Génération d’organoïdes 3D du mésencéphale à partir de cellules souches pluripotentes induites par l’homme

Résumé

Ce protocole décrit une nouvelle méthode de création d’organoïdes 3D du mésencéphale à partir de cellules souches pluripotentes induites humaines, guidant leur formation pour imiter le tissu natif du mésencéphale, contribuant ainsi à l’étude du développement et des troubles.

Résumé

Le développement d’organoïdes du mésencéphale (MO) à partir de cellules souches pluripotentes humaines (hPSC) représente une avancée significative dans la compréhension du développement du cerveau, facilitant la modélisation précise des maladies et faisant progresser la recherche thérapeutique. Ce protocole décrit une méthode de génération d’organoïdes spécifiques au mésencéphale à l’aide de cellules souches pluripotentes induites (iPSC), en utilisant une approche de différenciation stratégique. Les techniques clés comprennent l’inhibition de la double SMAD pour supprimer la signalisation SMAD, l’administration du facteur de croissance des fibroblastes 8b (FGF-8b) et l’activation de la voie Sonic Hedgehog à l’aide de l’agoniste purmorphamine, guidant les iPSC vers le destin du mésencéphale.

Les organoïdes produits par cette méthode atteignent des diamètres allant jusqu’à 2 mm et intègrent un large éventail de types de cellules neuroépithéliales, reflétant la diversité cellulaire inhérente au mésencéphale. La validation de ces organoïdes en tant que structures authentiques du mésencéphale implique l’expression de marqueurs spécifiques au mésencéphale, confirmant leur identité. Un résultat notable de cette méthodologie est la différenciation efficace des iPSC en neurones dopaminergiques, qui sont caractéristiques du mésencéphale.

L’importance de ce protocole réside dans sa capacité à produire des organoïdes fonctionnellement matures, spécifiques au mésencéphale, qui reproduisent fidèlement les aspects essentiels du mésencéphale, offrant un modèle précieux pour l’exploration approfondie des processus de développement du mésencéphale et de la physiopathologie de troubles connexes tels que la maladie de Parkinson. Ainsi, ce protocole constitue une ressource cruciale pour les chercheurs qui cherchent à améliorer notre compréhension du cerveau humain et à développer de nouveaux traitements pour les maladies neurodégénératives, ce qui en fait un outil indispensable dans le domaine de la recherche neurologique.

Introduction

Le cerveau humain, avec son architecture complexe et sa composition cellulaire et moléculaire complexe, présente des défis considérables dans la recherche en neurosciences, en particulier dans le contexte de la modélisation des maladies et du développement de la thérapie cellulaire¹. Ces défis sont encore compliqués par la disponibilité limitée de modèles in vitro sophistiqués qui représentent vraiment la complexité du cerveau humain. Cependant, les progrès récents de la technologie des cellules souches pluripotentes induites humaines (iPSC), permettant une différenciation contrôlée en sous-types neuronaux spécifiques, ont ouvert des voies prometteuses pour l’exploration du développement du cerveau humain, de la pathogenèse des maladies et des stratégies thérapeutiques basées sur les cellules.

Traditionnellement, les cultures neuronales bidimensionnelles (2D) dérivées d’iPSC ont été la pierre angulaire des études in vitro visant à imiter la physiologie et la pathologie neuronales humaines. Ces cultures monocouches ont contribué à améliorer notre compréhension des maladies neurologiques et à la découverte d’agents neuroprotecteurs 2,3,4,5,6,7. Malgré leur utilité, ces systèmes 2D ne parviennent pas à émuler la véritable diversité cellulaire et la structure tridimensionnelle (3D) du cerveau humain.

L’avènement de la technologie des organoïdes cérébraux représente un bond significatif dans la modélisation in vitro, fournissant un outil qui imite étroitement la biologie complexe du cerveau humain dans un cadre physiologiquement pertinent⁸. Les premières techniques de développement d’organoïdes cérébraux ont capitalisé sur les propriétés régulatrices inhérentes des iPSC pour former spontanément des dérivés de l’ectoderme, imitant ainsi les premiers stades du développement cérébral 5,9,10,11,12. Compte tenu des réseaux complexes formés par les neurones avec d’autres cellules neuronales et non neuronales, la modélisation 3D devient essentielle pour étudier avec précision les maladies neurodégénératives. Les cultures 3D fournissent un environnement in vivo plus représentatif, facilitant la différenciation neuronale accélérée et la formation de réseaux 12,13,14, et favorisent une expression plus large des gènes neuronaux par rapport aux cultures 2D¹⁵. Les neurones développés dans des contextes 3D atteignent des morphologies et des attributs physiologiques plus proches de leurs homologues in vivo ¹⁶.

Les progrès récents dans les modèles de cerveau 3D ont été essentiels pour capturer plus efficacement la complexité spatiale et fonctionnelle du cerveau humain. Au cours de la dernière décennie, l’avancement de divers protocoles pour générer à la fois des organoïdes du cerveau entier et des modèles cérébraux spécifiques à une région 11,17,18,19,20,21,22 s’est avéré inestimable dans la modélisation de troubles neurologiques tels que la microcéphalie ¹¹, la maladie d’Alzheimer ^14,23 et la maladie de Parkinson²⁴. L’objectif de ce protocole est de développer et d’affiner une méthode de création de MO humains 3D dérivés d’iPSC humaines. Ce protocole vise spécifiquement à générer des organoïdes enrichis de neurones dopaminergiques et organisés spatialement de manière à imiter étroitement la structure naturelle et la fonctionnalité du mésencéphale humain. L’objectif principal de ces organoïdes est de servir de modèles in vitro avancés pour l’étude de la maladie de Parkinson, fournissant un système plus précis et physiologiquement pertinent pour explorer les processus neurodéveloppementaux et les pathologies associées à cette maladie. En exploitant des iPSC dérivées de patients pour générer ces organoïdes spécifiques du mésencéphale, le protocole cherche à améliorer la compréhension des mécanismes de la maladie de Parkinson, à faciliter la découverte de cibles thérapeutiques potentielles et à améliorer le développement de thérapies cellulaires. Grâce à cette approche innovante, le protocole vise à surmonter les limites des cultures neuronales 2D traditionnelles et à contribuer de manière significative au domaine de la recherche sur les maladies neurodégénératives en offrant un outil puissant pour la modélisation in vitro des maladies et l’exploration de nouvelles stratégies de traitement.

Au cours des 10 dernières années, diverses équipes de recherche ont mis au point des organoïdes du mésencéphale (MO)8,21,25,26,27,28, en utilisant des méthodologies qui présentent plusieurs similitudes clés. Dans le but d’approfondir la compréhension de la maladie de Parkinson, nous avons développé un protocole pour créer des MO humains en 3D dérivés d’iPSC humaines. Ces organoïdes, enrichis de neurones dopaminergiques disposés dans l’espace, présentent un modèle idéal pour l’étude de la maladie de Parkinson. Le développement et le perfectionnement de protocoles d’organoïdes spécifiques au mésencéphale ont donné naissance à des modèles in vitro avancés qui ont contribué de manière significative à notre compréhension des processus neurodéveloppementaux et des maladies neurodégénératives. Ces modèles, en particulier lorsqu’ils sont appliqués aux MO dérivées de patients, ont démontré leur efficacité en tant qu’outils puissants pour la modélisation des maladies in vitro, offrant de nouvelles perspectives et méthodologies dans le domaine de la culture cellulaire 3D avancée.

Protocole

Les iPSC générées à partir de fibroblastes humains normaux Detroit 551 et de cellules souches embryonnaires humaines (ESC) hESC line 360 comme décrit précédemment⁴. Les CSPi ont été obtenues avec l’approbation du Comité de Norvège occidentale pour la recherche éthique en santé REK nr. 2012/919. Toutes les cellules ont fait l’objet d’une surveillance régulière à l’aide de la trousse de détection de mycoplasmes MycoAlert. La table des matériaux contient des informations sur tous les matériaux, réactifs et équipements utilisés dans ce protocole. Le tableau 1 décrit les supports et autres supports utilisés.

1. Décongélation des CSPi

1. Préparation de la plaque revêtue d’une matrice et du milieu essentiel 8 (E8)
   1. Décongelez le flacon de matrice à membrane basale sur de la glace pendant la nuit. Diluer 1:100 dans du milieu avancé avancé Dulbecco’s Eagle’s Medium (DMEM)/Ham’s F12 DMEM/F12 (concentration finale de 1 %) (voir le tableau des matériaux et le tableau 1). Stocker les aliquotes à -20 °C pour une utilisation à long terme.
   2. Décongeler la membrane basale diluée à 4 °C ; Enduire une plaque à 6 puits de 1 mL de solution par puits. Incuber à 37 °C pendant 1 h.
   3. Retirez la plaque de l’incubateur et laissez-la s’équilibrer à température ambiante (RT).
      REMARQUE : Les assiettes peuvent être réfrigérées pendant un maximum de 2 semaines (assurez-vous de les réchauffer à RT avant utilisation). Pour un stockage prolongé, ajoutez 1 mL de milieu E8 (voir le tableau des matériaux et le tableau 1) à la plaque enduite pour éviter que le gel ne se dessèche.
2. E8 préparation moyenne
   1. Dans un environnement stérile, combiner le milieu de base E8 avec un supplément d’E8 (voir le tableau des matériaux et le tableau 1).
      REMARQUE : Il peut être conservé à 4 °C pendant 2 semaines. Décongelez le supplément d’E8 congelé pendant la nuit à 4 °C avant de préparer le milieu complet. Ne pas décongeler à 37 °C, car cela pourrait compromettre sa stabilité. Avant utilisation, réchauffez uniquement le volume requis de E8 Medium à température ambiante (RT) jusqu’à ce qu’il ne soit plus froid au toucher.

2. Ensemencement des iPSC

1. Préchauffez les plaques revêtues de matrice et le milieu E8 à RT ou incubateur à 37 °C.
2. Milieu de culture par aspiration ; rincer les CSPi, qui ont une confluence de 60 % à 70 %, avec la solution saline tamponnée au phosphate de Dulbecco sans calcium ni magnésium (DPBS Ca²⁺/Mg²⁺-free, 4 mL par puits dans une plaque à 6 puits).
3. Ajouter de l’acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA, 0,5 mM, 1 mL par puits, voir le Tableau des matériaux et le Tableau 1) ; incuber à 37 °C jusqu’à ce que les bords de la colonie se détachent (3-5 min).
4. Aspirer la solution de dissociation ; pour détacher les colonies, pipeter soigneusement le milieu E8 préchauffé (4 ml par puits) directement sur les colonies avec une force plus forte que d’habitude de la pipette, ce qui génère un mouvement de fluide localisé sur la surface de la cellule.
5. Divisez les cellules selon un rapport de 1:2 en les transférant dans deux nouveaux puits d’une plaque à 6 puits recouverte d’une matrice, en ajoutant 2 ml de milieu par puits. Ensuite, incuber à 37 °C.
6. Échangez le milieu tous les jours jusqu’à ce que les colonies atteignent 80 % de confluence.
7. À l’aide d’un microscope à grossissement de 10x, observez les colonies pour vous assurer qu’elles sont d’une taille appropriée, généralement caractérisée par une forme ronde distincte d’un diamètre allant de 0,5 à 1 mm. Confirmer que les colonies sont des structures denses et compactes avec des bordures délimitées et lisses.

3. Induction neuronale

1. Préparation moyenne et configuration du jour 0
   1. Préparez 500 ml chacun de milieu chimiquement défini (CDM), de milieu d’induction neurale (NIM) et de milieu sans sérum de cellules souches neurales (NSC SF), en vous référant au tableau des matériaux et au tableau 1.
   2. Rincez les cellules dans une plaque à 6 puits avec 4 mL de DPBS (1x) (Ca²⁺/Mg²⁺- libre) par puits, suivi de l’ajout de 3 mL de NIM par puits pour la configuration du jour 0.
   3. Remplacer le NIM (3 mL par puits) les jours 1, 3 et 5 ; Observez quotidiennement au microscope.
   4. Le jour 6, détachez les rosettes neurales dans une culture en suspension en suivant les étapes suivantes.
      1. Laver délicatement une fois avec du DPBS (1x) (sans Ca²⁺/Mg²⁺) (4 mL par puits dans une assiette à 6 puits). Ajouter la collagénase IV (1 mL par puits dans une assiette à 6 puits) et incuber pendant 1 min. Retirer la collagénase IV et rincer délicatement une fois avec du DPBS (1x) (sans Ca²⁺/Mg²⁺) (4 mL par puits dans une assiette à 6 puits).
      2. Ajouter 2 mL de NSC SF Medium dans chaque puits d’une plaque de 6 puits. Détachez les cellules en raclant le fond du puits, en créant des grilles avec une pointe de pipette de 200 μL.
      3. Transférez la suspension cellulaire de la plaque à 6 puits dans une coupelle non adhérente de 10 cm. Réglez le volume à 12 ml avec NSC SF Medium.
      4. Placez le plat non adhérent sur un agitateur (agitateur orbital compact ssm1) à 85 tr/min à un angle de 0° dans un incubateur réglé à 37 °C avec 5 % de CO₂ pour éviter l’agrégation.

4. Structuration du mésencéphale

1. Le jour 7, ajouter 12 mL de CDM avec 100 ng/mL de FGF-8b ; Placer sur l’incubateur Orbital Shaker.
2. Les jours 8 à 13, changez de support tous les 2 jours ; Observez au microscope tous les jours.
3. Le 14e jour, ajouter 12 mL de CDM avec 100 ng/mL de FGF-8b et 1 μM de purmorphamine (PM) ; Placer sur un agitateur orbital.
4. Les jours 15 à 20, changez de support tous les 2 jours ; Observez au microscope tous les jours.

5. Intégration du matrigel et terminaison et maturation du MO

1. Décongeler le Matrigel sur glace à une température comprise entre 2 °C et 8 °C pendant une durée de 1 à 2 h.
   REMARQUE : Décongeler une quantité adéquate de Matrigel pour fournir 15 μL pour chaque corps embryoïde (EB). Gardez le Matrigel réfrigéré sur de la glace pour éviter une polymérisation précoce. Refroidissez tous les articles en plastique qui seront en contact avec Matrigel à -20 °C pendant au moins 30 minutes avant de les utiliser.
2. Placez une feuille d’enrobage d’organoïde stérile dans un plat vide.
3. À l’aide d’une pointe de pipette de 200 μL à large diamètre, retirez délicatement l’organoïde de la boîte et transférez-le sur la surface d’enrobage à l’aide d’un organoïde par puits. Répétez ce processus jusqu’à ce que 12 à 16 EB soient collectés sur la surface d’enrobage.
4. Retirez soigneusement l’excédent de milieu de chaque EB, puis ajoutez 15 μL de Matrigel froid goutte à goutte sur chaque EB. À l’aide d’une pipette, repositionnez l’EB au centre de la gouttelette de Matrigel.
5. Incuber la plaque dans un incubateur réglé à 37 °C pendant 15 à 20 minutes pour permettre au Matrigel de polymériser.
6. À l’aide d’une pince stérile, soulevez la feuille d’enrobage avec les gouttelettes de Matrigel. Tenez la feuille directement au-dessus d’un puits dans une plaque à 6 puits à très faible adhérence. Pipetez 3 ml de CDM avec 10 ng/mL de facteur neurotrophique dérivé du cerveau (BDNF) et de 10 ng/mL de facteur neurotrophique dérivé de la lignée cellulaire gliale (GDNF) et rincez doucement les gouttelettes de Matrigel de la feuille dans chaque puits. Répétez ce processus jusqu’à ce que les 6 à 8 gouttelettes de Matrigel soient transférées dans un seul puits.
7. Placez les plaques sur un agitateur orbital dans un incubateur à 37 °C à 85 tr/min et changez le CDM avec 10 ng/mL de BDNF et 10 ng/mL de GDNF tous les 3 jours.
   REMARQUE : Maintenir les cultures différenciées jusqu’à 3 mois ; La morphologie neurale apparaît après 2 semaines après l’arrêt. Le BDNF et le GDNF ne sont pas nécessaires pour la culture au-delà de 3 mois.

6. Coloration par immunofluorescence

1. À l’aide d’une pipette de 1 000 μL, prélevez délicatement l’organoïde du milieu et placez-le doucement sur une lame de microscope avec un minimum de support.
2. Laisser sécher complètement à l’air libre à RT. Ajouter 4 % de paraformaldéhyde (PFA) (300 μL par échantillon) pendant 30 min.
   REMARQUE : Le PFA est dangereux et peut avoir des propriétés cancérigènes. Manipulez-le avec précaution, évitez tout contact direct avec la peau et les yeux et assurez-vous de l’utiliser dans une hotte chimique.
3. Ajouter une solution de saccharose à 30 % (300 μL par échantillon) aux lames et les laisser incuber pendant la nuit à 4 °C.
4. Bloquez et imprégnez les organoïdes en ajoutant un tampon de blocage (BB) (300 μL par échantillon), qui comprend du PBS (avec Ca²⁺/Mg²⁺), 0,3 % de Triton X-100 et 10 % de sérum de chèvre normal, pendant 2 h à RT (ou toute la nuit à 4 °C). Utilisez un stylo-barrière hydrophobe pour délimiter les organoïdes et confiner le tampon sur la lame.
5. Couvrir les échantillons avec un volume approprié d’anticorps primaire dans le tampon de blocage (300 μL par échantillon), la protéine boîte anti-culotte G1 (FOXG1, 1:200), l’homéoboîte anti-orthodenticule 2 (OTX2, 1:100), la boîte anti-tête de fourche A2 (FOXA2, 1:100), l’anti-tyrosine hydroxylase (TH, 1:100), la boîte 2 anti-SRY (région déterminant le sexe Y) (SOX2, 1:100), la protéine anti-boîte appariée (PAX6, 1:100) et la protéine associée aux microtubules 2 (MAP2 1:500), et incuber toute la nuit à 4 °C dans l’obscurité (voir le tableau des matériaux).
6. Lavez les échantillons dans 1x PBS pendant 3 h avec deux à trois changements de tampon sur une plate-forme à bascule douce.
7. Incuber avec l’anticorps secondaire (300 μL par échantillon), l’anti-Alexa Fluor 488 (1:800), l’anti-Alexa Fluor 594 (1:800) et l’anti-Alexa Fluor 647 (1:800) pendant la nuit à 4 °C dans une chambre noire humidifiée. Ajouter simultanément la coloration nucléaire Hoechst 33342 (1:5 000) (voir le tableau des matériaux).
8. Retirez l’anticorps, rincez rapidement avec du PBS, puis ajoutez du PBS contenant 0,01 % d’azoture de sodium pendant 1 à 2 jours à 4 °C pour inhiber la contamination.
9. Aspirez le PBS, retirez tout excès de solution et montez les organoïdes à l’aide d’un support de montage (reportez-vous à la table des matériaux). Placez une lamelle, en veillant à éviter la formation de bulles d’air, et stockez-la dans une pièce sombre à RT pendant au moins 12 h pour permettre au support de montage de polymériser complètement.
   REMARQUE : L’échantillon est maintenant prêt pour l’observation à l’aide d’un microscope à fluorescence.

Résultats

Dans cette étude, nous introduisons un protocole pionnier pour la dérivation des MO à partir des iPSC. Au cœur de notre méthodologie se trouve l’utilisation innovante de l’inhibition dual-SMAD, combinée en synergie avec le FGF-8b et l’agoniste de la voie Sonic Hedgehog (SHH), la purmorphamine (PM). Cette approche est illustrée à la figure 1. Le processus de différenciation commence par l’orientation des iPSC vers la lignée des neuroectoderm...

Discussion

Dans cette étude, nous avons développé une méthodologie pour différencier les MO des iPSC. Notre protocole utilise une stratégie d’inhibition à double SMAD renforcée par des facteurs morphogéniques, notamment le FGF-8b et l’agoniste SHH PM. Cette approche simule étroitement les indices de développement cruciaux pour l’ontogenèse du mésencéphale. La voie de différenciation que nous avons instituée favorise la formation de structures neuroépithéliales rappelant les ...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
CCD Microscope Camera Leica DFC3000 G	Leica Microsystems, Germany
Chemically Defined Lipid Concentrate	Thermo Fisher Scientific	11905031	CDM ingredient
Collagenase  IV	Thermo Fisher Scientific	17104019	Reagent for gentle dissociation of human iPSCs
Corning non-treated culture dishes	Sigma-Aldrich	CLS430589	Suspension culture
DMEM/F-12, GlutaMAX supplement	Thermo Fisher Scientific	10565018	Astrocyte differentiation basal Medium
DPBS	Thermo Fisher Scientific	14190250	Used for a variety of cell culture wash
EDTA	Thermo Fisher Scientific	15575020	Reagent for gentle dissociation of human iPSCs
Essential 8 Basal Medium	Thermo Fisher Scientific	A1516901	Basal medium for iPSC culture
Essential 8 Supplement (50x)	Thermo Fisher Scientific	A1517101	Supplement for iPSC culture
FCCP	Abcam	ab120081	Eliminates mitochondrial membrane potential and TMRE staining
FGF-basic	PeproTech	100-18B	Astrocyte differentiation medium ingredient
Fluid aspiration system BVC control	Vacuubrand, Germany
Formaldehyde (PFA) 16%	Thermo Fisher Scientific	28908	Cell fixation
GDNF	Peprotech	450-10	DA neurons medium ingredient
Geltrex (Basement membrane matrix)	Thermo Fisher Scientific	A1413302	Used for attachment and maintenance of human iPSCs
GlutaMAX Supplement	Thermo Fisher Scientific	35050061	Supplement for NSC culture
Heracell 150i CO2 Incubators	Fisher Scientific, USA
IMDM	Thermo Fisher Scientific	21980032	Basal medium for CDM
InSolution AMPK Inhibitor	Sigma-Aldrich	171261	Neural induction medium ingredient
Insulin	Roche	1376497	CDM ingredient
iPSCs derived from Detroit 551 fibroblats	ATCC	CCL-110
Leica TCS SP8 STED confocal microscope	Leica Microsystems, Germany
Matrigel	Life Science	354230	Matrigel embedding
Monothioglycerol	Sigma-Aldrich	M6145	CDM ingredient
Normal goat serum	Thermo Fisher Scientific	PCN5000	Used for blocking buffer
Orbital shakers - SSM1	Stuart Equipment, UK
Organoid Embedding Sheet	STEMCELL Technologies	8579	Matrigel embedding
Organoid Embedding Sheet	STEMCELL Technologies	8579
PBS 1x	Thermo Fisher Scientific	18912014	Used for a variety of washes
Poly-D-lysine hydrobromide	Sigma-Aldrich	P7405	Promotes attachment and growth of neural cells in vitro
Poly-L-ornithine solution	Sigma-Aldrich	P4957	Promotes attachment and growth of neural cells in vitro
ProLong Gold Antifade Mountant	Thermo Fisher Scientific	P36930	Mounting the coverslip for confocal image
Purmorphamine	STEMCELL Technologies	72204	Promotes DA neuron differentiation
Recombinant Human/Mouse FGF-8b Protein	R&D Systems	423-F8-025/CF	Promotes DA neuron differentiation
SB 431542	Tocris Bioscience	TB1614-GMP	Neural Induction Medium ingredient
TRITON X-100	VWR International	9002-93-1	Used for cells permeabilization in immunostaining assays
SSM1 compact orbital shaker	Norrscope	51901-10 SSM1 Shaker, orbital, mini 230V	Rotator for organoid culturing.
Water Bath Jb Academy Basic Jba5 JBA5 Grant Instruments	Grant Instruments, USA
Antibodies used for immunostaining
Primary antibody
anti-DAT	Abcam	ab128848, RRID:AB_2665470	Rabbit; 1:100
anti-FOXA2	ProteinTech	22474-1-AP, RRID:AB_2879110	Rabbit; 1:100
anti-FOXG1	Abcam	ab196868, RRID:AB_2892604	Rabbit; 1:200
anti-LMX1	Abcam	ab139726, RRID:AB_2827684	Rabbit; 1:100
anti-MAP2	Abcam	ab5392 ,RRID:AB_2138153	Chicken; 1:500
anti-OTX2	ProteinTech	13497-1-AP, RRID:AB_2157176	Rabbit; 1:100
anti-TH	Abcam	ab75875, RRID:AB_1310786	Rabbit; 1:100
Secondary antibody			Dilution (μL)
Alexa Fluor  594 goat anti-rabbit IgG	Thermo Fisher Scientific	A-11012	1:400
Alexa Fluor  488 goat anti-rabbit IgG	Thermo Fisher Scientific	A- 11008	1:400
Alexa Fluor  488 goat anti-rabbit IgG	Thermo Fisher Scientific	A- 11008	1:400
Alexa Fluor  488 goat anti-rabbit IgG	Thermo Fisher Scientific	A- 11008	1:400
Alexa Fluor  594 goat anti-rabbit IgG	Thermo Fisher Scientific	A-11012	1:400
Alexa Fluor  594 goat anti-rabbit IgG	Thermo Fisher Scientific	A-11012	1:400
Alexa Fluor  647 goat anti-chicken IgG	Thermo Fisher Scientific	A-21469	1:400