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要約

このプロトコルは、ヒトが誘導した多能性幹細胞から3D中脳オルガノイドを作成するための新しい方法を説明し、それらの形成を天然の中脳組織を模倣するように導き、それによって発生と障害の研究を支援します。

要約

ヒト多能性幹細胞(hPSC)からの中脳オルガノイド(MO)の開発は、脳の発生の理解、正確な疾患モデリングの促進、および治療研究の進歩における大きな進歩を表しています。このプロトコールでは、人工多能性幹細胞(iPSC)を使用して中脳特異的オルガノイドを作製する方法を概説し、戦略的な分化アプローチを採用しています。主な手法には、SMADシグナル伝達を抑制するデュアルSMAD阻害、線維芽細胞成長因子8b(FGF-8b)の投与、アゴニストであるプルモルファミンを用いたソニックヘッジホッグ経路の活性化などがあり、iPS細胞を中脳の運命へと導きます。

この方法で作製されるオルガノイドは、最大2mmの直径を達成し、中脳の固有の細胞多様性を反映して、多様な神経上皮細胞タイプを組み込んでいます。これらのオルガノイドが真正な中脳構造であることを検証するには、中脳特異的なマーカーの発現が必要であり、その同一性が確認されます。この方法論の注目すべき成果は、iPS細胞が中脳の特徴であるドーパミン作動性ニューロンに効果的に分化したことです。

このプロトコールの重要性は、機能的に成熟した中脳特異的オルガノイドを作製する能力にあり、中脳の発達過程やパーキンソン病などの関連疾患の病態生理学を深く探求するための貴重なモデルを提供します。したがって、このプロトコルは、人間の脳の理解を深め、神経変性疾患の新しい治療法を開発しようとする研究者にとって重要なリソースとして機能し、神経学研究の分野で不可欠なツールとなっています。

概要

人間の脳は、その複雑な構造と複雑な細胞および分子組成により、神経科学研究、特に疾患モデリングと細胞療法の開発において手ごわい課題を提示しています1。これらの課題は、人間の脳の複雑さを真に表現する洗練されたin vitroモデルの利用が限られているため、さらに複雑になります。しかし、近年のヒト人工多能性幹細胞(iPSC)技術の進歩により、特定の神経細胞サブタイプへの制御された分化が可能になり、ヒトの脳の発達、疾患の病因、細胞ベースの治療戦略を探求するための有望な道が開かれました。

従来、iPS細胞に由来する2次元(2D)神経細胞培養は、ヒトの神経細胞の生理学や病理を模倣することを目的としたin vitro研究の基礎となってきました。これらの単層培養は、神経疾患の理解を深め、神経保護剤2,3,4,5,6,7の発見に役立っています。これらの 2D システムは、その有用性にもかかわらず、人間の脳の真の細胞の多様性と 3 次元 (3D) 構造をエミュレートするには不十分です。

脳オルガノイド技術の出現は、in vitroモデリングにおける大きな飛躍を表しており、生理学的に関連性のあるフレームワーク8内で人間の脳の複雑な生物学を厳密に模倣するツールを提供します。脳オルガノイド発生の初期の技術は、iPS細胞の固有の調節特性を利用して自発的に外胚葉誘導体を形成し、それによって脳の発生の初期段階を模倣していました5,9,10,11,12。ニューロンが他のニューロン細胞や非ニューロン細胞と形成する複雑なネットワークを考えると、神経変性疾患を正確に研究するためには、3Dモデリングが不可欠になります。3D培養は、より代表的なin vivo環境を提供し、ニューロンの分化およびネットワーク形成の促進12,13,14を促進し、2D培養15と比較してニューロン遺伝子の広範な発現を促進する。3Dコンテキストで発達したニューロンは、in vivoの対応物16をより彷彿とさせる形態と生理学的属性を獲得する。

3D脳モデルの最近の進歩は、人間の脳の空間的および機能的複雑さをより効果的に捉える上で極めて重要です。過去10年間で、全脳オルガノイドと領域特異的な脳モデル11,17,18,19,20,21,22の両方を生成するための多様なプロトコルの進歩は、小頭症11、アルツハイマー病14,23、パーキンソン病24などの神経疾患のモデリングに非常に貴重であることが証明されました.このプロトコルの目標は、ヒトiPS細胞に由来する3DヒトMO作製法を開発・改良することです。このプロトコルは、ドーパミン作動性ニューロンが豊富で、人間の中脳の自然な構造と機能を密接に模倣する方法で空間的に組織化されたオルガノイドを生成することを特に目的としています。これらのオルガノイドの主な目的は、パーキンソン病を研究するための高度なin vitroモデルとして機能し、パーキンソン病に関連する神経発達プロセスと病状を調査するためのより正確で生理学的に関連性のあるシステムを提供することです。このプロトコルは、患者由来のiPS細胞を活用してこれらの中脳特異的オルガノイドを作製することにより、パーキンソン病のメカニズムの理解を深め、潜在的な治療標的の発見を促進し、細胞ベースの治療法の開発を改善することを目指しています。この革新的なアプローチを通じて、このプロトコルは、従来の2Dニューロン培養の限界を克服し、in vitro疾患モデリングと新しい治療戦略の探求のための強力なツールを提供することで、神経変性疾患研究の分野に大きく貢献することを目指しています。

過去10年間で、さまざまな研究チームが中脳オルガノイド(MO)8、21、25、26、27、28を開発してきましたが、これらはいくつかの重要な類似点を示す方法論を利用しています。パーキンソン病の理解を深めるために、ヒトiPS細胞からヒト3次元MOを作製するためのプロトコールを開発しました。これらのオルガノイドは、空間的に配置されたドーパミン作動性ニューロンを豊富に含んでおり、パーキンソン病の研究に理想的なモデルを示しています。中脳特異的オルガノイドプロトコルの開発と改良により、神経発達過程と神経変性疾患の理解に大きく貢献した高度な in vitro モデルが得られました。これらのモデルは、特に患者由来のMOに適用された場合、 in vitro 疾患モデリングの強力なツールとしての有効性を実証し、高度な3D細胞培養の分野に新たな視点と方法論を提供します。

プロトコル

ヒト正常線維芽細胞デトロイト551およびヒト胚性幹細胞(ESC)hESCライン360から作製したiPS細胞は、前述の通り4.iPSCは、Western Norway Committee for Ethical Health Research REK nr.2012/919. MycoAlert Mycoplasma Detection Kitを使用して、すべての細胞のマイコプラズマ汚染を定期的に監視しました。 材料表 には、このプロトコルで使用されるすべての材料、試薬、および機器に関する情報が含まれています。 表 1 に、使用したメディアとその他のストックを示します。

1. iPS細胞の解凍

  1. マトリックスコーティングプレートとエッセンシャル8(E8)培地調製
    1. 基底膜マトリックスバイアルを氷上で一晩解凍します。冷温のAdvanced Dulbecco's Modified Eagle's Medium(DMEM)/Ham's F12 DMEM/F12(最終濃度1%)で1:100に希釈します( 材料の表 および 表1を参照)。アリコートは長期間使用するために-20°Cで保存してください。
    2. 希釈した基底膜を4°Cで解凍します。6ウェルプレートにウェルあたり1 mLの溶液をコーティングします。37°Cで1時間インキュベートします。
    3. プレートをインキュベーターから取り外し、室温(RT)まで平衡化します。
      注:プレートは最大2週間冷蔵できます(使用前にRTに温めてください)。長期間保存する場合は、ゲルの乾燥を防ぐために、コーティングされたプレートに1 mLのE8培地( 材料の表 と 表1を参照)を追加します。
  2. E8培地調製
    1. 無菌環境で、E8基礎培地とE8サプリメントを組み合わせます( 材料の表 および 表1を参照)。
      注:これは4°Cで2週間保存できます。凍結したE8サプリメントを4°Cで一晩解凍してから、フル培地を調製します。37°Cで解凍すると、安定性が損なわれる可能性があるため、解凍しないでください。使用する前に、必要な量のE8ミディアムのみを室温(RT)まで温め、触ると冷たくなくなるまで温めてください。

2. iPS細胞の播種

  1. マトリックスコーティングされたプレートとE8培地をRTまたはインキュベーターで37°Cで予温します。
  2. 培地を吸引する。60%-70%のコンフルエント度を持つiPS細胞を、カルシウムとマグネシウムを含まないダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水(DPBS Ca2+/Mg2+-フリー、6ウェルプレートでウェルあたり4mL)で洗い流します。
  3. エチレンジアミン四酢酸(EDTA、0.5 mM、1ウェルあたり1 mL、 材料表 および 表1を参照)を添加します。コロニーの端が剥がれるまで37°Cでインキュベートします(3〜5分)。
  4. 解離溶液を吸引します。コロニーを分離するには、予熱したE8培地(ウェルあたり4 mL)を、ピペットから通常よりも強い力でコロニーに直接慎重にピペットで移します。これにより、細胞表面に局所的な流体運動が生じます。
  5. 細胞をマトリックスコーティングした6ウェルプレートの2つの新しいウェルに移し、ウェルごとに2 mLの培地を添加して、細胞を1:2の比率で分割します。その後、37°Cでインキュベートします。
  6. コロニーが80%の合流点に達するまで、毎日メディアを交換します。
  7. 顕微鏡を10倍の倍率で観察し、コロニーが適切なサイズであり、通常は直径0.5〜1mmの範囲の明確な丸い形状を特徴とします。コロニーが緻密でコンパクトな構造であり、輪郭が描かれた滑らかな境界を備えていることを確認します。

3. 神経誘導

  1. 中程度の準備と0日目のセットアップ
    1. Chemically Defined Medium(CDM)、Neural Induction Medium(NIM)、およびNeural Stem Cell Serum-free(NSC SF)培地をそれぞれ500 mL調製します( 材料表 および 表1を参照)。
    2. ウェルあたり4 mLのDPBS(1x)(Ca2+/Mg2+-フリー)を入れた6ウェルプレートで細胞をすすぎ、続いてウェルあたり3 mLのNIMを添加して0日目のセットアップを行います。
    3. NIM(ウェルあたり3 mL)を1日目、3日目、および5日目に交換します。顕微鏡で毎日観察してください。
    4. 6日目に、次の手順を使用してニューラルロゼットを懸濁培養物に分離します。
      1. DPBS(1x)(Ca2+/Mg2+-free)(6ウェルプレートでウェルあたり4mL)で1回穏やかに洗浄します。コラゲナーゼIV(6ウェルプレートに1ウェルあたり1 mL)を加え、1分間インキュベートします。コラゲナーゼIVを取り出し、DPBS(1x)(Ca2+/Mg2+-free)(6ウェルプレートで1ウェルあたり4mL)で1回繊細にすすぎます。
      2. 2 mLのNSC SF培地を6ウェルプレートの各ウェルに加えます。ウェルの底をこすり落とし、200 μLのピペットチップでグリッドを作成して細胞を切り離します。
      3. 細胞懸濁液を6ウェルプレートから10 cmの非接着性ディッシュに移します。NSC SFミディアムで容量を12mLに調整します。
      4. 凝集を防ぐために、37°Cに設定されたインキュベーターで0°の角度で85rpmのシェーカー(ssm1コンパクトオービタルシェーカー)に非接着性ディッシュを置きます。

4. 中脳のパターニング

  1. 7日目に、12 mLのCDMと100 ng / mL FGF-8bを追加します。オービタルシェーカーインキュベーターに置きます。
  2. 8〜13日目に、2日ごとに培地を交換します。毎日顕微鏡で観察してください。
  3. 14日目に、12 mLのCDMを100 ng / mL FGF-8bおよび1 μMプルモルファミン(PM)とともに追加します。オービタルシェーカーに置きます。
  4. 15〜20日目に、2日ごとに培地を交換します。毎日顕微鏡で観察してください。

5. マトリゲル包埋とMOの結線と成熟

  1. マトリゲルを氷上で2°Cから8°Cの温度で1〜2時間解凍します。
    注:各胚様体(EB)に15μLを供給するのに十分な量のマトリゲルを解凍します。マトリゲルは氷の上で冷やして、早期の重合を避けてください。マトリゲルと接触するすべてのプラスチック製品は、使用する前に-20°Cで最低30分間冷却します。
  2. 滅菌済みのオルガノイド包埋シートを空の皿に置きます。
  3. ワイドボアの200 μLピペットチップを使用して、オルガノイドをディッシュから静かに取り出し、ウェルごとに1つのオルガノイドで包埋面に移します。12〜16個のEBが埋め込み面に収集されるまで、このプロセスを繰り返します。
  4. 各EBから余分な培地を慎重に取り除き、次に各EBに15μLの冷たいマトリゲルを滴下します。ピペットを使用して、EBをマトリゲル液滴の中心に再配置します。
  5. プレートを37°Cにセットしたインキュベーターで15〜20分間インキュベートし、マトリゲルを重合させます。
  6. 滅菌鉗子を使用して、マトリゲル液滴で埋め込みシートを持ち上げます。シートを6ウェルの超低接着プレートの1ウェルの真上に保持します。10 ng/mL の脳由来神経栄養因子(BDNF)と 10 ng/mL のグリア細胞株由来神経栄養因子(GDNF)を含む 3 mL の CDM をピペットで取り込み、シートから各ウェルにマトリゲル液滴を穏やかにすすぎます。このプロセスを繰り返して、すべての6〜8個のマトリゲル液滴が1つのウェルに移されます。
  7. プレートを 85 rpm の 37 °C インキュベーターのオービタルシェーカーに置き、CDM を 10 ng/mL BDNF と 10 ng/mL GDNF に 3 日ごとに交換します。
    注:差別化された文化を最大3か月間維持します。神経形態は、終了後2週間後に現れます。BDNFおよびGDNFは、3ヶ月以上の培養には必要ありません。

6. 免疫蛍光染色

  1. 1,000 μLのピペットを使用して、培地からオルガノイドを静かに取り出し、最小限の培地で顕微鏡スライドに静かに置きます。
  2. RTで完全に風乾させ、4%パラホルムアルデヒド(PFA)(サンプルあたり300μL)を30分間加えます。
    注:PFAは危険であり、発がん性を有する可能性があります。取り扱いには注意し、皮膚や目に直接触れないようにし、化学ドラフト内での使用を確認してください。
  3. スライドに30%スクロース溶液(サンプルあたり300 μL)を加え、4°Cで一晩インキュベートします。
  4. PBS(Ca2+/Mg2+)、0.3% Triton X-100、および10%正常ヤギ血清を含むブロッキングバッファー(BB)(サンプルあたり300 μL)を室温で2時間(または4°Cで一晩)添加して、オルガノイドをブロックし、浸透させます。疎水性バリアペンを使用してオルガノイドを描き、スライド上にバッファーを閉じ込めます。
  5. ブロッキングバッファー(サンプルあたり300 μL)、抗フォークヘッドボックスタンパク質G1(FOXG1、1:200)、抗矯正歯科ホメオボックス2(OTX2、1:100)、抗フォークヘッドボックスA2(FOXA2、1:100)、抗チロシンヒドロキシラーゼ(TH、1:100)、抗SRY(性決定領域Y)-ボックス2(SOX2、1:100)、抗ペアボックスタンパク質(PAX6、1:100)、および抗微小管関連タンパク質2(MAP2 1:500)でサンプルを覆います。 暗所で4°Cで一晩インキュベートします( 材料表を参照)。
  6. サンプルを1x PBSで3時間洗浄し、緩やかに揺さぶるプラットフォームで2〜3回のバッファー交換を行います。
  7. 二次抗体(サンプルあたり300 μL)、抗Alexa Fluor 488(1:800)、抗Alexa Fluor 594(1:800)、および抗Alexa Fluor 647(1:800)と加湿した暗室で4°Cで一晩インキュベートします。Hoechst 33342 (1:5,000) 核染色剤を同時に追加します ( 材料の表を参照)。
  8. 抗体を取り出し、PBSで素早くすすぎ、続いて0.01%アジ化ナトリウムを含むPBSを4°Cで1〜2日間添加して汚染を抑制します。
  9. PBSを吸引し、余分な溶液を取り除き、封入剤を使用してオルガノイドをマウントします( 材料表を参照)。気泡の形成を防ぐためにカバースリップを置き、埋入剤が完全に重合するまで、RTの暗室に少なくとも12時間保管してください。
    注:これで、標本を蛍光顕微鏡で観察する準備が整いました。

結果

本研究では、iPS細胞からMOを導出するための先駆的なプロトコールを紹介します。私たちの方法論の中心は、FGF-8bおよびソニックヘッジホッグ(SHH)経路アゴニストであるプルモルファミン(PM)と相乗的に組み合わせたデュアルSMAD阻害の革新的な使用です。このアプローチを 図 1 に示します。分化プロセスは、iPS細胞を神経外胚葉系統に誘導し、?...

ディスカッション

本研究では、MOとiPS細胞の鑑別方法を開発しました。私たちのプロトコルは、FGF-8bやSHHアゴニストPMなどの形態形成因子で強化されたデュアルSMAD阻害戦略を採用しています。このアプローチは、中脳の個体発生に重要な発生の手がかりを密接にシミュレートします。私たちが確立した分化経路は、自然な脳の発達中に観察される神経ロゼットを連想させる神経上皮構?...

開示事項

著者には、開示すべき利益相反はありません。

謝辞

図 1 は BioRender.com を使用して作成されています。資金提供いただいたUniversity of Bergen Meltzers Høyskolefonds氏(プロジェクト番号:103517133)、Gerda Meyer Nyquist Guldbrandson氏、Gerdt Meyer Nyquists legat氏(プロジェクト番号:103816102)に感謝します。

資料

NameCompanyCatalog NumberComments
CCD Microscope Camera Leica DFC3000 GLeica Microsystems, Germany
Chemically Defined Lipid ConcentrateThermo Fisher Scientific11905031CDM ingredient
Collagenase  IVThermo Fisher Scientific17104019Reagent for gentle dissociation of human iPSCs
Corning non-treated culture dishesSigma-AldrichCLS430589Suspension culture 
DMEM/F-12, GlutaMAX supplementThermo Fisher Scientific10565018Astrocyte differentiation basal Medium
DPBSThermo Fisher Scientific14190250Used for a variety of cell culture wash
EDTAThermo Fisher Scientific15575020Reagent for gentle dissociation of human iPSCs
Essential 8 Basal MediumThermo Fisher ScientificA1516901Basal medium for iPSC culture
Essential 8 Supplement (50x)Thermo Fisher ScientificA1517101Supplement for iPSC culture
FCCPAbcamab120081Eliminates mitochondrial membrane potential and TMRE staining
FGF-basicPeproTech100-18BAstrocyte differentiation medium ingredient
Fluid aspiration system BVC controlVacuubrand, Germany
Formaldehyde (PFA) 16%Thermo Fisher Scientific28908Cell fixation 
GDNFPeprotech450-10DA neurons medium ingredient
Geltrex (Basement membrane matrix)Thermo Fisher ScientificA1413302Used for attachment and maintenance of human iPSCs
GlutaMAX SupplementThermo Fisher Scientific35050061Supplement for NSC culture
Heracell 150i CO2 IncubatorsFisher Scientific, USA
IMDMThermo Fisher Scientific21980032Basal medium for CDM
InSolution AMPK InhibitorSigma-Aldrich171261Neural induction medium ingredient
InsulinRoche1376497CDM ingredient
iPSCs derived from Detroit 551 fibroblats ATCCCCL-110
Leica TCS SP8 STED confocal microscopeLeica Microsystems, Germany
MatrigelLife Science354230Matrigel embedding
MonothioglycerolSigma-AldrichM6145CDM ingredient
Normal goat serumThermo Fisher ScientificPCN5000Used for blocking buffer
Orbital shakers - SSM1Stuart Equipment, UK
Organoid Embedding SheetSTEMCELL Technologies8579Matrigel embedding
Organoid Embedding SheetSTEMCELL Technologies 8579
PBS 1xThermo Fisher Scientific18912014Used for a variety of washes
Poly-D-lysine hydrobromideSigma-AldrichP7405Promotes attachment and growth of neural cells in vitro
Poly-L-ornithine solutionSigma-AldrichP4957Promotes attachment and growth of neural cells in vitro
ProLong Gold Antifade MountantThermo Fisher ScientificP36930Mounting the coverslip for confocal image
PurmorphamineSTEMCELL Technologies72204Promotes DA neuron differentiation
Recombinant Human/Mouse FGF-8b Protein R&D Systems423-F8-025/CFPromotes DA neuron differentiation 
SB 431542Tocris BioscienceTB1614-GMPNeural Induction Medium ingredient
TRITON X-100VWR International9002-93-1Used for cells permeabilization in immunostaining assays
SSM1 compact orbital shaker Norrscope51901-10 SSM1 Shaker, orbital, mini 230VRotator for organoid culturing.
Water Bath Jb Academy Basic Jba5 JBA5 Grant InstrumentsGrant Instruments, USA
Antibodies used for immunostaining
Primary antibody
anti-DATAbcamab128848, RRID:AB_2665470Rabbit; 1:100 
anti-FOXA2ProteinTech22474-1-AP, RRID:AB_2879110Rabbit; 1:100 
anti-FOXG1Abcamab196868, RRID:AB_2892604Rabbit; 1:200
anti-LMX1Abcamab139726, RRID:AB_2827684Rabbit; 1:100 
anti-MAP2Abcamab5392 ,RRID:AB_2138153Chicken; 1:500
anti-OTX2ProteinTech13497-1-AP, RRID:AB_2157176Rabbit; 1:100 
anti-THAbcamab75875, RRID:AB_1310786Rabbit; 1:100 
Secondary antibodyDilution (μL)
 Alexa Fluor  594 goat anti-rabbit IgGThermo Fisher ScientificA-11012 1:400
Alexa Fluor  488 goat anti-rabbit IgGThermo Fisher ScientificA- 11008 1:400
Alexa Fluor  488 goat anti-rabbit IgGThermo Fisher ScientificA- 11008 1:400
Alexa Fluor  488 goat anti-rabbit IgGThermo Fisher ScientificA- 11008 1:400
Alexa Fluor  594 goat anti-rabbit IgG Thermo Fisher ScientificA-11012 1:400
Alexa Fluor  594 goat anti-rabbit IgG Thermo Fisher ScientificA-11012 1:400
Alexa Fluor  647 goat anti-chicken IgG Thermo Fisher ScientificA-21469 1:400

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