Generazione di organoidi 3D del mesencefalo da cellule staminali pluripotenti indotte dall'uomo

Riepilogo

Questo protocollo descrive un nuovo metodo per la creazione di organoidi 3D del mesencefalo da cellule staminali pluripotenti indotte umane, guidando la loro formazione per imitare il tessuto mesencefalico nativo, aiutando così nello studio dello sviluppo e dei disturbi.

Abstract

Lo sviluppo di organoidi mesencefalici (MO) a partire da cellule staminali pluripotenti umane (hPSC) rappresenta un progresso significativo nella comprensione dello sviluppo cerebrale, facilitando la modellazione precisa della malattia e facendo progredire la ricerca terapeutica. Questo protocollo delinea un metodo per generare organoidi specifici per il mesencefalo utilizzando cellule staminali pluripotenti indotte (iPSC), impiegando un approccio strategico di differenziazione. Le tecniche chiave includono l'inibizione dual-SMAD per sopprimere la segnalazione SMAD, la somministrazione del fattore di crescita dei fibroblasti 8b (FGF-8b) e l'attivazione della via Sonic Hedgehog utilizzando l'agonista purmorfemina, guidando le iPSC verso un destino mesencefalico.

Gli organoidi prodotti con questo metodo raggiungono diametri fino a 2 mm e incorporano una vasta gamma di tipi di cellule neuroepiteliali, che riflettono la diversità cellulare intrinseca del mesencefalo. La convalida di questi organoidi come autentiche strutture mesencefaliche comporta l'espressione di marcatori specifici del mesencefalo, confermando la loro identità. Un risultato notevole di questa metodologia è l'efficace differenziazione delle iPSC in neuroni dopaminergici, che sono caratteristici del mesencefalo.

L'importanza di questo protocollo risiede nella sua capacità di produrre organoidi specifici per il mesencefalo funzionalmente maturi che replicano da vicino gli aspetti essenziali del mesencefalo, offrendo un modello prezioso per l'esplorazione approfondita dei processi di sviluppo del mesencefalo e della fisiopatologia di disturbi correlati come il morbo di Parkinson. Pertanto, questo protocollo funge da risorsa cruciale per i ricercatori che cercano di migliorare la nostra comprensione del cervello umano e sviluppare nuovi trattamenti per le malattie neurodegenerative, rendendolo uno strumento indispensabile nel campo della ricerca neurologica.

Introduzione

Il cervello umano, con la sua intricata architettura e la complessa composizione cellulare e molecolare, presenta sfide formidabili nella ricerca neuroscientifica, in particolare nel contesto della modellazione delle malattie e dello sviluppo della terapia cellulare¹. Queste sfide sono ulteriormente complicate dalla limitata disponibilità di sofisticati modelli in vitro che rappresentano veramente la complessità del cervello umano. Tuttavia, i recenti progressi nella tecnologia delle cellule staminali pluripotenti indotte umane (iPSC), che consentono la differenziazione controllata in specifici sottotipi neuronali, hanno aperto strade promettenti per esplorare lo sviluppo del cervello umano, la patogenesi delle malattie e le strategie terapeutiche basate sulle cellule.

Tradizionalmente, le colture neuronali bidimensionali (2D) derivate da iPSC sono state la pietra angolare degli studi in vitro volti a imitare la fisiologia e la patologia neuronale umana. Queste colture monostrato sono state determinanti per migliorare la nostra comprensione delle malattie neurologiche e per la scoperta di agenti neuroprotettivi 2,3,4,5,6,7. Nonostante la loro utilità, questi sistemi 2D non riescono a emulare la vera diversità cellulare e la struttura tridimensionale (3D) del cervello umano.

L'avvento della tecnologia degli organoidi cerebrali rappresenta un salto significativo nella modellazione in vitro, fornendo uno strumento che imita da vicino l'intricata biologia del cervello umano all'interno di un quadro fisiologicamente rilevante⁸. Le prime tecniche nello sviluppo degli organoidi cerebrali hanno sfruttato le proprietà regolatorie intrinseche delle iPSC per formare spontaneamente derivati dell'ectoderma, imitando così le prime fasi dello sviluppo cerebrale 5,9,10,11,12. Date le complesse reti formate dai neuroni con altre cellule neuronali e non, la modellazione 3D diventa essenziale per studiare accuratamente le malattie neurodegenerative. Le colture 3D forniscono un ambiente in vivo più rappresentativo, facilitando la differenziazione neuronale accelerata e la formazione di reti 12,13,14 e promuovendo un'espressione più ampia dei geni neuronali rispetto alle colture 2D¹⁵. I neuroni sviluppati in contesti 3D raggiungono morfologie e attributi fisiologici che ricordano maggiormente le loro controparti in vivo ¹⁶.

I recenti progressi nei modelli cerebrali 3D sono stati fondamentali per catturare in modo più efficace la complessità spaziale e funzionale del cervello umano. Nell'ultimo decennio, l'avanzamento di diversi protocolli per la generazione sia di organoidi cerebrali interi che di modelli cerebrali specifici per regione 11,17,18,19,20,21,22^, si è dimostrato prezioso nella modellazione di disturbi neurologici come la microcefalia¹¹, il morbo di Alzheimer^14,23 e il morbo di Parkinson²⁴. L'obiettivo di questo protocollo è quello di sviluppare e perfezionare un metodo per la creazione di MO umani 3D derivati da iPSC umane. Questo protocollo è specificamente finalizzato alla generazione di organoidi arricchiti con neuroni dopaminergici e organizzati spazialmente in modo da imitare da vicino la struttura naturale e la funzionalità del mesencefalo umano. Lo scopo principale di questi organoidi è quello di fungere da modelli avanzati in vitro per lo studio della malattia di Parkinson, fornendo un sistema più accurato e fisiologicamente rilevante per esplorare i processi di sviluppo neurologico e le patologie associate a questa condizione. Sfruttando le iPSC derivate da pazienti per generare questi organoidi specifici del mesencefalo, il protocollo cerca di migliorare la comprensione dei meccanismi della malattia di Parkinson, facilitare la scoperta di potenziali bersagli terapeutici e migliorare lo sviluppo di terapie cellulari. Attraverso questo approccio innovativo, il protocollo mira a superare i limiti delle tradizionali colture neuronali 2D e a contribuire in modo significativo al campo della ricerca sulle malattie neurodegenerative, offrendo un potente strumento per la modellazione in vitro delle malattie e l'esplorazione di nuove strategie di trattamento.

Negli ultimi 10 anni, vari gruppi di ricerca hanno sviluppato organoidi mesencefalici (MO)8,21,25,26,27,28, utilizzando metodologie che mostrano diverse somiglianze chiave. Nella nostra ricerca per approfondire la comprensione della malattia di Parkinson, abbiamo sviluppato un protocollo per la creazione di MO umani 3D derivati da iPSC umane. Questi organoidi, arricchiti con neuroni dopaminergici disposti spazialmente, rappresentano un modello ideale per lo studio della malattia di Parkinson. Il nostro sviluppo e perfezionamento di protocolli di organoidi specifici per il mesencefalo ha prodotto modelli in vitro avanzati che hanno contribuito in modo significativo alla nostra comprensione dei processi di sviluppo neurologico e delle malattie neurodegenerative. Questi modelli, in particolare se applicati a MO derivati da pazienti, hanno dimostrato la loro efficacia come potenti strumenti per la modellazione in vitro delle malattie, offrendo nuove prospettive e metodologie nel campo della coltura cellulare 3D avanzata.

Protocollo

Le iPSC generate dai fibroblasti umani normali Detroit 551 e dalle cellule staminali embrionali umane (ESC) hESC linea 360 come precedentemente descritto⁴. Le iPSC sono state ottenute con l'approvazione del Comitato per la ricerca etica sulla salute della Norvegia occidentale REK nr. 2012/919. Tutte le cellule sono state regolarmente monitorate per la contaminazione da micoplasma utilizzando il kit di rilevamento del micoplasma MycoAlert. La Tabella dei materiali contiene informazioni su tutti i materiali, i reagenti e le attrezzature utilizzate in questo protocollo. La tabella 1 descrive i supporti e gli altri supporti utilizzati.

1. Scongelamento delle iPSC

1. Piastra rivestita a matrice e preparazione del terreno essenziale 8 (E8)
   1. Scongelare la fiala della matrice della membrana basale con ghiaccio durante la notte. Diluire 1:100 a freddo Advanced Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)/Ham's F12 DMEM/F12 (concentrazione finale 1%) (vedi Tabella dei materiali e Tabella 1). Conservare le aliquote a -20 °C per un uso prolungato.
   2. Scongelare la membrana basale diluita a 4 °C; rivestire una piastra a 6 pozzetti con 1 mL di soluzione per pozzetto. Incubare a 37 °C per 1 ora.
   3. Rimuovere la piastra dall'incubatrice e lasciarla equilibrare a temperatura ambiente (RT).
      NOTA: I piatti possono essere refrigerati per un massimo di 2 settimane (assicurarsi che si riscaldino a RT prima dell'uso). Per una conservazione prolungata, aggiungere 1 mL di E8 Medium (vedere Tabella dei materiali e Tabella 1) alla piastra rivestita per evitare che il gel si secchi.
2. E8 preparazione media
   1. In un ambiente sterile, combinare il terreno basale E8 con l'integratore E8 (vedi Tabella dei materiali e Tabella 1).
      NOTA: Può essere conservato a 4 °C per 2 settimane. Scongelare l'integratore di E8 congelato per una notte a 4 °C prima di preparare il terreno completo. Non scongelare a 37 °C, poiché ciò potrebbe comprometterne la stabilità. Prima dell'uso, riscaldare solo il volume richiesto di E8 Medium a temperatura ambiente (RT) fino a quando non è più freddo al tatto.

2. Inseminazione di iPSC

1. Preriscaldare le piastre rivestite a matrice e l'E8 Medium a RT o incubatore a 37 °C.
2. Aspirare il terreno di coltura; sciacquare le iPSC, che sono al 60%-70% di confluenza, con soluzione salina tamponata con fosfato di Dulbecco senza calcio e magnesio (DPBS Ca²⁺/Mg²⁺-free, 4 mL per pozzetto in una piastra a 6 pozzetti).
3. Aggiungere acido etilendiamminotetraacetico (EDTA, 0,5 mM, 1 mL per pozzetto, vedere Tabella dei materiali e Tabella 1); incubare a 37 °C fino a quando i bordi della colonia non si staccano (3-5 min).
4. Aspirare la soluzione di dissociazione; per staccare le colonie, pipettare con cura il terreno E8 preriscaldato (4 ml per pozzetto) direttamente sulle colonie con una forza più forte del solito dalla pipetta, che genera un movimento del fluido localizzato sulla superficie cellulare.
5. Dividere le cellule in un rapporto 1:2 trasferendole in due nuovi pozzetti di una piastra a 6 pozzetti rivestita di matrice, aggiungendo 2 mL di terreno per pozzetto. Quindi, incubare a 37 °C.
6. Scambia il supporto ogni giorno fino a quando le colonie raggiungono l'80% di confluenza.
7. Utilizzando un microscopio con ingrandimento 10x, osservare le colonie per assicurarsi che siano di dimensioni adeguate, tipicamente caratterizzate da una forma distinta e rotonda con un diametro compreso tra 0,5 e 1 mm. Conferma che le colonie sono strutture dense e compatte con bordi delineati e lisci.

3. Induzione neurale

1. Preparazione media e configurazione del giorno 0
   1. Preparare 500 ml ciascuno di terreno chimicamente definito (CDM), terreno di induzione neurale (NIM) e terreno privo di siero di cellule staminali neurali (NSC SF), facendo riferimento alla Tabella dei materiali e alla Tabella 1.
   2. Sciacquare le cellule in una piastra a 6 pozzetti con 4 mL di DPBS (1x) (Ca²⁺/Mg²⁺- free) per pozzetto, seguito dall'aggiunta di 3 mL di NIM per pozzetto per la configurazione del Giorno 0.
   3. Sostituire NIM (3 mL per pozzetto) nei giorni 1, 3 e 5; Osservare quotidianamente al microscopio.
   4. Il giorno 6, staccare le rosette neurali in una coltura di sospensione utilizzando i seguenti passaggi.
      1. Lavare delicatamente una volta con DPBS (1x) (Ca²⁺/Mg²⁺-free) (4 mL per pozzetto in una piastra a 6 pozzetti). Aggiungere la collagenasi IV (1 mL per pozzetto in una piastra a 6 pozzetti) e incubare per 1 minuto. Rimuovere la collagenasi EV e risciacquare delicatamente una volta con DPBS (1x) (Ca²⁺/Mg²⁺-free) (4 mL per pozzetto in una piastra a 6 pozzetti).
      2. Aggiungere 2 mL di NSC SF Medium a ciascun pozzetto di una piastra a 6 pozzetti. Staccare le cellule raschiando il fondo dei pozzetti, creando delle griglie con un puntale per pipetta da 200 μl.
      3. Trasferire la sospensione cellulare dalla piastra a 6 pozzetti in una piastra non aderente da 10 cm. Regolare il volume a 12 ml con NSC SF Medium.
      4. Posizionare la piastra non aderente sull'agitatore (agitatore orbitale compatto ssm1) a 85 giri/min con angolo di 0° in un'incubatrice impostata a 37 °C con il 5% di CO₂ per evitare l'aggregazione.

4. Pattern del mesencefalo

1. Il giorno 7, aggiungere 12 mL di CDM con 100 ng/mL di FGF-8b; Posizionare sull'incubatore dell'agitatore orbitale.
2. Nei giorni 8-13, cambiare il mezzo ogni 2 giorni; Osservare quotidianamente al microscopio.
3. Il giorno 14, aggiungere 12 mL di CDM con 100 ng/mL di FGF-8b e 1 μM di purmorfemina (PM); Posizionare sull'agitatore orbitale.
4. Nei giorni 15-20, cambiare il mezzo ogni 2 giorni; Osservare quotidianamente al microscopio.

5. Inclusione del Matrigel e terminazione e maturazione del MO

1. Scongelare Matrigel con ghiaccio a una temperatura compresa tra 2 °C e 8 °C per una durata di 1-2 ore.
   NOTA: Scongelare una quantità adeguata di Matrigel per fornire 15 μL per ogni corpo embrioide (EB). Conservare Matrigel in frigorifero con ghiaccio per evitare una polimerizzazione precoce. Raffreddare tutti i materiali plastici che verranno a contatto con Matrigel a -20 °C per un minimo di 30 minuti prima dell'utilizzo.
2. Metti un foglio sterile per incorporare un organoide in un piatto vuoto.
3. Utilizzando un puntale per pipetta da 200 μL a foro largo, estrarre delicatamente l'organoide dal piatto e trasferirlo sulla superficie di inclusione con un organoide per pozzetto. Ripetere questo processo fino a quando non vengono raccolti 12-16 EB sulla superficie di inclusione.
4. Rimuovere con cautela il terreno in eccesso da ciascun EB e quindi aggiungere 15 μL di Matrigel freddo goccia a goccia su ciascun EB. Con l'aiuto di una pipetta, riposizionare l'EB al centro della gocciolina Matrigel.
5. Incubare la piastra in un'incubatrice a 37 °C per 15-20 minuti per consentire la polimerizzazione del Matrigel.
6. Utilizzando una pinza sterile, sollevare il foglio di inclusione con le goccioline Matrigel. Tenere il foglio direttamente sopra un pozzetto in una piastra a 6 pozzetti a bassissimo aderenza. Pipettare 3 mL di CDM con 10 ng/mL di Brain-Derived Neurotrophic Factor (BDNF) e 10 ng/mL di Glial Cell-Derived Neurotrophic Factor (GDNF) e sciacquare delicatamente le goccioline di Matrigel dal foglio in ciascun pozzetto. Ripetere questo processo fino a quando tutte le 6-8 goccioline di Matrigel sono state trasferite in un pozzetto.
7. Posizionare le piastre su un agitatore orbitale in un'incubatrice a 37 °C a 85 giri/min e sostituire il CDM con 10 ng/mL di BDNF e 10 ng/mL di GDNF ogni 3 giorni.
   NOTA: Mantenere le colture differenzianti per un massimo di 3 mesi; La morfologia neurale compare dopo 2 settimane dall'interruzione. BDNF e GDNF non sono necessari per la coltura oltre i 3 mesi.

6. Colorazione in immunofluorescenza

1. Utilizzare una pipetta da 1.000 μl per recuperare delicatamente l'organoide dal terreno e posizionarlo delicatamente su un vetrino da microscopio con una quantità minima di terreno.
2. Lasciarlo asciugare completamente all'aria a RT. Aggiungere il 4% di paraformaldeide (PFA) (300 μl per campione) per 30 minuti.
   NOTA: Il PFA è pericoloso e può avere proprietà cancerogene. Maneggiarlo con precauzione, astenersi dal contatto diretto con la pelle e gli occhi e assicurarsi che l'utilizzo sia all'interno di una cappa chimica.
3. Aggiungere una soluzione di saccarosio al 30% (300 μl per campione) ai vetrini e lasciarli incubare per una notte a 4 °C.
4. Bloccare e permeare gli organoidi aggiungendo un tampone bloccante (BB) (300 μL per campione), che include PBS (con Ca²⁺/Mg²⁺), Triton X-100 0,3% e siero di capra normale al 10%, per 2 ore a RT (o durante la notte a 4 °C). Utilizzare una penna barriera idrofobica per delineare gli organoidi e confinare il tampone sul vetrino.
5. Coprire i campioni con un volume adeguato di anticorpi primari nel tampone bloccante (300 μL per campione), la proteina scatola anti-forchetta G1 (FOXG1, 1:200), l'omeobox 2 anti-ortodenticolo (OTX2, 1:100), la scatola A2 anti-forchetta (FOXA2, 1:100), l'anti-tirosina idrossilasi (TH, 1:100), la scatola 2 anti-SRY (regione che determina il sesso Y) (SOX2, 1:100), la proteina box anti-accoppiata (PAX6, 1:100) e la proteina associata 2 anti-microtubuli (MAP2 1:500), e incubare per una notte a 4 °C al buio (vedi Tabella dei materiali).
6. Lavare i campioni in 1x PBS per 3 ore con due o tre cambi di tampone su una piattaforma che oscilla delicatamente.
7. Incubare con l'anticorpo secondario (300 μl per campione), l'anti-Alexa Fluor 488 (1:800), l'anti-Alexa Fluor 594 (1:800) e l'anti-Alexa Fluor 647 (1:800) per una notte a 4 °C in una camera oscura umidificata. Aggiungere contemporaneamente la colorazione nucleare Hoechst 33342 (1:5.000) (vedi Tabella dei materiali).
8. Rimuovere l'anticorpo, sciacquare rapidamente con PBS e successivamente aggiungere PBS contenente azoturo di sodio allo 0,01% per 1-2 giorni a 4 °C per inibire la contaminazione.
9. Aspirare il PBS, rimuovere la soluzione in eccesso e montare gli organoidi utilizzando un mezzo di montaggio (fare riferimento alla Tabella dei materiali). Posizionare un vetrino coprioggetti, assicurandosi di evitare la formazione di bolle d'aria, e conservare in una stanza buia a RT per almeno 12 ore per consentire al mezzo di montaggio di polimerizzare completamente.
   NOTA: Il campione è ora pronto per l'osservazione con un microscopio a fluorescenza.

Risultati

In questo studio, introduciamo un protocollo pionieristico per la derivazione di MO da iPSC. Al centro della nostra metodologia c'è l'uso innovativo dell'inibizione dual-SMAD, combinata sinergicamente con FGF-8b e l'agonista della via del sonic hedgehog (SHH) purmorfemina (PM). Questo approccio è illustrato nella Figura 1. Il processo di differenziazione inizia guidando le iPSC verso la linea del neuroectoderma, formando colonie di rosetta neuroepiteliale ...

Discussione

In questa indagine, abbiamo sviluppato una metodologia per la differenziazione dei MO dalle iPSC. Il nostro protocollo impiega una strategia di inibizione dual-SMAD potenziata con fattori morfogenici, tra cui FGF-8b e l'agonista SHH PM. Questo approccio simula da vicino i segnali di sviluppo cruciali per l'ontogenesi del mesencefalo. Il percorso di differenziazione che abbiamo istituito stimola la formazione di strutture neuroepiteliali che ricordano le rosette neurali osservate durante ...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
CCD Microscope Camera Leica DFC3000 G	Leica Microsystems, Germany
Chemically Defined Lipid Concentrate	Thermo Fisher Scientific	11905031	CDM ingredient
Collagenase  IV	Thermo Fisher Scientific	17104019	Reagent for gentle dissociation of human iPSCs
Corning non-treated culture dishes	Sigma-Aldrich	CLS430589	Suspension culture
DMEM/F-12, GlutaMAX supplement	Thermo Fisher Scientific	10565018	Astrocyte differentiation basal Medium
DPBS	Thermo Fisher Scientific	14190250	Used for a variety of cell culture wash
EDTA	Thermo Fisher Scientific	15575020	Reagent for gentle dissociation of human iPSCs
Essential 8 Basal Medium	Thermo Fisher Scientific	A1516901	Basal medium for iPSC culture
Essential 8 Supplement (50x)	Thermo Fisher Scientific	A1517101	Supplement for iPSC culture
FCCP	Abcam	ab120081	Eliminates mitochondrial membrane potential and TMRE staining
FGF-basic	PeproTech	100-18B	Astrocyte differentiation medium ingredient
Fluid aspiration system BVC control	Vacuubrand, Germany
Formaldehyde (PFA) 16%	Thermo Fisher Scientific	28908	Cell fixation
GDNF	Peprotech	450-10	DA neurons medium ingredient
Geltrex (Basement membrane matrix)	Thermo Fisher Scientific	A1413302	Used for attachment and maintenance of human iPSCs
GlutaMAX Supplement	Thermo Fisher Scientific	35050061	Supplement for NSC culture
Heracell 150i CO2 Incubators	Fisher Scientific, USA
IMDM	Thermo Fisher Scientific	21980032	Basal medium for CDM
InSolution AMPK Inhibitor	Sigma-Aldrich	171261	Neural induction medium ingredient
Insulin	Roche	1376497	CDM ingredient
iPSCs derived from Detroit 551 fibroblats	ATCC	CCL-110
Leica TCS SP8 STED confocal microscope	Leica Microsystems, Germany
Matrigel	Life Science	354230	Matrigel embedding
Monothioglycerol	Sigma-Aldrich	M6145	CDM ingredient
Normal goat serum	Thermo Fisher Scientific	PCN5000	Used for blocking buffer
Orbital shakers - SSM1	Stuart Equipment, UK
Organoid Embedding Sheet	STEMCELL Technologies	8579	Matrigel embedding
Organoid Embedding Sheet	STEMCELL Technologies	8579
PBS 1x	Thermo Fisher Scientific	18912014	Used for a variety of washes
Poly-D-lysine hydrobromide	Sigma-Aldrich	P7405	Promotes attachment and growth of neural cells in vitro
Poly-L-ornithine solution	Sigma-Aldrich	P4957	Promotes attachment and growth of neural cells in vitro
ProLong Gold Antifade Mountant	Thermo Fisher Scientific	P36930	Mounting the coverslip for confocal image
Purmorphamine	STEMCELL Technologies	72204	Promotes DA neuron differentiation
Recombinant Human/Mouse FGF-8b Protein	R&D Systems	423-F8-025/CF	Promotes DA neuron differentiation
SB 431542	Tocris Bioscience	TB1614-GMP	Neural Induction Medium ingredient
TRITON X-100	VWR International	9002-93-1	Used for cells permeabilization in immunostaining assays
SSM1 compact orbital shaker	Norrscope	51901-10 SSM1 Shaker, orbital, mini 230V	Rotator for organoid culturing.
Water Bath Jb Academy Basic Jba5 JBA5 Grant Instruments	Grant Instruments, USA
Antibodies used for immunostaining
Primary antibody
anti-DAT	Abcam	ab128848, RRID:AB_2665470	Rabbit; 1:100
anti-FOXA2	ProteinTech	22474-1-AP, RRID:AB_2879110	Rabbit; 1:100
anti-FOXG1	Abcam	ab196868, RRID:AB_2892604	Rabbit; 1:200
anti-LMX1	Abcam	ab139726, RRID:AB_2827684	Rabbit; 1:100
anti-MAP2	Abcam	ab5392 ,RRID:AB_2138153	Chicken; 1:500
anti-OTX2	ProteinTech	13497-1-AP, RRID:AB_2157176	Rabbit; 1:100
anti-TH	Abcam	ab75875, RRID:AB_1310786	Rabbit; 1:100
Secondary antibody			Dilution (μL)
Alexa Fluor  594 goat anti-rabbit IgG	Thermo Fisher Scientific	A-11012	1:400
Alexa Fluor  488 goat anti-rabbit IgG	Thermo Fisher Scientific	A- 11008	1:400
Alexa Fluor  488 goat anti-rabbit IgG	Thermo Fisher Scientific	A- 11008	1:400
Alexa Fluor  488 goat anti-rabbit IgG	Thermo Fisher Scientific	A- 11008	1:400
Alexa Fluor  594 goat anti-rabbit IgG	Thermo Fisher Scientific	A-11012	1:400
Alexa Fluor  594 goat anti-rabbit IgG	Thermo Fisher Scientific	A-11012	1:400
Alexa Fluor  647 goat anti-chicken IgG	Thermo Fisher Scientific	A-21469	1:400