Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Bu protokol, insan kaynaklı pluripotent kök hücrelerden 3D orta beyin organoidleri oluşturmak için yeni bir yöntemi tanımlar, doğal orta beyin dokusunu taklit etmek için oluşumlarına rehberlik eder, böylece gelişim ve bozuklukların incelenmesine yardımcı olur.

Özet

İnsan pluripotent kök hücrelerinden (hPSC'ler) orta beyin organoidlerinin (MO'lar) geliştirilmesi, beyin gelişimini anlamada, kesin hastalık modellemesini kolaylaştırmada ve terapötik araştırmaları ilerletmede önemli bir ilerlemeyi temsil etmektedir. Bu protokol, stratejik bir farklılaşma yaklaşımı kullanarak, indüklenmiş pluripotent kök hücreleri (iPSC'ler) kullanarak orta beyne özgü organoidler üretmek için bir yöntemi ana hatlarıyla belirtir. Anahtar teknikler arasında SMAD sinyalini baskılamak için çift SMAD inhibisyonu, fibroblast büyüme faktörü 8b'nin (FGF-8b) uygulanması ve agonist purmorfamin kullanılarak Sonic Hedgehog yolunun aktivasyonu yer alır ve iPSC'leri orta beyin kaderine doğru yönlendirir.

Bu yöntemle üretilen organoidler, 2 mm'ye kadar çaplara ulaşır ve orta beynin doğal hücresel çeşitliliğini yansıtan çok çeşitli nöroepitelyal hücre tiplerini içerir. Bu organoidlerin otantik orta beyin yapıları olarak doğrulanması, kimliklerini doğrulayan orta beyne özgü belirteçlerin ekspresyonunu içerir. Bu metodolojinin dikkate değer bir sonucu, iPSC'lerin orta beynin karakteristiği olan dopaminerjik nöronlara etkili bir şekilde farklılaşmasıdır.

Bu protokolün önemi, orta beynin temel yönlerini yakından kopyalayan, orta beyin gelişim süreçlerinin ve Parkinson hastalığı gibi ilgili bozuklukların patofizyolojisinin derinlemesine araştırılması için değerli bir model sunan, işlevsel olarak olgunlaşmış, orta beyne özgü organoidler üretme yeteneğinde yatmaktadır. Bu nedenle, bu protokol, insan beyni hakkındaki anlayışımızı geliştirmek ve nörodejeneratif hastalıklar için yeni tedaviler geliştirmek isteyen araştırmacılar için çok önemli bir kaynak görevi görür ve bu da onu nörolojik araştırma alanında vazgeçilmez bir araç haline getirir.

Giriş

Karmaşık mimarisi ve karmaşık hücresel ve moleküler bileşimi ile insan beyni, özellikle hastalık modellemesi ve hücresel tedavi geliştirme bağlamında, sinirbilim araştırmalarında zorlu zorluklar ortaya koymaktadır1. Bu zorluklar, insan beyninin karmaşıklığını gerçekten temsil eden sofistike in vitro modellerin sınırlı mevcudiyeti ile daha da karmaşık hale geliyor. Bununla birlikte, insan kaynaklı pluripotent kök hücre (iPSC) teknolojisindeki son gelişmeler, belirli nöronal alt tiplere kontrollü farklılaşmayı mümkün kılarak, insan beyninin gelişimini, hastalık patogenezini ve hücre bazlı terapötik stratejileri keşfetmek için umut verici yollar açmıştır.

Geleneksel olarak, iPSC'lerden türetilen iki boyutlu (2D) nöronal kültürler, insan nöronal fizyolojisini ve patolojisini taklit etmeyi amaçlayan in vitro çalışmaların temel taşı olmuştur. Bu tek katmanlı kültürler, nörolojik hastalıklar hakkındaki anlayışımızı geliştirmede ve nöroprotektif ajanlarınkeşfinde etkili olmuştur 2,3,4,5,6,7. Faydalarına rağmen, bu 2D sistemler, insan beyninin gerçek hücresel çeşitliliğini ve üç boyutlu (3D) yapısını taklit etmede yetersiz kalmaktadır.

Beyin organoid teknolojisinin ortaya çıkışı, in vitro modellemede önemli bir sıçramayı temsil eder ve insan beyninin karmaşık biyolojisini fizyolojik olarak ilgili bir çerçeve içinde yakından taklit eden bir araç sağlar8. Beyin organoid gelişimindeki erken teknikler, kendiliğinden ektoderm türevleri oluşturmak için iPSC'lerin doğal düzenleyici özelliklerinden yararlandı ve böylece beyin gelişiminin erken aşamalarını taklit etti 5,9,10,11,12. Nöronların diğer nöronal ve nöronal olmayan hücrelerle oluşturduğu karmaşık ağlar göz önüne alındığında, nörodejeneratif hastalıkları doğru bir şekilde incelemek için 3D modelleme gerekli hale gelir. 3D kültürler, hızlandırılmış nöronal farklılaşmayı ve ağ oluşumunukolaylaştırarak daha temsili bir in vivo ortam sağlar 12,13,14 ve 2D kültürlere kıyasla daha geniş bir nöronal gen ekspresyonunu teşvik eder 15. 3 boyutlu bağlamlarda geliştirilen nöronlar, in vivo muadillerini daha çok anımsatan morfolojiler ve fizyolojik özellikler kazanır16.

3D beyin modellerindeki son gelişmeler, insan beyninin uzamsal ve işlevsel karmaşıklığını daha etkili bir şekilde yakalamada çok önemli olmuştur. Son on yılda, hem tüm beyin organoidlerini hem de bölgeye özgü beyin modellerini 11,17,18,19,20,21,22 üretmek için çeşitli protokollerin ilerlemesi, mikrosefali 11, Alzheimer hastalığı 14,23 ve Parkinson hastalığı24 gibi nörolojik bozuklukların modellenmesinde paha biçilmez olduğu kanıtlanmıştır. Bu protokolün amacı, insan iPSC'lerinden türetilen 3B insan MO'ları oluşturmak için bir yöntem geliştirmek ve iyileştirmektir. Bu protokol özellikle dopaminerjik nöronlarla zenginleştirilmiş ve insan orta beyninin doğal yapısını ve işlevselliğini yakından taklit edecek şekilde uzamsal olarak organize edilmiş organoidler üretmeyi amaçlamaktadır. Bu organoidlerin birincil amacı, Parkinson hastalığını incelemek için gelişmiş in vitro modeller olarak hizmet etmek ve bu durumla ilişkili nörogelişimsel süreçleri ve patolojileri keşfetmek için daha doğru ve fizyolojik olarak ilgili bir sistem sağlamaktır. Protokol, bu orta beyne özgü organoidleri üretmek için hastadan türetilmiş iPSC'lerden yararlanarak, Parkinson hastalığı mekanizmalarının anlaşılmasını geliştirmeyi, potansiyel terapötik hedeflerin keşfini kolaylaştırmayı ve hücre bazlı tedavilerin geliştirilmesini iyileştirmeyi amaçlamaktadır. Bu yenilikçi yaklaşım sayesinde protokol, geleneksel 2D nöronal kültürlerin sınırlamalarının üstesinden gelmeyi ve in vitro hastalık modellemesi ve yeni tedavi stratejilerinin araştırılması için güçlü bir araç sunarak nörodejeneratif hastalık araştırmaları alanına önemli ölçüde katkıda bulunmayı amaçlamaktadır.

Son 10 yılda, çeşitli araştırma ekipleri, birkaç önemli benzerlik sergileyen metodolojileri kullanarak orta beyin organoidleri (MO'lar)8,21,25,26,27,28 geliştirdi. Parkinson hastalığının anlaşılmasını derinleştirme arayışımızda, insan iPSC'lerinden türetilen 3D insan MO'ları oluşturmak için bir protokol geliştirdik. Uzamsal olarak düzenlenmiş dopaminerjik nöronlarla zenginleştirilmiş bu organoidler, Parkinson hastalığını incelemek için ideal bir model sunar. Orta beyne özgü organoid protokolleri geliştirmemiz ve iyileştirmemiz, nörogelişimsel süreçleri ve nörodejeneratif hastalıkları anlamamıza önemli ölçüde katkıda bulunan gelişmiş in vitro modeller ortaya çıkarmıştır. Bu modeller, özellikle hastadan türetilen MO'lara uygulandığında, in vitro hastalık modellemesi için güçlü araçlar olarak etkinliklerini göstermiş ve gelişmiş 3D hücre kültürü alanında yeni bakış açıları ve metodolojiler sunmuştur.

Protokol

İnsan normal fibroblastları Detroit 551 ve insan embriyonik kök hücrelerinden (ESC'ler) üretilen iPSC'ler, daha önce tarif edildiği gibi hESC hattı 3604. iPSC'ler, Batı Norveç Etik Sağlık Araştırmaları Komitesi REK nr.'nin onayı ile elde edilmiştir. 2012/919. Tüm hücreler, MycoAlert Mikoplazma Tespit Kiti kullanılarak Mikoplazma kontaminasyonu açısından düzenli olarak izlendi. Malzeme Tablosu, bu protokolde kullanılan tüm malzemeler, reaktifler ve ekipmanlar hakkında bilgi içerir. Tablo 1 , kullanılan ortamı ve diğer stokları açıklamaktadır.

1. iPSC'lerin çözülmesi

  1. Matris kaplı plaka ve temel 8 (E8) orta hazırlama
    1. Bazal membran matris şişesini gece boyunca buz üzerinde çözdürün. 1:100 oranında soğuk Advanced Dulbecco'nun Modifiye Eagle's Medium (DMEM)/Ham's F12 DMEM/F12 (%1 nihai konsantrasyon) ile seyreltin (bkz . Malzeme Tablosu ve Tablo 1). Alikotları uzun süreli kullanım için -20 °C'de saklayın.
    2. Seyreltilmiş bazal membranı 4 °C'de çözdürün; 6 oyuklu bir plakayı oyuk başına 1 mL çözelti ile kaplayın. 37 °C'de 1 saat inkübe edin.
    3. Plakayı inkübatörden çıkarın ve oda sıcaklığına (RT) dengelenmesini bekleyin.
      NOT: Plakalar en fazla 2 hafta buzdolabında saklanabilir (kullanmadan önce RT'ye kadar ısındığından emin olun). Uzun süreli saklama için, jelin kurumasını önlemek için kaplanmış plakaya 1 mL E8 Medium (Malzeme Tablosu ve Tablo 1'e bakınız) ekleyin.
  2. E8 orta hazırlık
    1. Steril bir ortamda, E8 bazal ortamını E8 takviyesi ile birleştirin (bakınız Malzeme Tablosu ve Tablo 1).
      NOT: Bu, 2 hafta boyunca 4 ° C'de saklanabilir. Tam ortamı hazırlamadan önce donmuş E8 takviyesini gece boyunca 4 ° C'de çözdürün. 37 °C'de çözdürmeyin, aksi takdirde stabilitesi bozulabilir. Kullanmadan önce, yalnızca gerekli hacimdeki E8 Medium'u oda sıcaklığına (RT) dokunulamayacak kadar soğuk olana kadar ısıtın.

2. iPSC'lerin tohumlanması

  1. Matris kaplı plakaları ve E8 Medium'u RT'de veya 37 °C'de inkübatörde önceden ısıtın.
  2. Aspirat kültürü besiyeri; %60-70 birleşim noktasında olan iPSC'leri Dulbecco'nun Fosfat Tamponlu Tuzlu Suyu ile kalsiyum ve magnezyum içermez (DPBS Ca2 + / Mg2 + içermez, 6 oyuklu bir plakada oyuk başına 4 mL).
  3. Etilendiamintetraasetik asit ekleyin (EDTA, 0.5 mM, kuyucuk başına 1 mL, Malzeme Tablosu ve Tablo 1'e bakınız); Koloni kenarları ayrılana kadar (3-5 dakika) 37 °C'de inkübe edin.
  4. Ayrışma çözeltisini aspire edin; kolonileri ayırmak için, önceden ısıtılmış E8 Ortamını (oyuk başına 4 mL), pipetten normalden daha güçlü bir kuvvetle doğrudan kolonilerin üzerine dikkatlice pipetleyin, bu da hücre yüzeyi üzerinde lokalize bir sıvı hareketi oluşturur.
  5. Hücreleri, matris kaplı 6 oyuklu bir plakanın iki yeni oyuğuna aktararak 1:2 oranında bölün ve kuyucuk başına 2 mL ortam ekleyin. Daha sonra 37 °C'de inkübe edin.
  6. Koloniler% 80 birleşmeye ulaşana kadar medyayı günlük olarak değiştirin.
  7. 10x büyütmede bir mikroskop kullanarak, tipik olarak 0,5 ila 1 mm arasında değişen bir çapa sahip belirgin, yuvarlak bir şekil ile karakterize edilen uygun bir boyutta olduklarından emin olmak için kolonileri gözlemleyin. Kolonilerin, tanımlanmış, pürüzsüz sınırlara sahip yoğun, kompakt yapılar olduğunu onaylayın.

3. Nöral indüksiyon

  1. Orta hazırlık ve Gün 0 kurulumu
    1. Malzeme Tablosu ve Tablo 1'e atıfta bulunarak Kimyasal Olarak Tanımlanmış Ortam (CDM), Nöral İndüksiyon Ortamı (NIM) ve Nöral Kök Hücre Serumsuz (NSC SF) ortamın her birini 500 mL hazırlayın.
    2. Hücreleri 6 oyuklu bir plakada kuyucuk başına 4 mL DPBS (1x) (Ca2 + / Mg2 + - içermez) ile durulayın, ardından Gün 0 kurulumu için oyuk başına 3 mL NIM ilavesi yapın.
    3. 1, 3 ve 5. günlerde NIM'i (kuyu başına 3 mL) değiştirin; Her gün mikroskop altında gözlemleyin.
    4. 6. Günde, aşağıdaki adımları kullanarak nöral rozetleri bir süspansiyon kültürüne ayırın.
      1. DPBS (1x) (Ca2 + / Mg2 + içermez) (6 oyuklu bir plakada oyuk başına 4 mL) ile bir kez nazikçe yıkayın. Kollajenaz IV (6 oyuklu bir plakada oyuk başına 1 mL) ekleyin ve 1 dakika inkübe edin. Kollajenaz IV'ü çıkarın ve DPBS (1x) (Ca2 + / Mg2 + içermeyen) (6 oyuklu bir plakada oyuk başına 4 mL) ile bir kez nazikçe durulayın.
      2. 6 oyuklu bir plakanın her bir oyuğuna 2 mL NSC SF Medium ekleyin. Kuyu diplerini kazıyarak hücreleri ayırın ve 200 μL pipet ucu ile ızgaralar oluşturun.
      3. Hücre süspansiyonunu 6 oyuklu plakadan 10 cm'lik yapışmayan bir kaba aktarın. NSC SF Medium ile ses seviyesini 12 mL'ye ayarlayın.
      4. Yapışmayan kabı, topaklanmayıönlemek için % 5 CO 2 ile 37 °C'ye ayarlanmış bir inkübatörde 0° açıyla 85 rpm'de çalkalayıcı (ssm1 kompakt orbital çalkalayıcı) üzerine yerleştirin.

4. Orta beynin örüntülenmesi

  1. 7. Günde, 100 ng / mL FGF-8b ile 12 mL CDM ekleyin; Orbital Shaker inkübatörüne yerleştirin.
  2. 8-13. Günlerde, ortamı 2 günde bir değiştirin; Her gün mikroskop altında gözlemleyin.
  3. 14. Günde, 100 ng / mL FGF-8b ve 1 μM purmorfamin (PM) ile 12 mL CDM ekleyin; orbital çalkalayıcı üzerine yerleştirin.
  4. 15-20. Günlerde, ortamı her 2 günde bir değiştirin; Her gün mikroskop altında gözlemleyin.

5. Matrigel gömme ve MO sonlandırma ve olgunlaşma

  1. Matrigel'i 2-2 saat süreyle 2 °C ile 8 °C arasındaki bir sıcaklıkta buz üzerinde çözdürün.
    NOT: Her embriyoid cisimciği (EB) için 15 μL sağlamak için yeterli miktarda Matrigel çözün. Erken polimerizasyonu önlemek için Matrigel'i buz üzerinde soğuk tutun. Matrigel ile temas edecek tüm plastik malzemeleri kullanmadan önce -20 °C'de en az 30 dakika soğutun.
  2. Boş bir tabağa steril bir organoid gömme tabakası yerleştirin.
  3. Geniş delikli 200 μL'lik bir pipet ucu kullanarak, organoidi tabaktan nazikçe çıkarın ve oyuk başına bir organoid ile gömme yüzeyine aktarın. Gömme yüzeyinde 12-16 EB toplanana kadar bu işlemi tekrarlayın.
  4. Fazla ortamı her EB'den dikkatlice çıkarın ve ardından her EB'nin üzerine damla damla 15 μL soğuk Matrigel ekleyin. Bir pipet yardımıyla, EB'yi Matrigel damlacığının merkezine yeniden konumlandırın.
  5. Matrigel'in polimerize olmasına izin vermek için plakayı 37 ° C'ye ayarlanmış bir inkübatörde 15-20 dakika inkübe edin.
  6. Steril forseps kullanarak, gömme tabakasını Matrigel damlacıkları ile kaldırın. Levhayı, 6 oyuklu ultra düşük yapışkan bir plakada doğrudan bir kuyunun üzerinde tutun. 10 ng/mL Beyin Kaynaklı Nörotrofik Faktör (BDNF) ve 10 ng/mL Glial hücre hattı Türetilmiş Nörotrofik Faktör (GDNF) ile 3 mL CDM'yi pipetleyin ve Matrigel damlacıklarını tabakadan her bir oyuğa nazikçe durulayın. Tüm 6-8 Matrigel damlacıkları tek bir kuyucuğa aktarılana kadar bu işlemi tekrarlayın.
  7. Plakaları 85 rpm'de 37 °C'lik bir inkübatörde bir orbital çalkalayıcı üzerine yerleştirin ve CDM'yi her 3 günde bir 10 ng/mL BDNF ve 10 ng/mL GDNF ile değiştirin.
    NOT: Farklılaşan kültürleri 3 aya kadar koruyun; Nöral morfoloji, sonlandırmadan 2 hafta sonra ortaya çıkar. BDNF ve GDNF, 3 aydan fazla kültür için gerekli değildir.

6. İmmünofloresan boyama

  1. Organoidi ortamdan nazikçe almak için 1.000 μL'lik bir pipet kullanın ve minimum ortamlı bir mikroskop lamına nazikçe yerleştirin.
  2. RT'de tamamen kurumasına izin verin. 30 dakika boyunca %4 paraformaldehit (PFA) (numune başına 300 μL) ekleyin.
    NOT: PFA tehlikelidir ve kanserojen özelliklere sahip olabilir. Dikkatli kullanın, cilt ve gözlerle doğrudan temasından kaçının ve kimyasal davlumbaz içinde kullanıldığından emin olun.
  3. Slaytlara %30 sükroz çözeltisi (numune başına 300 μL) ekleyin ve gece boyunca 4 °C'de inkübe etmelerine izin verin.
  4. RT'de 2 saat boyunca (veya gece boyunca 4 ° C'de) PBS (Ca2 + / Mg2 + ile),% 0.3 Triton X-100 ve% 10 normal keçi serumu içeren bloke edici tampon (BB) (numune başına 300 μL) ekleyerek organoidleri bloke edin ve nüfuz edin. Organoidleri tanımlamak ve tamponu slayt üzerinde sınırlamak için hidrofobik bir bariyer kalemi kullanın.
  5. Numuneleri, bloke edici tamponda uygun hacimde birincil antikor ile örtün (numune başına 300 μL), çatal başlı kutu proteini G1 (FOXG1, 1:200), anti-ortodontikül homeobox 2 (OTX2, 1:100), anti-Çatal Kutu A2 (FOXA2, 1:100), anti-Tirozin Hidroksilaz (TH, 1:100), anti-SRY (cinsiyet belirleyici bölge Y)-kutu 2 (SOX2, 1:100), anti-eşleştirilmiş kutu proteini (PAX6, 1:100) ve anti-mikrotübül ilişkili protein 2 (MAP2 1:500), ve gece boyunca karanlıkta 4 °C'de inkübe edin (Malzeme Tablosuna bakınız).
  6. Numuneleri hafifçe sallanan bir platformda iki ila üç tampon değişikliği ile 3 saat boyunca 1x PBS'de yıkayın.
  7. İkincil antikor (numune başına 300 μL), anti-Alexa Fluor 488 (1:800), anti-Alexa Fluor 594 (1:800) ve anti-Alexa Fluor 647 (1:800) ile gece boyunca 4 °C'de nemlendirilmiş bir karanlık odada inkübe edin. Hoechst 33342 (1:5,000) nükleer lekesini aynı anda ekleyin (bkz. Malzeme Tablosu).
  8. Antikoru çıkarın, PBS ile hızlı bir şekilde durulayın ve ardından kontaminasyonu önlemek için 4 ° C'de 1-2 gün boyunca% 0.01 sodyum azid içeren PBS ekleyin.
  9. PBS'yi aspire edin, fazla çözeltiyi çıkarın ve organoidleri bir montaj ortamı kullanarak monte edin ( Malzeme Tablosuna bakın). Hava kabarcığı oluşumunu önlemek için bir lamel yerleştirin ve montaj ortamının tamamen polimerize olmasını sağlamak için RT'de karanlık bir odada en az 12 saat saklayın.
    NOT: Örnek artık bir floresan mikroskobu kullanılarak gözlemlenmeye hazırdır.

Sonuçlar

Bu çalışmada, iPSC'lerden MO'ların türetilmesi için öncü bir protokol sunuyoruz. Metodolojimizin merkezinde, FGF-8b ve sonik kirpi (SHH) yolu agonisti purmorfamin (PM) ile sinerjik olarak birleştirilen çift SMAD inhibisyonunun yenilikçi kullanımı yer almaktadır. Bu yaklaşım Şekil 1'de gösterilmiştir. Farklılaşma süreci, iPSC'leri nöroektoderm soyuna doğru yönlendirerek başlar ve nöroepitelyal veya nöral rozet kolonileri oluşturur...

Tartışmalar

Bu araştırmada, MO'nun iPSC'lerden ayırt edilmesi için bir metodoloji geliştirdik. Protokolümüz, FGF-8b ve SHH agonisti PM dahil olmak üzere morfojenik faktörlerle geliştirilmiş bir çift SMAD inhibisyon stratejisi kullanır. Bu yaklaşım, orta beyin ontogenezisi için çok önemli olan gelişimsel ipuçlarını yakından simüle eder. Oluşturduğumuz farklılaşma yolu, doğal beyin gelişimi sırasında gözlemlenen nöral rozetleri anımsatan nöroepitelyal yapıların ol...

Açıklamalar

Yazarların açıklanacak herhangi bir çıkar çatışması yoktur.

Teşekkürler

Şekil 1 , BioRender.com kullanılarak oluşturulmuştur. Finansman için Bergen Üniversitesi Meltzers Høyskolefonds'a (proje no: 103517133), Gerda Meyer Nyquist Guldbrandson ve Gerdt Meyer Nyquists legat'a (proje no: 103816102) teşekkür ederiz.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
CCD Microscope Camera Leica DFC3000 GLeica Microsystems, Germany
Chemically Defined Lipid ConcentrateThermo Fisher Scientific11905031CDM ingredient
Collagenase  IVThermo Fisher Scientific17104019Reagent for gentle dissociation of human iPSCs
Corning non-treated culture dishesSigma-AldrichCLS430589Suspension culture 
DMEM/F-12, GlutaMAX supplementThermo Fisher Scientific10565018Astrocyte differentiation basal Medium
DPBSThermo Fisher Scientific14190250Used for a variety of cell culture wash
EDTAThermo Fisher Scientific15575020Reagent for gentle dissociation of human iPSCs
Essential 8 Basal MediumThermo Fisher ScientificA1516901Basal medium for iPSC culture
Essential 8 Supplement (50x)Thermo Fisher ScientificA1517101Supplement for iPSC culture
FCCPAbcamab120081Eliminates mitochondrial membrane potential and TMRE staining
FGF-basicPeproTech100-18BAstrocyte differentiation medium ingredient
Fluid aspiration system BVC controlVacuubrand, Germany
Formaldehyde (PFA) 16%Thermo Fisher Scientific28908Cell fixation 
GDNFPeprotech450-10DA neurons medium ingredient
Geltrex (Basement membrane matrix)Thermo Fisher ScientificA1413302Used for attachment and maintenance of human iPSCs
GlutaMAX SupplementThermo Fisher Scientific35050061Supplement for NSC culture
Heracell 150i CO2 IncubatorsFisher Scientific, USA
IMDMThermo Fisher Scientific21980032Basal medium for CDM
InSolution AMPK InhibitorSigma-Aldrich171261Neural induction medium ingredient
InsulinRoche1376497CDM ingredient
iPSCs derived from Detroit 551 fibroblats ATCCCCL-110
Leica TCS SP8 STED confocal microscopeLeica Microsystems, Germany
MatrigelLife Science354230Matrigel embedding
MonothioglycerolSigma-AldrichM6145CDM ingredient
Normal goat serumThermo Fisher ScientificPCN5000Used for blocking buffer
Orbital shakers - SSM1Stuart Equipment, UK
Organoid Embedding SheetSTEMCELL Technologies8579Matrigel embedding
Organoid Embedding SheetSTEMCELL Technologies 8579
PBS 1xThermo Fisher Scientific18912014Used for a variety of washes
Poly-D-lysine hydrobromideSigma-AldrichP7405Promotes attachment and growth of neural cells in vitro
Poly-L-ornithine solutionSigma-AldrichP4957Promotes attachment and growth of neural cells in vitro
ProLong Gold Antifade MountantThermo Fisher ScientificP36930Mounting the coverslip for confocal image
PurmorphamineSTEMCELL Technologies72204Promotes DA neuron differentiation
Recombinant Human/Mouse FGF-8b Protein R&D Systems423-F8-025/CFPromotes DA neuron differentiation 
SB 431542Tocris BioscienceTB1614-GMPNeural Induction Medium ingredient
TRITON X-100VWR International9002-93-1Used for cells permeabilization in immunostaining assays
SSM1 compact orbital shaker Norrscope51901-10 SSM1 Shaker, orbital, mini 230VRotator for organoid culturing.
Water Bath Jb Academy Basic Jba5 JBA5 Grant InstrumentsGrant Instruments, USA
Antibodies used for immunostaining
Primary antibody
anti-DATAbcamab128848, RRID:AB_2665470Rabbit; 1:100 
anti-FOXA2ProteinTech22474-1-AP, RRID:AB_2879110Rabbit; 1:100 
anti-FOXG1Abcamab196868, RRID:AB_2892604Rabbit; 1:200
anti-LMX1Abcamab139726, RRID:AB_2827684Rabbit; 1:100 
anti-MAP2Abcamab5392 ,RRID:AB_2138153Chicken; 1:500
anti-OTX2ProteinTech13497-1-AP, RRID:AB_2157176Rabbit; 1:100 
anti-THAbcamab75875, RRID:AB_1310786Rabbit; 1:100 
Secondary antibodyDilution (μL)
 Alexa Fluor  594 goat anti-rabbit IgGThermo Fisher ScientificA-11012 1:400
Alexa Fluor  488 goat anti-rabbit IgGThermo Fisher ScientificA- 11008 1:400
Alexa Fluor  488 goat anti-rabbit IgGThermo Fisher ScientificA- 11008 1:400
Alexa Fluor  488 goat anti-rabbit IgGThermo Fisher ScientificA- 11008 1:400
Alexa Fluor  594 goat anti-rabbit IgG Thermo Fisher ScientificA-11012 1:400
Alexa Fluor  594 goat anti-rabbit IgG Thermo Fisher ScientificA-11012 1:400
Alexa Fluor  647 goat anti-chicken IgG Thermo Fisher ScientificA-21469 1:400

Referanslar

  1. Markram, H. Seven challenges for neuroscience. Funct Neurol. 28 (3), 145-151 (2013).
  2. Liang, K. X., et al. N-acetylcysteine amide ameliorates mitochondrial dysfunction and reduces oxidative stress in hiPSC-derived dopaminergic neurons with POLG mutation. Exp Neurol. 33 (7), 113-536 (2021).
  3. Chen, A., et al. Nicotinamide riboside and metformin ameliorate mitophagy defect in induced pluripotent stem cell-derived astrocytes with POLG mutations. Front Cell Dev Biol. 9, 304-737 (2021).
  4. Liang, K. X., et al. Disease-specific phenotypes in iPSC-derived neural stem cells with POLG mutations. EMBO Mol Med. 12 (10), 121-146 (2020).
  5. Xu, P., et al. Human midbrain dopaminergic neuronal differentiation markers predict cell therapy outcomes in a Parkinson's disease model. J Clin Invest. 132 (14), 156-768 (2022).
  6. Cooper, O., et al. Pharmacological rescue of mitochondrial deficits in iPSC-derived neural cells from patients with familial Parkinson's disease. Sci Transl Med. 4 (141), 141-190 (2012).
  7. Nguyen, H. N., et al. LRRK2 mutant iPSC-derived DA neurons demonstrate increased susceptibility to oxidative stress. Cell Stem Cell. 8 (3), 267-280 (2011).
  8. Fiorenzano, A., et al. Single-cell transcriptomics captures features of human midbrain development and dopamine neuron diversity in brain organoids. Nat Commun. 12 (1), 73-102 (2021).
  9. Velasco, S., et al. Individual brain organoids reproducibly form cell diversity of the human cerebral cortex. Nature. 570 (7762), 523-527 (2019).
  10. Qian, X., Song, H., Ming, G. L. Brain organoids: advances, applications and challenges. Development. 146 (8), dev166074 (2019).
  11. Lancaster, M. A., et al. Cerebral organoids model human brain development and microcephaly. Nature. 501 (7467), 373-379 (2013).
  12. Shariati, L., Esmaeili, Y., Haghjooy Javanmard, S., Bidram, E., Amini, A. Organoid technology: Current standing and future perspectives. Stem Cells. 39 (12), 1625-1649 (2021).
  13. Haycock, J. W. 3D cell culture: a review of current approaches and techniques. Methods Mol Biol. 695, 1-15 (2011).
  14. D'Avanzo, C., et al. Alzheimer's in 3D culture: challenges and perspectives. Bioessays. 37 (10), 1139-1148 (2015).
  15. Sun, A. X., Ng, H. H., Tan, E. K. Translational potential of human brain organoids. Ann Clin Transl Neurol. 5 (2), 226-235 (2018).
  16. Del Dosso, A., Urenda, J. P., Nguyen, T., Quadrato, G. Upgrading the physiological relevance of human brain organoids. Neuron. 107 (6), 1014-1028 (2020).
  17. Pasca, A. M., et al. Functional cortical neurons and astrocytes from human pluripotent stem cells in 3D culture. Nat Methods. 12 (7), 671-678 (2015).
  18. Asgrimsdottir, E. S., Arenas, E. Midbrain dopaminergic neuron development at the single cell level: In vivo and in stem cells. Front Cell Dev Biol. 8, 463 (2020).
  19. Zagare, A., et al. Midbrain organoids mimic early embryonic neurodevelopment and recapitulate LRRK2-p.Gly2019Ser-associated gene expression. Am J Hum Genet. 109 (2), 311-327 (2022).
  20. Mohamed, N. V., et al. Midbrain organoids with an SNCA gene triplication model key features of synucleinopathy. Brain Commun. 3 (4), fcab223 (2021).
  21. Jo, J., et al. Midbrain-like organoids from human pluripotent stem cells contain functional dopaminergic and neuromelanin-producing neurons. Cell Stem Cell. 19 (2), 248-257 (2016).
  22. Kwak, T. H., et al. Generation of homogeneous midbrain organoids with in vivo-like cellular composition facilitates neurotoxin-based Parkinson's disease modeling. Stem Cells. 38 (6), 727-740 (2020).
  23. Karmirian, K., et al. Modeling Alzheimer's disease using human brain organoids. Methods Mol Biol. 2561, 135-158 (2023).
  24. Smits, L. M., et al. Modeling Parkinson's disease in midbrain-like organoids. NPJ Parkinsons Dis. 5, 5 (2019).
  25. Qian, X., et al. Brain-region-specific organoids using mini-bioreactors for modeling ZIKV exposure. Cell. 165 (5), 1238-1254 (2016).
  26. Smits, L. M., et al. Single-cell transcriptomics reveals multiple neuronal cell types in human midbrain-specific organoids. Cell Tissue Res. 382 (3), 463-476 (2020).
  27. Sozzi, E., Nilsson, F., Kajtez, J., Parmar, M., Fiorenzano, A. Generation of human ventral midbrain organoids derived from pluripotent stem cells. Curr Protoc. 2 (9), 555 (2022).
  28. Tieng, V., et al. Engineering of midbrain organoids containing long-lived dopaminergic neurons. Stem Cells Dev. 23 (13), 1535-1547 (2014).
  29. Chambers, S. M., et al. Highly efficient neural conversion of human ES and iPS cells by dual inhibition of SMAD signaling. Nat Biotechnol. 27 (3), 275-280 (2009).
  30. Mercurio, S., Serra, L., Pagin, M., Nicolis, S. K. Deconstructing Sox2 function in brain development and disease. Cells. 11 (10), 1604 (2022).
  31. Hettige, N. C., Ernst, C. FOXG1 dose in brain development. Front Pediatr. 7, 482 (2019).
  32. Cooper, O., et al. Differentiation of human ES and Parkinson's disease iPS cells into ventral midbrain dopaminergic neurons requires a high activity form of SHH, FGF8a and specific regionalization by retinoic acid. Mol Cell Neurosci. 45 (3), 258-266 (2010).
  33. Millet, S., Bloch-Gallego, E., Simeone, A., Alvarado-Mallart, R. M. The caudal limit of Otx2 gene expression as a marker of the midbrain/hindbrain boundary: a study using in situ hybridisation and chick/quail homotopic grafts. Development. 122 (12), 3785-3797 (1996).
  34. Surmeier, D. J. Determinants of dopaminergic neuron loss in Parkinson's disease. FEBS J. 285 (19), 3657-3668 (2018).
  35. Chen, A., Yangzom, T., Sullivan, G. J., Liang, K. X. Mitochondrial dysfunction and neuronal anomalies in POLG mutant midbrain organoids. bioRxiv. , (2023).

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

3D Orta Beyin Organoidlerinsan Pluripotent K k H crelerind klenmi Pluripotent K k H crelerFarkl la ma Protokolift SMAD nhibisyonuFibroblast B y me Fakt r 8bSonic Hedgehog YoluN roepitelyal H cre TipleriDopaminerjik N ronlarOrta Beyne zg Belirte lerHastal k ModellemesiParkinson HastalN rolojik Ara t rma

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır