Generación de organoides 3D del mesencéfalo a partir de células madre pluripotentes inducidas por humanos

Resumen

Este protocolo describe un método novedoso para crear organoides 3D del mesencéfalo a partir de células madre pluripotentes inducidas humanas, guiando su formación para imitar el tejido nativo del mesencéfalo, ayudando así en el estudio del desarrollo y los trastornos.

Resumen

El desarrollo de organoides del mesencéfalo (MO) a partir de células madre pluripotentes humanas (hPSC) representa un avance significativo en la comprensión del desarrollo cerebral, facilitando el modelado preciso de la enfermedad y avanzando en la investigación terapéutica. Este protocolo describe un método para generar organoides específicos del mesencéfalo utilizando células madre pluripotentes inducidas (iPSC), empleando un enfoque de diferenciación estratégica. Las técnicas clave incluyen la inhibición de SMAD dual para suprimir la señalización de SMAD, la administración del factor de crecimiento de fibroblastos 8b (FGF-8b) y la activación de la vía Sonic Hedgehog utilizando el agonista purmorfamina, guiando a las iPSC hacia un destino en el mesencéfalo.

Los organoides producidos por este método alcanzan diámetros de hasta 2 mm e incorporan una amplia gama de tipos de células neuroepiteliales, lo que refleja la diversidad celular inherente del mesencéfalo. La validación de estos organoides como estructuras auténticas del mesencéfalo implica la expresión de marcadores específicos del mesencéfalo, lo que confirma su identidad. Un resultado notable de esta metodología es la diferenciación efectiva de las iPSC en neuronas dopaminérgicas, que son características del mesencéfalo.

La importancia de este protocolo radica en su capacidad para producir organoides funcionalmente maduros y específicos del mesencéfalo que replican de cerca aspectos esenciales del mesencéfalo, ofreciendo un modelo valioso para la exploración en profundidad de los procesos de desarrollo del mesencéfalo y la fisiopatología de trastornos relacionados como la enfermedad de Parkinson. Por lo tanto, este protocolo sirve como un recurso crucial para los investigadores que buscan mejorar nuestra comprensión del cerebro humano y desarrollar nuevos tratamientos para enfermedades neurodegenerativas, lo que lo convierte en una herramienta indispensable en el campo de la investigación neurológica.

Introducción

El cerebro humano, con su intrincada arquitectura y compleja composición celular y molecular, presenta desafíos formidables en la investigación en neurociencia, particularmente en el contexto del modelado de enfermedades y^{el desarrollo de} terapias celulares. Estos desafíos se complican aún más por la disponibilidad limitada de modelos in vitro sofisticados que realmente representen la complejidad del cerebro humano. Sin embargo, los avances recientes en la tecnología de células madre pluripotentes inducidas humanas (iPSC), que permiten la diferenciación controlada en subtipos neuronales específicos, han abierto vías prometedoras para explorar el desarrollo del cerebro humano, la patogénesis de enfermedades y las estrategias terapéuticas basadas en células.

Tradicionalmente, los cultivos neuronales bidimensionales (2D) derivados de iPSCs han sido la piedra angular de los estudios in vitro destinados a imitar la fisiología y patología neuronal humana. Estos cultivos monocapa han sido fundamentales para mejorar nuestra comprensión de las enfermedades neurológicas y en el descubrimiento de agentes neuroprotectores 2,3,4,5,6,7. A pesar de su utilidad, estos sistemas 2D se quedan cortos a la hora de emular la verdadera diversidad celular y la estructura tridimensional (3D) del cerebro humano.

El advenimiento de la tecnología de organoides cerebrales representa un salto significativo en el modelado in vitro, proporcionando una herramienta que imita de cerca la intrincada biología del cerebro humano dentro de un marco fisiológicamente relevante⁸. Las primeras técnicas en el desarrollo de organoides cerebrales aprovecharon las propiedades reguladoras inherentes de las iPSC para formar espontáneamente derivados del ectodermo, imitando así las primeras etapas del desarrollo del cerebro 5,9,10,11,12. Dadas las complejas redes formadas por las neuronas con otras células neuronales y no neuronales, el modelado 3D se vuelve esencial para estudiar con precisión las enfermedades neurodegenerativas. Los cultivos 3D proporcionan un entorno in vivo más representativo, facilitando la diferenciación neuronal acelerada y la formación de redes 12,13,14, y promueven una expresión más amplia de genes neuronales en comparación con los cultivos 2D¹⁵. Las neuronas desarrolladas en contextos 3D alcanzan morfologías y atributos fisiológicos más parecidos a sus homólogos in vivo ¹⁶.

Los avances recientes en los modelos cerebrales 3D han sido fundamentales para capturar la complejidad espacial y funcional del cerebro humano de manera más efectiva. Durante la última década, el avance de diversos protocolos para generar organoides cerebrales completos y modelos cerebrales específicos de la región 11,17,18,19,20,21,22^, demostró ser invaluable para modelar trastornos neurológicos como la microcefalia¹¹, la enfermedad de Alzheimer^14,23 y la enfermedad de Parkinson²⁴. El objetivo de este protocolo es desarrollar y refinar un método para crear MO humanos en 3D derivados de iPSC humanas. Este protocolo está específicamente dirigido a generar organoides que se enriquecen con neuronas dopaminérgicas y se organizan espacialmente de una manera que imita de cerca la estructura natural y la funcionalidad del mesencéfalo humano. El objetivo principal de estos organoides es servir como modelos in vitro avanzados para el estudio de la enfermedad de Parkinson, proporcionando un sistema más preciso y fisiológicamente relevante para explorar los procesos y patologías del neurodesarrollo asociados con esta afección. Al aprovechar las iPSC derivadas de pacientes para generar estos organoides específicos del mesencéfalo, el protocolo busca mejorar la comprensión de los mecanismos de la enfermedad de Parkinson, facilitar el descubrimiento de posibles objetivos terapéuticos y mejorar el desarrollo de terapias basadas en células. A través de este enfoque innovador, el protocolo tiene como objetivo superar las limitaciones de los cultivos neuronales 2D tradicionales y contribuir significativamente al campo de la investigación de enfermedades neurodegenerativas al ofrecer una potente herramienta para el modelado de enfermedades in vitro y la exploración de nuevas estrategias de tratamiento.

En los últimos 10 años, varios equipos de investigación han desarrollado organoides (MO) del mesencéfalo8,21,25,26,27,28, utilizando metodologías que exhiben varias similitudes clave. En nuestro afán por profundizar en la comprensión de la enfermedad de Parkinson, hemos desarrollado un protocolo para crear MO humanos en 3D derivados de iPSC humanas. Estos organoides, enriquecidos con neuronas dopaminérgicas dispuestas espacialmente, presentan un modelo ideal para el estudio de la enfermedad de Parkinson. Nuestro desarrollo y refinamiento de protocolos de organoides específicos del mesencéfalo han producido modelos in vitro avanzados que han contribuido significativamente a nuestra comprensión de los procesos de neurodesarrollo y las enfermedades neurodegenerativas. Estos modelos, especialmente cuando se aplican a MO derivados de pacientes, han demostrado su eficacia como herramientas potentes para el modelado de enfermedades in vitro, ofreciendo nuevas perspectivas y metodologías en el campo del cultivo celular 3D avanzado.

Protocolo

Las iPSCs generadas a partir de fibroblastos humanos normales Detroit 551 y células madre embrionarias humanas (ESC) hESC line 360 como se ha descrito anteriormente⁴. Las iPSC se obtuvieron con la aprobación del Comité de Noruega Occidental para la Investigación Ética en Salud REK nr. 2012/919. Todas las células fueron monitoreadas regularmente para detectar contaminación por Mycoplasma utilizando el kit de detección de Mycoplasma MycoAlert. La Tabla de Materiales contiene información sobre todos los materiales, reactivos y equipos utilizados en este protocolo. En la Tabla 1 se describen los medios y otras existencias utilizadas.

1. Descongelación de iPSC

1. Placa recubierta de matriz y preparación esencial del medio 8 (E8)
   1. Descongele el vial de la matriz de la membrana basal con hielo durante la noche. Diluir 1:100 en frío Advanced Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)/Ham's F12 DMEM/F12 (1% de concentración final) (ver Tabla de Materiales y Tabla 1). Almacene las alícuotas a -20 °C para su uso a largo plazo.
   2. Descongelar la membrana basal diluida a 4 °C; cubra una placa de 6 pocillos con 1 mL de solución por pocillo. Incubar a 37 °C durante 1 h.
   3. Retire la placa de la incubadora y deje que se equilibre a temperatura ambiente (RT).
      NOTA: Las placas se pueden refrigerar durante un máximo de 2 semanas (asegúrese de calentarlas a RT antes de usarlas). Para un almacenamiento prolongado, agregue 1 mL de medio E8 (consulte la Tabla de materiales y la Tabla 1) a la placa recubierta para evitar que el gel se seque.
2. Preparación del medio E8
   1. En un ambiente estéril, combine el medio basal E8 con el suplemento E8 (ver Tabla de Materiales y Tabla 1).
      NOTA: Se puede almacenar a 4 °C durante 2 semanas. Descongele el suplemento de E8 congelado durante la noche a 4 °C antes de preparar el medio completo. No descongele a 37 °C, ya que esto puede comprometer su estabilidad. Antes de usar, caliente solo el volumen requerido de E8 Medio a temperatura ambiente (RT) hasta que ya no esté frío al tacto.

2. Siembra de iPSCs

1. Precaliente las placas recubiertas de matriz y el medio E8 en RT o incubadora a 37 °C.
2. Aspirar medio de cultivo; enjuague las iPSC, que tienen una confluencia del 60%-70%, con solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco sin calcio ni magnesio (libre de DPBS Ca²⁺/Mg²⁺, 4 mL por pocillo en una placa de 6 pocillos).
3. Añadir ácido etilendiaminotetraacético (EDTA, 0,5 mM, 1 mL por pocillo, ver Tabla de Materiales y Tabla 1); incubar a 37 °C hasta que se desprendan los bordes de la colonia (3-5 min).
4. Aspirar la solución de disociación; para separar las colonias, pipetee cuidadosamente el medio E8 precalentado (4 ml por pocillo) directamente sobre las colonias con una fuerza más fuerte de lo habitual de la pipeta, lo que genera un movimiento de fluido localizado sobre la superficie de la célula.
5. Divida las celdas en una proporción de 1:2 transfiriéndolas a dos pocillos nuevos de una placa de 6 pocillos recubierta de matriz, agregando 2 mL de medio por pocillo. A continuación, incubar a 37 °C.
6. Intercambiar los medios diariamente hasta que las colonias alcancen el 80% de confluencia.
7. Usando un microscopio con un aumento de 10x, observe las colonias para asegurarse de que sean de un tamaño adecuado, generalmente caracterizadas por una forma redonda distintiva con un diámetro que varía de 0,5 a 1 mm. Confirme que las colonias son estructuras densas y compactas con bordes delineados y lisos.

3. Inducción neuronal

1. Preparación media y puesta a punto para el día 0
   1. Prepare 500 mL de medio químicamente definido (CDM), medio de inducción neural (NIM) y medio libre de suero de células madre neurales (NSC SF), consultando la Tabla de Materiales y la Tabla 1.
   2. Enjuague las celdas en una placa de 6 pocillos con 4 mL de DPBS (1x) (libre de Ca²⁺/Mg²⁺-) por pocillo, seguido de la adición de 3 mL de NIM por pocillo para la configuración del día 0.
   3. Reemplace NIM (3 mL por pocillo) en los días 1, 3 y 5; Observar diariamente bajo un microscopio.
   4. El día 6, separe las rosetas neuronales en un cultivo en suspensión siguiendo los siguientes pasos.
      1. Lave suavemente una vez con DPBS (1x) (sin Ca²⁺/Mg²⁺) (4 mL por pocillo en una placa de 6 pocillos). Agregue colagenasa IV (1 mL por pocillo en una placa de 6 pocillos) e incube durante 1 min. Retire la colagenasa IV y enjuague delicadamente una vez con DPBS (1x) (Ca²⁺/Mg²⁺-free) (4 mL por pocillo en una placa de 6 pocillos).
      2. Agregue 2 mL de NSC SF Medium a cada pocillo de una placa de 6 pocillos. Separe las células raspando el fondo de los pocillos, creando rejillas con una punta de pipeta de 200 μL.
      3. Transfiera la suspensión de celdas de la placa de 6 pocillos a una placa no adherente de 10 cm. Ajuste el volumen a 12 ml con NSC SF Medium.
      4. Coloque el plato no adherente en el agitador (agitador orbital compacto ssm1) a 85 rpm en un ángulo de 0° en una incubadora ajustada a 37 °C con 5% de CO₂ para evitar la agregación.

4. Patrones del mesencéfalo

1. El día 7, agregue 12 mL de CDM con 100 ng/mL de FGF-8b; Coloque en la incubadora agitadora orbital.
2. En los días 8-13, cambie el medio cada 2 días; Observar bajo un microscopio todos los días.
3. El día 14, agregue 12 mL de CDM con 100 ng/mL de FGF-8b y 1 μM de purmorfamina (PM); Coloque en el agitador orbital.
4. En los días 15-20, cambie el medio cada 2 días; Observar bajo un microscopio todos los días.

5. Incrustación de Matrigel y terminación y maduración de MO

1. Descongele Matrigel en hielo a una temperatura entre 2 °C y 8 °C durante 1-2 h.
   NOTA: Descongele una cantidad adecuada de Matrigel para suministrar 15 μL por cada cuerpo embrioide (EB). Mantenga Matrigel refrigerado en hielo para evitar la polimerización temprana. Enfríe todos los utensilios de plástico que vayan a estar en contacto con Matrigel a -20 °C durante un mínimo de 30 minutos antes de su utilización.
2. Coloque una hoja de inclusión de organoide estéril en un plato vacío.
3. Con una punta de pipeta de 200 μL de diámetro ancho, extraiga suavemente el organoide de la placa y transfiéralo a la superficie de inclusión con un organoide por pocillo. Repita este proceso hasta que se recojan entre 12 y 16 EB en la superficie de incrustación.
4. Retire con cuidado el exceso de medio de cada EB y luego agregue 15 μL de Matrigel frío gota a gota en cada EB. Con la ayuda de una pipeta, vuelva a colocar el EB en el centro de la gota de Matrigel.
5. Incubar la placa en una incubadora a 37 °C durante 15-20 min para permitir que la Matrigel polimerice.
6. Con pinzas estériles, levante la hoja de inclusión con las gotas de Matrigel. Sostenga la hoja directamente sobre un pocillo en una placa de adherencia ultra baja de 6 pocillos. Pipetear 3 mL de CDM con 10 ng/mL de factor neurotrófico derivado del cerebro (BDNF) y 10 ng/mL de factor neurotrófico derivado de la línea celular glial (GDNF) y enjuagar suavemente las gotas de Matrigel de la lámina en cada pocillo. Repita este proceso hasta que las 6-8 gotas de Matrigel se transfieran a un pocillo.
7. Coloque las placas en un agitador orbital en una incubadora a 37 °C a 85 rpm y cambie el CDM con 10 ng/mL de BDNF y 10 ng/mL de GDNF cada 3 días.
   NOTA: Mantenga los cultivos diferenciadores hasta por 3 meses; La morfología neural aparece después de 2 semanas después de la terminación. BDNF y GDNF no son necesarios para el cultivo más allá de 3 meses.

6. Tinción de inmunofluorescencia

1. Utilice una pipeta de 1.000 μL para recuperar suavemente el organoide del medio y colóquelo suavemente en un portaobjetos de microscopio con un medio mínimo.
2. Deje que se seque completamente al aire en RT. Agregue un 4% de paraformaldehído (PFA) (300 μL por muestra) durante 30 min.
   NOTA: El PFA es peligroso y puede tener propiedades cancerígenas. Manéjelo con precaución, absténgase del contacto directo con la piel y los ojos, y asegúrese de usarlo dentro de una campana de gases químicos.
3. Añadir solución de sacarosa al 30% (300 μL por muestra) a los portaobjetos y dejarlos incubar durante la noche a 4 °C.
4. Bloquear e impregnar los organoides añadiendo tampón de bloqueo (BB) (300 μL por muestra), que incluye PBS (con Ca²⁺/Mg²⁺), Triton X-100 al 0,3% y suero de cabra normal al 10%, durante 2 h a RT (o toda la noche a 4 °C). Use un bolígrafo de barrera hidrofóbica para delinear los organoides y confinar el tampón en el portaobjetos.
5. Cubrir las muestras con un volumen adecuado de anticuerpo primario en tampón de bloqueo (300 μL por muestra), proteína G1 (FOXG1, 1:200), homeobox 2 (OTX2, 1:100), caja A2 (FOXA2, 1:100), anti-tirosina hidroxilasa (TH, 1:100), anti-SRY (región Y determinante del sexo) caja 2 (SOX2, 1:100), proteína anti-caja apareada (PAX6, 1:100) y proteína 2 asociada a antimicrotúbulos (MAP2 1:500), e incubar durante la noche a 4 °C en la oscuridad (ver Tabla de Materiales).
6. Lave las muestras en 1x PBS durante 3 h con dos o tres cambios de tampón en una plataforma que se balancee suavemente.
7. Incubar con el anticuerpo secundario (300 μL por muestra), anti-Alexa Fluor 488 (1:800), anti-Alexa Fluor 594 (1:800) y anti-Alexa Fluor 647 (1:800) durante la noche a 4 °C en un cuarto oscuro humidificado. Añada simultáneamente la tinción nuclear Hoechst 33342 (1:5.000) (véase la tabla de materiales).
8. Retire el anticuerpo, enjuague rápidamente con PBS y, posteriormente, agregue PBS que contenga azida sódica al 0,01% durante 1-2 días a 4 °C para inhibir la contaminación.
9. Aspire el PBS, elimine el exceso de solución y monte los organoides utilizando un medio de montaje (consulte la Tabla de materiales). Coloque un cubreobjetos, asegurándose de evitar la formación de burbujas de aire, y guárdelo en una habitación oscura a RT durante al menos 12 h para permitir que el medio de montaje se polymere completamente.
   NOTA: El espécimen ya está listo para ser observado con un microscopio de fluorescencia.

Resultados

En este estudio, presentamos un protocolo pionero para la derivación de MOs a partir de iPSCs. Un elemento central de nuestra metodología es el uso innovador de la inhibición dual de SMAD, combinada sinérgicamente con FGF-8b y el agonista de la vía del erizo sónico (SHH) purmorfamina (PM). Este enfoque se muestra en la Figura 1. El proceso de diferenciación comienza dirigiendo las iPSC hacia el linaje del neuroectodermo, formando colonias de rosetas n...

Discusión

En esta investigación, hemos desarrollado una metodología para la diferenciación de MO de iPSCs. Nuestro protocolo emplea una estrategia de inhibición de SMAD dual mejorada con factores morfogénicos, incluyendo FGF-8b y el agonista SHH PM. Este enfoque simula de cerca las señales de desarrollo cruciales para la ontogenia del mesencéfalo. La vía de diferenciación que hemos instituido provoca la formación de estructuras neuroepiteliales que recuerdan a las rosetas neuronales obse...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
CCD Microscope Camera Leica DFC3000 G	Leica Microsystems, Germany
Chemically Defined Lipid Concentrate	Thermo Fisher Scientific	11905031	CDM ingredient
Collagenase  IV	Thermo Fisher Scientific	17104019	Reagent for gentle dissociation of human iPSCs
Corning non-treated culture dishes	Sigma-Aldrich	CLS430589	Suspension culture
DMEM/F-12, GlutaMAX supplement	Thermo Fisher Scientific	10565018	Astrocyte differentiation basal Medium
DPBS	Thermo Fisher Scientific	14190250	Used for a variety of cell culture wash
EDTA	Thermo Fisher Scientific	15575020	Reagent for gentle dissociation of human iPSCs
Essential 8 Basal Medium	Thermo Fisher Scientific	A1516901	Basal medium for iPSC culture
Essential 8 Supplement (50x)	Thermo Fisher Scientific	A1517101	Supplement for iPSC culture
FCCP	Abcam	ab120081	Eliminates mitochondrial membrane potential and TMRE staining
FGF-basic	PeproTech	100-18B	Astrocyte differentiation medium ingredient
Fluid aspiration system BVC control	Vacuubrand, Germany
Formaldehyde (PFA) 16%	Thermo Fisher Scientific	28908	Cell fixation
GDNF	Peprotech	450-10	DA neurons medium ingredient
Geltrex (Basement membrane matrix)	Thermo Fisher Scientific	A1413302	Used for attachment and maintenance of human iPSCs
GlutaMAX Supplement	Thermo Fisher Scientific	35050061	Supplement for NSC culture
Heracell 150i CO2 Incubators	Fisher Scientific, USA
IMDM	Thermo Fisher Scientific	21980032	Basal medium for CDM
InSolution AMPK Inhibitor	Sigma-Aldrich	171261	Neural induction medium ingredient
Insulin	Roche	1376497	CDM ingredient
iPSCs derived from Detroit 551 fibroblats	ATCC	CCL-110
Leica TCS SP8 STED confocal microscope	Leica Microsystems, Germany
Matrigel	Life Science	354230	Matrigel embedding
Monothioglycerol	Sigma-Aldrich	M6145	CDM ingredient
Normal goat serum	Thermo Fisher Scientific	PCN5000	Used for blocking buffer
Orbital shakers - SSM1	Stuart Equipment, UK
Organoid Embedding Sheet	STEMCELL Technologies	8579	Matrigel embedding
Organoid Embedding Sheet	STEMCELL Technologies	8579
PBS 1x	Thermo Fisher Scientific	18912014	Used for a variety of washes
Poly-D-lysine hydrobromide	Sigma-Aldrich	P7405	Promotes attachment and growth of neural cells in vitro
Poly-L-ornithine solution	Sigma-Aldrich	P4957	Promotes attachment and growth of neural cells in vitro
ProLong Gold Antifade Mountant	Thermo Fisher Scientific	P36930	Mounting the coverslip for confocal image
Purmorphamine	STEMCELL Technologies	72204	Promotes DA neuron differentiation
Recombinant Human/Mouse FGF-8b Protein	R&D Systems	423-F8-025/CF	Promotes DA neuron differentiation
SB 431542	Tocris Bioscience	TB1614-GMP	Neural Induction Medium ingredient
TRITON X-100	VWR International	9002-93-1	Used for cells permeabilization in immunostaining assays
SSM1 compact orbital shaker	Norrscope	51901-10 SSM1 Shaker, orbital, mini 230V	Rotator for organoid culturing.
Water Bath Jb Academy Basic Jba5 JBA5 Grant Instruments	Grant Instruments, USA
Antibodies used for immunostaining
Primary antibody
anti-DAT	Abcam	ab128848, RRID:AB_2665470	Rabbit; 1:100
anti-FOXA2	ProteinTech	22474-1-AP, RRID:AB_2879110	Rabbit; 1:100
anti-FOXG1	Abcam	ab196868, RRID:AB_2892604	Rabbit; 1:200
anti-LMX1	Abcam	ab139726, RRID:AB_2827684	Rabbit; 1:100
anti-MAP2	Abcam	ab5392 ,RRID:AB_2138153	Chicken; 1:500
anti-OTX2	ProteinTech	13497-1-AP, RRID:AB_2157176	Rabbit; 1:100
anti-TH	Abcam	ab75875, RRID:AB_1310786	Rabbit; 1:100
Secondary antibody			Dilution (μL)
Alexa Fluor  594 goat anti-rabbit IgG	Thermo Fisher Scientific	A-11012	1:400
Alexa Fluor  488 goat anti-rabbit IgG	Thermo Fisher Scientific	A- 11008	1:400
Alexa Fluor  488 goat anti-rabbit IgG	Thermo Fisher Scientific	A- 11008	1:400
Alexa Fluor  488 goat anti-rabbit IgG	Thermo Fisher Scientific	A- 11008	1:400
Alexa Fluor  594 goat anti-rabbit IgG	Thermo Fisher Scientific	A-11012	1:400
Alexa Fluor  594 goat anti-rabbit IgG	Thermo Fisher Scientific	A-11012	1:400
Alexa Fluor  647 goat anti-chicken IgG	Thermo Fisher Scientific	A-21469	1:400