2 周。在制备完整培养基之前，将冷冻的 E8 补充剂在 4 °C 下解冻过夜。不要在 37 °C 下解冻，因为这可能会损害其稳定性。使用前，仅将所需体积的 E8 培养基加热至室温 （RT），直到摸起来不再凉爽。

2. 接种 iPSC

1. 在 RT 或 37 °C 的培养箱中预热基质包被的板和 E8 培养基。
2. 吸出培养基;用不含钙和镁的 Dulbecco 磷酸盐缓冲盐水（不含 DPBS Ca²⁺/Mg²⁺，每孔 4 mL，6 孔板）冲洗汇合度为 60%-70% 的 iPSC。
3. 添加乙二胺四乙酸（EDTA，0.5 mM，每孔 1 mL，参见 材料表 和 表 1）;在 37 °C 下孵育直至菌落边缘分离（3-5 分钟）。
4. 吸出解离溶液;要分离菌落，请小心地将预热的 E8 培养基（每孔 4 mL）直接移液到菌落上，用移液管比平时更强的力，从而在细胞表面产生局部液体运动。
5. 将细胞转移到基质包被的 6 孔板的两个新孔中，每孔添加 2 mL 培养基，以 1：2 的比例分流细胞。然后，在 37 °C 下孵育。
6. 每天更换培养基，直到菌落达到 80% 汇合。
7. 使用 10 倍放大倍率的显微镜观察菌落，确保它们大小合适，通常以直径为 0.5 至 1 mm 的明显圆形为特征。确认菌落是密集、紧凑的结构，具有轮廓分明、光滑的边界。

3. 神经诱导

1. 培养基制备和第 0 天 设置
   1. 参考 材料表 和 表 1，制备化学成分明确的培养基 （CDM）、神经诱导培养基 （NIM） 和无神经干细胞 （NSC SF） 培养基 500 mL。
   2. 在 6 孔板中用每孔 4 mL DPBS （1x）（不含 Ca²⁺/Mg²⁺- ）冲洗细胞，然后在每孔中加入 3 mL NIM 进行第 0 天设置。
   3. 在第 1、3 和 5 天更换 NIM（每孔 3 mL）;每天在显微镜下观察。
   4. 在第 6 天，使用以下步骤将神经玫瑰花结分离到悬浮培养物中。
      1. 用 DPBS （1x）（不含 Ca²⁺/Mg²⁺）（在 6 孔板中每孔 4 mL）轻轻洗涤一次。加入胶原酶 IV（在 6 孔板中每孔 1 mL）并孵育 1 分钟。去除胶原酶 IV，并用 DPBS （1x）（不含 Ca²⁺/Mg²⁺）（在 6 孔板中每孔 4 mL）轻轻冲洗一次。
      2. 向 6 孔板的每个孔中加入 2 mL NSC SF 培养基。通过刮擦孔底来分离细胞，用 200 μL 移液器吸头创建网格。
      3. 将细胞悬液从 6 孔板转移到 10 cm 非贴壁培养皿中。使用 NSC SF 培养基将体积调节至 12 mL。
      4. 将非粘附培养皿以 85 rpm 的速度以 0° 角放在摇床（ssm1 紧凑型轨道摇床）上，置于设置为 37 °C 和 5% CO₂ 的培养箱中，以防止聚集。

4. 中脑模式

1. 第 7 天，加入 12 mL CDM 和 100 ng/mL FGF-8b;置于 Orbital Shattor 培养箱上。
2. 第 8-13 天，每 2 天更换一次培养基;每天在显微镜下观察。
3. 第 14 天，加入 12 mL CDM，含 100 ng/mL FGF-8b 和 1 μM 噻吗胺 （PM）;置于轨道摇床上。
4. 第 15-20 天，每 2 天更换一次培养基;每天在显微镜下观察。

5. Matrigel 嵌入和 MO 终止和成熟

1. 在 2 °C 至 8 °C 之间的冰上解冻基质胶 1-2 小时。
   注意：解冻足量的 Matrigel，为每个拟胚体 （EB） 提供 15 μL。将 Matrigel 放在冰上冷却以避免早期聚合。使用前，将所有将与 Matrigel 接触的塑料器皿在 -20 °C 下冷却至少 30 分钟。
2. 将无菌类器官包埋片放入空培养皿中。
3. 使用宽口径 200 μL 移液器吸头，轻轻地从培养皿中取出类器官，并将其转移到包埋表面，每孔一个类器官。重复此过程，直到在包埋表面上收集 12-16 个 EB。
4. 小心地从每个 EB 中去除多余的培养基，然后将 15 μL 冷 Matrigel 滴加到每个 EB 上。在移液器的帮助下，将 EB 重新定位到 Matrigel 液滴的中心。
5. 将板在设定为 37 °C 的培养箱中孵育 15-20 分钟，以使 Matrigel 聚合。
6. 使用无菌镊子，提起带有 Matrigel 液滴的包埋片。将片材直接放在 6 孔超低粘附板中的一个孔上方。用 10 ng/mL 脑源性神经营养因子 （BDNF） 和 10 ng/mL 神经胶质细胞系源性神经营养因子 （GDNF） 吸取 3 mL CDM，然后轻轻冲洗片状基质胶液滴到每个孔中。重复此过程，直到所有 6-8 个 Matrigel 液滴都转移到一个孔中。
7. 将板放在 37 °C 培养箱中以 85 rpm 的轨道振荡器上，每 3 天更换一次 10 ng/mL BDNF 和 10 ng/mL GDNF 的 CDM。
   注：将分化培养物维持长达 3 个月;终止后 2 周后出现神经形态。BDNF 和 GDNF 对于超过 3 个月的培养不是必需的。

6. 免疫荧光染色

1. 使用 1,000 μL 移液器轻轻地从培养基中取回类器官，并将其轻轻放在培养基最少的显微镜载玻片上。
2. 在 RT 下使其完全风干。加入 4% 多聚甲醛 （PFA）（每个样品 300 μL），持续 30 分钟。
   注意：PFA 是危险的，可能具有致癌特性。请谨慎处理，避免直接接触皮肤和眼睛，并确保在化学通风橱内使用。
3. 向载玻片中加入 30% 蔗糖溶液（每个样品 300 μL），让它们在 4 °C 下孵育过夜。
4. 通过添加封闭缓冲液 （BB）（每个样品 300 μL）封闭和渗透类器官，其中包括 PBS（含 Ca²⁺/Mg²⁺）、0.3% Triton X-100 和 10% 正常山羊血清，在 RT 下放置 2 小时（或在 4 °C 下过夜）。使用疏水屏障笔描绘类器官并将缓冲液限制在载玻片上。
5. 在封闭缓冲液（每个样品 300 μL）、抗叉头盒蛋白 G1 （FOXG1， 1：200）、抗正齿同源盒 2 （OTX2， 1：100）、抗叉头盒 A2 （FOXA2， 1：100）、抗酪氨酸羟化酶 （TH， 1：100）、抗 SRY（性别决定区 Y）-盒 2 （SOX2， 1：100）、抗配对盒蛋白 （PAX6， 1：100） 和抗微管相关蛋白 2 （MAP2 1：500） 中覆盖样品， 并在 4 °C 下在黑暗中孵育过夜（参见 材料表）。
6. 在 1x PBS 中洗涤样品 3 小时，并在轻轻摇动的平台上更换 2 至 3 次缓冲液。
7. 与二抗（每个样品 300 μL）、抗 Alexa Fluor 488 （1：800）、抗 Alexa Fluor 594 （1：800） 和抗 Alexa Fluor 647 （1：800） 一起在加湿暗室中于 4 °C 孵育过夜。同时加入 Hoechst 33342 （1：5,000） 核染色剂（参见 材料表）。
8. 去除抗体，用 PBS 快速冲洗，然后在 4 °C 下加入含有 0.01% 叠氮化钠的 PBS 1-2 天以抑制污染。
9. 吸出 PBS，去除任何多余的溶液，并使用封固剂封固类器官（参见 材料表）。放置盖玻片，确保防止气泡形成，并在室温的暗室中储存至少 12 小时，以使封固剂充分聚合。
   注意：标本现在可以使用荧光显微镜进行观察。

结果

在这项研究中，我们介绍了一种从 iPSC 衍生 MO 的开创性方案。我们方法的核心是双 SMAD 抑制的创新应用，与 FGF-8b 和声波刺猬 （SHH） 通路激动剂嘎吗嗪 （PM） 协同结合。 这种方法如图 1 所示。分化过程首先将 iPSC 引导至神经外胚层谱系，形成神经上皮或神经玫瑰花结集落。这是通过双重 SMAD 信号抑制实现的，将 SB2431542 作为关键化合物

讨论

在这项研究中，我们开发了一种区分 MO 和 iPSC 的方法。我们的方案采用双重 SMAD 抑制策略，用形态发生因子增强，包括 FGF-8b 和 SHH 激动剂 PM。这种方法密切模拟了对中脑个体发育至关重要的发育线索。我们建立的分化途径促进了神经上皮结构的形成，让人想起在自然大脑发育过程中观察到的神经玫瑰花结。这种从二维培养到三维神经球的转变构成了类器官技术的重大进?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
CCD Microscope Camera Leica DFC3000 G	Leica Microsystems, Germany
Chemically Defined Lipid Concentrate	Thermo Fisher Scientific	11905031	CDM ingredient
Collagenase  IV	Thermo Fisher Scientific	17104019	Reagent for gentle dissociation of human iPSCs
Corning non-treated culture dishes	Sigma-Aldrich	CLS430589	Suspension culture
DMEM/F-12, GlutaMAX supplement	Thermo Fisher Scientific	10565018	Astrocyte differentiation basal Medium
DPBS	Thermo Fisher Scientific	14190250	Used for a variety of cell culture wash
EDTA	Thermo Fisher Scientific	15575020	Reagent for gentle dissociation of human iPSCs
Essential 8 Basal Medium	Thermo Fisher Scientific	A1516901	Basal medium for iPSC culture
Essential 8 Supplement (50x)	Thermo Fisher Scientific	A1517101	Supplement for iPSC culture
FCCP	Abcam	ab120081	Eliminates mitochondrial membrane potential and TMRE staining
FGF-basic	PeproTech	100-18B	Astrocyte differentiation medium ingredient
Fluid aspiration system BVC control	Vacuubrand, Germany
Formaldehyde (PFA) 16%	Thermo Fisher Scientific	28908	Cell fixation
GDNF	Peprotech	450-10	DA neurons medium ingredient
Geltrex (Basement membrane matrix)	Thermo Fisher Scientific	A1413302	Used for attachment and maintenance of human iPSCs
GlutaMAX Supplement	Thermo Fisher Scientific	35050061	Supplement for NSC culture
Heracell 150i CO2 Incubators	Fisher Scientific, USA
IMDM	Thermo Fisher Scientific	21980032	Basal medium for CDM
InSolution AMPK Inhibitor	Sigma-Aldrich	171261	Neural induction medium ingredient
Insulin	Roche	1376497	CDM ingredient
iPSCs derived from Detroit 551 fibroblats	ATCC	CCL-110
Leica TCS SP8 STED confocal microscope	Leica Microsystems, Germany
Matrigel	Life Science	354230	Matrigel embedding
Monothioglycerol	Sigma-Aldrich	M6145	CDM ingredient
Normal goat serum	Thermo Fisher Scientific	PCN5000	Used for blocking buffer
Orbital shakers - SSM1	Stuart Equipment, UK
Organoid Embedding Sheet	STEMCELL Technologies	8579	Matrigel embedding
Organoid Embedding Sheet	STEMCELL Technologies	8579
PBS 1x	Thermo Fisher Scientific	18912014	Used for a variety of washes
Poly-D-lysine hydrobromide	Sigma-Aldrich	P7405	Promotes attachment and growth of neural cells in vitro
Poly-L-ornithine solution	Sigma-Aldrich	P4957	Promotes attachment and growth of neural cells in vitro
ProLong Gold Antifade Mountant	Thermo Fisher Scientific	P36930	Mounting the coverslip for confocal image
Purmorphamine	STEMCELL Technologies	72204	Promotes DA neuron differentiation
Recombinant Human/Mouse FGF-8b Protein	R&D Systems	423-F8-025/CF	Promotes DA neuron differentiation
SB 431542	Tocris Bioscience	TB1614-GMP	Neural Induction Medium ingredient
TRITON X-100	VWR International	9002-93-1	Used for cells permeabilization in immunostaining assays
SSM1 compact orbital shaker	Norrscope	51901-10 SSM1 Shaker, orbital, mini 230V	Rotator for organoid culturing.
Water Bath Jb Academy Basic Jba5 JBA5 Grant Instruments	Grant Instruments, USA
Antibodies used for immunostaining
Primary antibody
anti-DAT	Abcam	ab128848, RRID:AB_2665470	Rabbit; 1:100
anti-FOXA2	ProteinTech	22474-1-AP, RRID:AB_2879110	Rabbit; 1:100
anti-FOXG1	Abcam	ab196868, RRID:AB_2892604	Rabbit; 1:200
anti-LMX1	Abcam	ab139726, RRID:AB_2827684	Rabbit; 1:100
anti-MAP2	Abcam	ab5392 ,RRID:AB_2138153	Chicken; 1:500
anti-OTX2	ProteinTech	13497-1-AP, RRID:AB_2157176	Rabbit; 1:100
anti-TH	Abcam	ab75875, RRID:AB_1310786	Rabbit; 1:100
Secondary antibody			Dilution (μL)
Alexa Fluor  594 goat anti-rabbit IgG	Thermo Fisher Scientific	A-11012	1:400
Alexa Fluor  488 goat anti-rabbit IgG	Thermo Fisher Scientific	A- 11008	1:400
Alexa Fluor  488 goat anti-rabbit IgG	Thermo Fisher Scientific	A- 11008	1:400
Alexa Fluor  488 goat anti-rabbit IgG	Thermo Fisher Scientific	A- 11008	1:400
Alexa Fluor  594 goat anti-rabbit IgG	Thermo Fisher Scientific	A-11012	1:400
Alexa Fluor  594 goat anti-rabbit IgG	Thermo Fisher Scientific	A-11012	1:400
Alexa Fluor  647 goat anti-chicken IgG	Thermo Fisher Scientific	A-21469	1:400