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Method Article
Este protocolo descreve um novo método para criar organoides 3D do mesencéfalo a partir de células-tronco pluripotentes induzidas por humanos, orientando sua formação para imitar o tecido nativo do mesencéfalo, auxiliando assim no estudo do desenvolvimento e distúrbios.
O desenvolvimento de organoides do mesencéfalo (MOs) a partir de células-tronco pluripotentes humanas (hPSCs) representa um avanço significativo na compreensão do desenvolvimento do cérebro, facilitando a modelagem precisa da doença e avançando na pesquisa terapêutica. Este protocolo descreve um método para gerar organoides específicos do mesencéfalo usando células-tronco pluripotentes induzidas (iPSCs), empregando uma abordagem de diferenciação estratégica. As principais técnicas incluem inibição dupla de SMAD para suprimir a sinalização SMAD, administração do fator de crescimento de fibroblastos 8b (FGF-8b) e ativação da via Sonic Hedgehog usando o agonista purmorlamina, guiando as iPSCs em direção a um destino no mesencéfalo.
Os organoides produzidos por este método atingem diâmetros de até 2 mm e incorporam uma gama diversificada de tipos de células neuroepiteliais, refletindo a diversidade celular inerente do mesencéfalo. A validação desses organoides como estruturas autênticas do mesencéfalo envolve a expressão de marcadores específicos do mesencéfalo, confirmando sua identidade. Um resultado notável dessa metodologia é a diferenciação efetiva de iPSCs em neurônios dopaminérgicos, que são característicos do mesencéfalo.
A importância deste protocolo reside em sua capacidade de produzir organoides funcionalmente maduros e específicos do mesencéfalo que replicam de perto aspectos essenciais do mesencéfalo, oferecendo um modelo valioso para uma exploração aprofundada dos processos de desenvolvimento do mesencéfalo e da fisiopatologia de distúrbios relacionados, como a doença de Parkinson. Assim, este protocolo serve como um recurso crucial para pesquisadores que buscam aprimorar nossa compreensão do cérebro humano e desenvolver novos tratamentos para doenças neurodegenerativas, tornando-se uma ferramenta indispensável no campo da pesquisa neurológica.
O cérebro humano, com sua arquitetura intrincada e composição celular e molecular complexa, apresenta desafios formidáveis na pesquisa em neurociência, particularmente no contexto da modelagem de doenças e do desenvolvimento de terapia celular1. Esses desafios são ainda mais complicados pela disponibilidade limitada de modelos sofisticados in vitro que realmente representam a complexidade do cérebro humano. No entanto, avanços recentes na tecnologia de células-tronco pluripotentes induzidas por humanos (iPSC), permitindo a diferenciação controlada em subtipos neuronais específicos, abriram caminhos promissores para explorar o desenvolvimento do cérebro humano, patogênese de doenças e estratégias terapêuticas baseadas em células.
Tradicionalmente, as culturas neuronais bidimensionais (2D) derivadas de iPSCs têm sido a pedra angular dos estudos in vitro destinados a imitar a fisiologia e a patologia neuronal humana. Essas culturas de monocamada têm sido fundamentais para melhorar nossa compreensão das doenças neurológicas e na descoberta de agentes neuroprotetores 2,3,4,5,6,7. Apesar de sua utilidade, esses sistemas 2D ficam aquém de emular a verdadeira diversidade celular e a estrutura tridimensional (3D) do cérebro humano.
O advento da tecnologia de organoides cerebrais representa um salto significativo na modelagem in vitro, fornecendo uma ferramenta que imita de perto a intrincada biologia do cérebro humano dentro de uma estrutura fisiologicamente relevante8. As primeiras técnicas de desenvolvimento de organoides cerebrais capitalizaram as propriedades regulatórias inerentes das iPSCs para formar espontaneamente derivados do ectoderma, imitando assim os estágios iniciais do desenvolvimento do cérebro 5,9,10,11,12. Dadas as complexas redes formadas por neurônios com outras células neuronais e não neuronais, a modelagem 3D torna-se essencial para estudar com precisão as doenças neurodegenerativas. As culturas 3D fornecem um ambiente in vivo mais representativo, facilitando a diferenciação neuronal acelerada e a formação de redes12 , 13 , 14 , e promovem uma expressão mais ampla de genes neuronais em comparação com as culturas 2D15 . Os neurônios desenvolvidos em contextos 3D atingem morfologias e atributos fisiológicos mais reminiscentes de suas contrapartes in vivo 16.
Avanços recentes em modelos cerebrais 3D foram fundamentais para capturar a complexidade espacial e funcional do cérebro humano de forma mais eficaz. Na última década, o avanço de diversos protocolos para gerar organoides cerebrais inteiros e modelos cerebrais específicos da região 11,17,18,19,20,21,22, mostrou-se inestimável na modelagem de distúrbios neurológicos como microcefalia 11, doença de Alzheimer 14,23 e doença de Parkinson24. O objetivo deste protocolo é desenvolver e refinar um método para criar MOs humanos 3D derivados de iPSCs humanos. Este protocolo visa especificamente gerar organoides que são enriquecidos com neurônios dopaminérgicos e organizados espacialmente de uma maneira que imita de perto a estrutura natural e a funcionalidade do mesencéfalo humano. O objetivo principal desses organoides é servir como modelos in vitro avançados para estudar a doença de Parkinson, fornecendo um sistema mais preciso e fisiologicamente relevante para explorar os processos de neurodesenvolvimento e patologias associadas a essa condição. Ao alavancar iPSCs derivadas de pacientes para gerar esses organoides específicos do mesencéfalo, o protocolo busca melhorar a compreensão dos mecanismos da doença de Parkinson, facilitar a descoberta de potenciais alvos terapêuticos e melhorar o desenvolvimento de terapias baseadas em células. Por meio dessa abordagem inovadora, o protocolo visa superar as limitações das culturas neuronais 2D tradicionais e contribuir significativamente para o campo da pesquisa de doenças neurodegenerativas, oferecendo uma ferramenta potente para modelagem de doenças in vitro e a exploração de novas estratégias de tratamento.
Nos últimos 10 anos, várias equipes de pesquisa desenvolveram organoides do mesencéfalo (MOs)8,21,25,26,27,28, utilizando metodologias que exibem várias semelhanças importantes. Em nossa busca para aprofundar a compreensão da doença de Parkinson, desenvolvemos um protocolo para criar MOs humanos 3D derivados de iPSCs humanos. Esses organoides, enriquecidos com neurônios dopaminérgicos dispostos espacialmente, apresentam um modelo ideal para estudar a doença de Parkinson. Nosso desenvolvimento e refinamento de protocolos organoides específicos do mesencéfalo produziram modelos in vitro avançados que contribuíram significativamente para nossa compreensão dos processos de neurodesenvolvimento e doenças neurodegenerativas. Esses modelos, particularmente quando aplicados a MOs derivados de pacientes, demonstraram sua eficácia como ferramentas potentes para modelagem de doenças in vitro, oferecendo novas perspectivas e metodologias no campo da cultura celular 3D avançada.
As iPSCs geradas a partir de fibroblastos humanos normais Detroit 551 e células-tronco embrionárias humanas (ESCs) hESC linha 360 conforme descrito anteriormente4. As iPSCs foram obtidas com a aprovação do Comitê da Noruega Ocidental para Pesquisa em Saúde Ética REK nr. 2012/919. Todas as células foram monitoradas regularmente quanto à contaminação por Mycoplasma usando o MycoAlert Mycoplasma Detection Kit. A Tabela de Materiais contém informações sobre todos os materiais, reagentes e equipamentos usados neste protocolo. A Tabela 1 descreve a mídia e outros materiais usados.
1. Descongelamento de iPSCs
2. Semeando iPSCs
3. Indução neural
4. Padronização do mesencéfalo
5. Incorporação de Matrigel e terminação e maturação MO
6. Coloração de imunofluorescência
Neste estudo, apresentamos um protocolo pioneiro para a derivação de MOs de iPSCs. O ponto central de nossa metodologia é o uso inovador da inibição dupla de SMAD, combinada sinergicamente com FGF-8b e agonista da via sonic hedgehog (SHH) purmorlamina (PM). Essa abordagem é representada na Figura 1. O processo de diferenciação começa direcionando as iPSCs para a linhagem do neuroectoderma, formando colônias de rosetas neuroepiteliais ou neurais. Is...
Nesta investigação, desenvolvemos uma metodologia para a diferenciação de MO de iPSCs. Nosso protocolo emprega uma estratégia de inibição de SMAD duplo aprimorada com fatores morfogênicos, incluindo FGF-8b e o agonista SHH PM. Essa abordagem simula de perto as pistas de desenvolvimento cruciais para a ontogenia do mesencéfalo. A via de diferenciação que instituímos estimula a formação de estruturas neuroepiteliais que lembram as rosetas neurais observadas durante o desenvol...
Os autores não têm conflitos de interesse a divulgar.
A Figura 1 é criada usando BioRender.com. Agradecemos à Universidade de Bergen Meltzers Høyskolefonds (número do projeto: 103517133), Gerda Meyer Nyquist Guldbrandson e Gerdt Meyer Nyquists legat (número do projeto: 103816102) pelo financiamento.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
CCD Microscope Camera Leica DFC3000 G | Leica Microsystems, Germany | ||
Chemically Defined Lipid Concentrate | Thermo Fisher Scientific | 11905031 | CDM ingredient |
Collagenase IV | Thermo Fisher Scientific | 17104019 | Reagent for gentle dissociation of human iPSCs |
Corning non-treated culture dishes | Sigma-Aldrich | CLS430589 | Suspension culture |
DMEM/F-12, GlutaMAX supplement | Thermo Fisher Scientific | 10565018 | Astrocyte differentiation basal Medium |
DPBS | Thermo Fisher Scientific | 14190250 | Used for a variety of cell culture wash |
EDTA | Thermo Fisher Scientific | 15575020 | Reagent for gentle dissociation of human iPSCs |
Essential 8 Basal Medium | Thermo Fisher Scientific | A1516901 | Basal medium for iPSC culture |
Essential 8 Supplement (50x) | Thermo Fisher Scientific | A1517101 | Supplement for iPSC culture |
FCCP | Abcam | ab120081 | Eliminates mitochondrial membrane potential and TMRE staining |
FGF-basic | PeproTech | 100-18B | Astrocyte differentiation medium ingredient |
Fluid aspiration system BVC control | Vacuubrand, Germany | ||
Formaldehyde (PFA) 16% | Thermo Fisher Scientific | 28908 | Cell fixation |
GDNF | Peprotech | 450-10 | DA neurons medium ingredient |
Geltrex (Basement membrane matrix) | Thermo Fisher Scientific | A1413302 | Used for attachment and maintenance of human iPSCs |
GlutaMAX Supplement | Thermo Fisher Scientific | 35050061 | Supplement for NSC culture |
Heracell 150i CO2 Incubators | Fisher Scientific, USA | ||
IMDM | Thermo Fisher Scientific | 21980032 | Basal medium for CDM |
InSolution AMPK Inhibitor | Sigma-Aldrich | 171261 | Neural induction medium ingredient |
Insulin | Roche | 1376497 | CDM ingredient |
iPSCs derived from Detroit 551 fibroblats | ATCC | CCL-110 | |
Leica TCS SP8 STED confocal microscope | Leica Microsystems, Germany | ||
Matrigel | Life Science | 354230 | Matrigel embedding |
Monothioglycerol | Sigma-Aldrich | M6145 | CDM ingredient |
Normal goat serum | Thermo Fisher Scientific | PCN5000 | Used for blocking buffer |
Orbital shakers - SSM1 | Stuart Equipment, UK | ||
Organoid Embedding Sheet | STEMCELL Technologies | 8579 | Matrigel embedding |
Organoid Embedding Sheet | STEMCELL Technologies | 8579 | |
PBS 1x | Thermo Fisher Scientific | 18912014 | Used for a variety of washes |
Poly-D-lysine hydrobromide | Sigma-Aldrich | P7405 | Promotes attachment and growth of neural cells in vitro |
Poly-L-ornithine solution | Sigma-Aldrich | P4957 | Promotes attachment and growth of neural cells in vitro |
ProLong Gold Antifade Mountant | Thermo Fisher Scientific | P36930 | Mounting the coverslip for confocal image |
Purmorphamine | STEMCELL Technologies | 72204 | Promotes DA neuron differentiation |
Recombinant Human/Mouse FGF-8b Protein | R&D Systems | 423-F8-025/CF | Promotes DA neuron differentiation |
SB 431542 | Tocris Bioscience | TB1614-GMP | Neural Induction Medium ingredient |
TRITON X-100 | VWR International | 9002-93-1 | Used for cells permeabilization in immunostaining assays |
SSM1 compact orbital shaker | Norrscope | 51901-10 SSM1 Shaker, orbital, mini 230V | Rotator for organoid culturing. |
Water Bath Jb Academy Basic Jba5 JBA5 Grant Instruments | Grant Instruments, USA | ||
Antibodies used for immunostaining | |||
Primary antibody | |||
anti-DAT | Abcam | ab128848, RRID:AB_2665470 | Rabbit; 1:100 |
anti-FOXA2 | ProteinTech | 22474-1-AP, RRID:AB_2879110 | Rabbit; 1:100 |
anti-FOXG1 | Abcam | ab196868, RRID:AB_2892604 | Rabbit; 1:200 |
anti-LMX1 | Abcam | ab139726, RRID:AB_2827684 | Rabbit; 1:100 |
anti-MAP2 | Abcam | ab5392 ,RRID:AB_2138153 | Chicken; 1:500 |
anti-OTX2 | ProteinTech | 13497-1-AP, RRID:AB_2157176 | Rabbit; 1:100 |
anti-TH | Abcam | ab75875, RRID:AB_1310786 | Rabbit; 1:100 |
Secondary antibody | Dilution (μL) | ||
Alexa Fluor 594 goat anti-rabbit IgG | Thermo Fisher Scientific | A-11012 | 1:400 |
Alexa Fluor 488 goat anti-rabbit IgG | Thermo Fisher Scientific | A- 11008 | 1:400 |
Alexa Fluor 488 goat anti-rabbit IgG | Thermo Fisher Scientific | A- 11008 | 1:400 |
Alexa Fluor 488 goat anti-rabbit IgG | Thermo Fisher Scientific | A- 11008 | 1:400 |
Alexa Fluor 594 goat anti-rabbit IgG | Thermo Fisher Scientific | A-11012 | 1:400 |
Alexa Fluor 594 goat anti-rabbit IgG | Thermo Fisher Scientific | A-11012 | 1:400 |
Alexa Fluor 647 goat anti-chicken IgG | Thermo Fisher Scientific | A-21469 | 1:400 |
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