JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Этот протокол описывает новый метод создания трехмерных органоидов среднего мозга из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток человека, направляя их формирование таким образом, чтобы имитировать нативную ткань среднего мозга, тем самым помогая в изучении развития и нарушений.

Аннотация

Разработка органоидов среднего мозга (МО) из плюрипотентных стволовых клеток человека (ПСК) представляет собой значительный прогресс в понимании развития мозга, способствуя точному моделированию заболеваний и продвигая терапевтические исследования. В этом протоколе описан метод получения специфичных для среднего мозга органоидов с использованием индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (ИПСК) с использованием стратегического подхода к дифференцировке. Ключевые методы включают двойное ингибирование SMAD для подавления передачи сигналов SMAD, введение фактора роста фибробластов 8b (FGF-8b) и активацию пути Sonic Hedgehog с использованием агониста пурморфамина, направляя ИПСК к судьбе среднего мозга.

Органоиды, полученные с помощью этого метода, достигают диаметра до 2 мм и включают в себя разнообразный набор типов нейроэпителиальных клеток, отражая присущее среднемозговому мозгу клеточное разнообразие. Валидация этих органоидов в качестве аутентичных структур среднего мозга включает в себя экспрессию специфичных для среднего мозга маркеров, подтверждающих их идентичность. Примечательным результатом этой методики является эффективная дифференцировка ИПСК в дофаминергические нейроны, характерные для среднего мозга.

Значение этого протокола заключается в его способности производить функционально зрелые, специфичные для среднего мозга органоиды, которые точно повторяют основные аспекты среднего мозга, предлагая ценную модель для глубокого исследования процессов развития среднего мозга и патофизиологии связанных с ними расстройств, таких как болезнь Паркинсона. Таким образом, этот протокол служит важнейшим ресурсом для исследователей, стремящихся улучшить наше понимание человеческого мозга и разработать новые методы лечения нейродегенеративных заболеваний, что делает его незаменимым инструментом в области неврологических исследований.

Введение

Человеческий мозг с его сложной архитектурой и сложным клеточным и молекулярным составом представляет собой огромную проблему в исследованиях в области нейробиологии, особенно в контексте моделирования заболеванийи разработки клеточной терапии. Эти проблемы еще больше осложняются ограниченной доступностью сложных моделей in vitro, которые действительно представляют сложность человеческого мозга. Тем не менее, недавние достижения в технологии индуцированных плюрипотентных стволовых клеток человека (iPSC), позволяющие контролировать дифференцировку в конкретные подтипы нейронов, открыли многообещающие возможности для изучения развития мозга человека, патогенеза заболеваний и клеточных терапевтических стратегий.

Традиционно, двумерные (2D) нейронные культуры, полученные из ИПСК были краеугольным камнем исследований in vitro, направленных на имитацию физиологии и патологии нейронов человека. Эти монослойные культуры сыграли важную роль в улучшении нашего понимания неврологических заболеваний и в открытии нейропротекторных агентов 2,3,4,5,6,7. Несмотря на свою полезность, эти двухмерные системы не в состоянии эмулировать истинное клеточное разнообразие и трехмерную (3D) структуру человеческого мозга.

Появление технологии органоидов мозга представляет собой значительный скачок в моделировании in vitro, предоставляя инструмент, который точно имитирует сложную биологию человеческого мозга в рамках физиологически релевантнойструктуры. Ранние методы развития органоидов мозга использовали присущие ИПСК регуляторные свойства спонтанно образовывать производные эктодермы, тем самым имитируя ранние стадии развития мозга 5,9,10,11,12. Учитывая сложные сети, образованные нейронами с другими нейронными и ненейрональными клетками, 3D-моделирование становится необходимым для точного изучения нейродегенеративных заболеваний. 3D-культуры обеспечивают более репрезентативную среду in vivo, способствуя ускоренной дифференцировке нейронов и формированию сетей 12,13,14, а также способствуют более широкой экспрессии нейрональных генов по сравнению с 2D-культурами 15. Нейроны, разработанные в 3D-контекстах, приобретают морфологию и физиологические атрибуты, более напоминающие их аналоги in vivo.

Последние достижения в области 3D-моделей мозга сыграли ключевую роль в более эффективном отражении пространственной и функциональной сложности человеческого мозга. За последнее десятилетие развитие различных протоколов для создания как органоидов всего мозга, так и регионально-специфичных моделей мозга 11,17,18,19,20,21,22 оказалось неоценимым в моделировании неврологических расстройств, таких как микроцефалия11, болезнь Альцгеймера 14,23 и болезнь Паркинсона24. Целью данного протокола является разработка и совершенствование метода создания 3D человеческих МО, полученных из человеческих ИПСК. Этот протокол специально направлен на создание органоидов, обогащенных дофаминергическими нейронами и пространственно организованных таким образом, чтобы точно имитировать естественную структуру и функциональность среднего мозга человека. Основная цель этих органоидов состоит в том, чтобы служить передовыми моделями in vitro для изучения болезни Паркинсона, обеспечивая более точную и физиологически актуальную систему для изучения процессов развития нервной системы и патологий, связанных с этим состоянием. Используя полученные от пациента иПСК для создания этих органоидов, специфичных для среднего мозга, протокол направлен на улучшение понимания механизмов болезни Паркинсона, облегчение обнаружения потенциальных терапевтических мишеней и улучшение разработки клеточной терапии. Благодаря этому инновационному подходу протокол направлен на преодоление ограничений традиционных 2D-культур нейронов и внесение значительного вклада в область исследований нейродегенеративных заболеваний, предлагая мощный инструмент для моделирования заболеваний in vitro и изучения новых стратегий лечения.

За последние 10 лет различные исследовательские группы разработали органоиды среднего мозга (МО)8,21,25,26,27,28, используя методологии, которые демонстрируют несколько ключевых сходств. Стремясь углубить понимание болезни Паркинсона, мы разработали протокол для создания 3D-человеческих МО, полученных из человеческих ИПСК. Эти органоиды, обогащенные пространственно расположенными дофаминергическими нейронами, представляют собой идеальную модель для изучения болезни Паркинсона. Наша разработка и совершенствование протоколов органоидов, специфичных для среднего мозга, привели к созданию передовых моделей in vitro, которые внесли значительный вклад в наше понимание процессов развития нервной системы и нейродегенеративных заболеваний. Эти модели, особенно применительно к полученным от пациента МО, продемонстрировали свою эффективность в качестве мощных инструментов для моделирования заболеваний in vitro, предлагая новые перспективы и методологии в области передовых 3D-клеточных культур.

протокол

ИПСК получены из нормальных фибробластов человека Detroit 551 и человеческих эмбриональных стволовых клеток (ЭСК) линии hESC 360, как описано ранее4. ИПСК были получены с одобрения Комитета по этическим исследованиям в области здоровья Западной Норвегии REK nr. 2012/919. Все клетки регулярно контролировались на предмет контаминации микоплазмой с помощью набора для обнаружения микоплазмы MycoAlert. Таблица материалов содержит информацию обо всех материалах, реагентах и оборудовании, используемых в данном протоколе. В таблице 1 приведены используемые носители и другие материалы.

1. Размораживание ИПСК

  1. Пластина с матричным покрытием и основной 8 (E8) средний препарат
    1. Разморозьте флакон с базальной мембраной на льду на ночь. Разведите 1:100 в холодном Advanced Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)/Ham's F12 DMEM/F12 (1% конечной концентрации) (см. Таблицу материалов и Таблицу 1). Хранить аликвоты при температуре -20 °C для длительного использования.
    2. Разморозьте разбавленную базальную мембрану при 4 °C; Нанесите на 6-луночный планшет 1 мл раствора на лунку. Выдерживать при 37 °C в течение 1 ч.
    3. Извлеките пластину из инкубатора и дайте ей сбалансироваться до комнатной температуры (RT).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Тарелки можно хранить в холодильнике не более 2 недель (перед использованием убедитесь, что они прогреты до RT). Для длительного хранения добавьте 1 мл E8 Medium (см. Таблицу материалов и Таблицу 1) в пластину с покрытием, чтобы избежать высыхания геля.
  2. Подготовка среды Е8
    1. В стерильных условиях сочетайте базальную среду Е8 с добавкой Е8 (см. Таблицу материалов и Таблицу 1).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Его можно хранить при температуре 4 °C в течение 2 недель. Разморозьте замороженную добавку E8 в течение ночи при температуре 4 °C перед приготовлением полной среды. Не размораживайте при 37 °C, так как это может нарушить его стабильность. Перед использованием нагрейте только необходимый объем E8 средней и комнатной температуры (RT) до тех пор, пока он не перестанет быть холодным на ощупь.

2. Посев ИПСК

  1. Подогрейте планшеты с матричным покрытием и E8 Medium в режиме RT или инкубаторе при 37 °C.
  2. Аспиратная питательная среда; промыть иПСК, конфлюенция которых составляет 60%-70%, фосфатно-солевым буфером Дульбекко без кальция и магния (DPBS Ca2+/Mg2+-free,4 мл на лунку в 6-луночном планшете).
  3. Добавить этилендиаминтетрауксусную кислоту (ЭДТА, 0,5 мМ, 1 мл на лунку, см. Таблицу материалов и Таблицу 1); Инкубировать при 37 °C до тех пор, пока края колонии не отделятся (3-5 мин).
  4. Отсасывайте диссоциативный раствор; Чтобы отделить колонии, осторожно направьте предварительно подогретую среду E8 (4 мл на лунку) непосредственно на колонии с более сильной, чем обычно, силой пипетки, которая создает локализованное движение жидкости по поверхности клетки.
  5. Разделите ячейки в соотношении 1:2, перенеся их в две новые лунки из 6-луночного планшета с матричным покрытием, добавив 2 мл среды на лунку. Затем инкубируйте при 37 °C.
  6. Обменивайтесь носителями ежедневно, пока колонии не достигнут 80% слияния.
  7. Используя микроскоп с 10-кратным увеличением, понаблюдайте за колониями, чтобы убедиться, что они имеют соответствующий размер, обычно характеризующийся отчетливой круглой формой диаметром от 0,5 до 1 мм. Убедитесь, что колонии представляют собой плотные, компактные структуры с очерченными, плавными границами.

3. Нейронная индукция

  1. Подготовка к середине и подготовка к дню 0
    1. Приготовьте по 500 мл химически определенной среды (CDM), нервной индукционной среды (NIM) и среды, не содержащей сыворотки нейронных стволовых клеток (NSC SF), в соответствии с Таблицей материалов и Таблицей 1.
    2. Промойте клетки в 6-луночном планшете 4 мл DPBS (1x) (Ca2+/Mg2+- free) на лунку, а затем добавьте 3 мл NIM на лунку для установки в день 0.
    3. Замените NIM (3 мл на лунку) в 1, 3 и 5 дни; Ежедневно наблюдайте под микроскопом.
    4. На 6-й день отделите нейронные розетки в культуру суспензии, выполнив следующие действия.
      1. Аккуратно промойте один раз DPBS (1x) (Ca2+/Mg2+-free) (4 мл на лунку в 6-луночном планшете). Добавьте коллагеназу в/в (1 мл на лунку в 6-луночном планшете) и инкубируйте в течение 1 минуты. Удалите коллагеназу внутривенно и аккуратно промойте один раз DPBS (1x) (Ca2+/Mg2+-free) (4 мл на лунку в 6-луночном планшете).
      2. Добавьте по 2 мл NSC SF Medium в каждую лунку 6-луночного планшета. Отделите ячейки, соскребая дно лунок, создав сетки с наконечником для пипетки объемом 200 мкл.
      3. Переложите клеточную суспензию из 6-луночного планшета в 10-сантиметровую неадгезивную посуду. Отрегулируйте объем до 12 мл с помощью NSC SF Medium.
      4. Поместите неадгезивную чашку на шейкер (компактный орбитальный шейкер ssm1) со скоростью 85 об/мин под углом 0° в инкубатор, установленный на 37 °C с 5%CO2 , чтобы предотвратить скопление.

4. Структурирование среднего мозга

  1. На 7-й день добавьте 12 мл CDM со 100 нг/мл FGF-8b; Поместите на орбитальный вибростенд-инкубатор.
  2. На 8-13 день меняйте носитель каждые 2 дня; Наблюдайте под микроскопом ежедневно.
  3. На 14-й день добавьте 12 мл CDM со 100 нг/мл FGF-8b и 1 μМ пурморфамином (PM); Поместите на орбитальный встряхиватель.
  4. На 15-20 день меняйте носитель каждые 2 дня; Наблюдайте под микроскопом ежедневно.

5. Встраивание Matrigel и терминация и созревание MO

  1. Матригель разморозить на льду при температуре от 2 °C до 8 °C в течение 1-2 часов.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Разморозьте достаточное количество Матригеля, чтобы обеспечить 15 мкл для каждого эмбриоидного тела (БЭ). Храните Матригель охлажденным на льду, чтобы избежать ранней полимеризации. Охладите всю пластиковую посуду, которая будет контактировать с Matrigel, до -20 °C в течение минимум 30 минут перед использованием.
  2. Положите стерильный лист для заделки органоидов в пустую миску.
  3. С помощью наконечника для дозатора с широким отверстием объемом 200 мкл аккуратно извлеките органоид из чашки и перенесите его на закладную поверхность с помощью одного органоида на лунку. Повторяйте этот процесс до тех пор, пока на поверхности заделки не соберется 12-16 EB.
  4. Осторожно удалите излишки среды из каждого ЭБ, а затем добавьте 15 мкл холодного Матригеля по каплям на каждый ЭБ. С помощью пипетки переместите EB к центру капли Matrigel.
  5. Инкубируйте планшет в инкубаторе, установленном при температуре 37 °C, в течение 15-20 минут, чтобы дать Матригелю полимеризоваться.
  6. С помощью стерильных щипцов приподнимите закладной лист с каплями Матригеля. Держите лист прямо над одной лункой в 6-луночной пластине со сверхнизкой адгезией. Нанесите пипеткой 3 мл CDM с концентрацией 10 нг/мл нейротрофического фактора мозга (BDNF) и нейротрофического фактора (GDNF) глиальной клеточной линии с концентрацией 10 нг/мл и аккуратно промойте капли Matrigel с листа в каждую лунку. Повторяйте этот процесс до тех пор, пока все 6-8 капель Матригеля не перейдут в одну лунку.
  7. Поместите планшеты на орбитальный шейкер в инкубатор при температуре 37 °C при 85 об/мин и меняйте CDM на 10 нг/мл BDNF и 10 нг/мл GDNF каждые 3 дня.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Поддерживайте дифференцирующие культуры до 3 месяцев; Нейронная морфология проявляется через 2 недели после прерывания беременности. BDNF и GDNF не требуются для выращивания более 3 месяцев.

6. Иммунофлюоресцентное окрашивание

  1. С помощью пипетки объемом 1 000 мкл аккуратно извлеките органоид из среды и аккуратно поместите его на предметное стекло микроскопа с минимальным количеством среды.
  2. Дайте ему полностью высохнуть на воздухе при RT. Добавьте 4% параформальдегид (PFA) (300 μл на образец) в течение 30 минут.
    ПРИМЕЧАНИЕ: ПФА опасен и может обладать канцерогенными свойствами. Обращайтесь с ним с осторожностью, воздерживайтесь от прямого контакта с кожей и глазами и обеспечьте использование в вытяжном шкафу для химикатов.
  3. Добавьте 30% раствор сахарозы (300 μл на образец) в предметные стекла и дайте им инкубироваться в течение ночи при 4 °C.
  4. Блокируйте и проникайте в органоиды, добавляя блокирующий буфер (BB) (300 мкл на образец), который включает PBS (с Ca2+/Mg2+), 0,3% Triton X-100 и 10% обычной козьей сыворотки, в течение 2 ч при RT (или на ночь при 4 °C). Используйте гидрофобную барьерную ручку, чтобы разграничить органоиды и ограничить буфер на предметном стекле.
  5. Покройте образцы соответствующим объемом первичного антитела в блокирующем буфере (300 мкл на образец), анти-вилочном бокс-белке G1 (FOXG1, 1:200), антиортодентальном гомеобоксе 2 (OTX2, 1:100), анти-вилочном боксе A2 (FOXA2, 1:100), антитирозингидроксилазе (TH, 1:100), анти-SRY (область определения пола Y)-боксе 2 (SOX2, 1:100), антипарном бокс-белке (PAX6, 1:100) и антимикротрубочном ассоциированном белке 2 (MAP2 1:500), и инкубировать в течение ночи при температуре 4 °C в темное время суток (см. Таблицу материалов).
  6. Промойте образцы в 1x PBS в течение 3 часов с двумя-тремя сменами буфера на мягко покачивающейся платформе.
  7. Инкубируйте с вторичным антителом (300 мкл на образец), анти-Alexa Fluor 488 (1:800), анти-Alexa Fluor 594 (1:800) и анти-Alexa Fluor 647 (1:800) в течение ночи при 4 °C во влажной темной комнате. Добавьте одновременно ядерное пятно Hoechst 33342 (1:5,000) (см. Таблицу материалов).
  8. Удалите антитело, быстро промойте PBS, а затем добавьте PBS, содержащий 0,01% азида натрия, в течение 1-2 дней при 4 °C для ингибирования загрязнения.
  9. Отсадите PBS, удалите излишки раствора и установите органоиды с помощью монтажной среды (см. Таблицу материалов). Установите покровное стекло, предотвращая образование пузырьков воздуха, и храните в темной комнате при температуре RT не менее 12 часов, чтобы монтажная среда полностью полимеризовалась.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Теперь образец готов к наблюдению с помощью флуоресцентного микроскопа.

Результаты

В этом исследовании мы представляем новаторский протокол для получения MO из iPSCs. Центральное место в нашей методологии занимает инновационное использование двойного ингибирования SMAD, синергетически сочетающегося с FGF-8b и агонистом пути звукового ежа (SHH) пурморфамин?...

Обсуждение

В этом исследовании мы разработали методологию дифференциации МО от ИПССК. В нашем протоколе используется стратегия двойного ингибирования SMAD, усиленная морфогенными факторами, включая FGF-8b и агонист SHH PM. Этот подход точно имитирует сигналы развития, имеющие решающе...

Раскрытие информации

У авторов нет конфликта интересов, который можно было бы раскрыть.

Благодарности

Рисунок 1 создан с использованием BioRender.com. Мы благодарим University of Bergen Meltzers Høyskolefonds (номер проекта: 103517133), Герду Мейер Найквист Гульдбрандсон и Гердта Мейера Nyquists legat (номер проекта: 103816102) за финансирование.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
CCD Microscope Camera Leica DFC3000 GLeica Microsystems, Germany
Chemically Defined Lipid ConcentrateThermo Fisher Scientific11905031CDM ingredient
Collagenase  IVThermo Fisher Scientific17104019Reagent for gentle dissociation of human iPSCs
Corning non-treated culture dishesSigma-AldrichCLS430589Suspension culture 
DMEM/F-12, GlutaMAX supplementThermo Fisher Scientific10565018Astrocyte differentiation basal Medium
DPBSThermo Fisher Scientific14190250Used for a variety of cell culture wash
EDTAThermo Fisher Scientific15575020Reagent for gentle dissociation of human iPSCs
Essential 8 Basal MediumThermo Fisher ScientificA1516901Basal medium for iPSC culture
Essential 8 Supplement (50x)Thermo Fisher ScientificA1517101Supplement for iPSC culture
FCCPAbcamab120081Eliminates mitochondrial membrane potential and TMRE staining
FGF-basicPeproTech100-18BAstrocyte differentiation medium ingredient
Fluid aspiration system BVC controlVacuubrand, Germany
Formaldehyde (PFA) 16%Thermo Fisher Scientific28908Cell fixation 
GDNFPeprotech450-10DA neurons medium ingredient
Geltrex (Basement membrane matrix)Thermo Fisher ScientificA1413302Used for attachment and maintenance of human iPSCs
GlutaMAX SupplementThermo Fisher Scientific35050061Supplement for NSC culture
Heracell 150i CO2 IncubatorsFisher Scientific, USA
IMDMThermo Fisher Scientific21980032Basal medium for CDM
InSolution AMPK InhibitorSigma-Aldrich171261Neural induction medium ingredient
InsulinRoche1376497CDM ingredient
iPSCs derived from Detroit 551 fibroblats ATCCCCL-110
Leica TCS SP8 STED confocal microscopeLeica Microsystems, Germany
MatrigelLife Science354230Matrigel embedding
MonothioglycerolSigma-AldrichM6145CDM ingredient
Normal goat serumThermo Fisher ScientificPCN5000Used for blocking buffer
Orbital shakers - SSM1Stuart Equipment, UK
Organoid Embedding SheetSTEMCELL Technologies8579Matrigel embedding
Organoid Embedding SheetSTEMCELL Technologies 8579
PBS 1xThermo Fisher Scientific18912014Used for a variety of washes
Poly-D-lysine hydrobromideSigma-AldrichP7405Promotes attachment and growth of neural cells in vitro
Poly-L-ornithine solutionSigma-AldrichP4957Promotes attachment and growth of neural cells in vitro
ProLong Gold Antifade MountantThermo Fisher ScientificP36930Mounting the coverslip for confocal image
PurmorphamineSTEMCELL Technologies72204Promotes DA neuron differentiation
Recombinant Human/Mouse FGF-8b Protein R&D Systems423-F8-025/CFPromotes DA neuron differentiation 
SB 431542Tocris BioscienceTB1614-GMPNeural Induction Medium ingredient
TRITON X-100VWR International9002-93-1Used for cells permeabilization in immunostaining assays
SSM1 compact orbital shaker Norrscope51901-10 SSM1 Shaker, orbital, mini 230VRotator for organoid culturing.
Water Bath Jb Academy Basic Jba5 JBA5 Grant InstrumentsGrant Instruments, USA
Antibodies used for immunostaining
Primary antibody
anti-DATAbcamab128848, RRID:AB_2665470Rabbit; 1:100 
anti-FOXA2ProteinTech22474-1-AP, RRID:AB_2879110Rabbit; 1:100 
anti-FOXG1Abcamab196868, RRID:AB_2892604Rabbit; 1:200
anti-LMX1Abcamab139726, RRID:AB_2827684Rabbit; 1:100 
anti-MAP2Abcamab5392 ,RRID:AB_2138153Chicken; 1:500
anti-OTX2ProteinTech13497-1-AP, RRID:AB_2157176Rabbit; 1:100 
anti-THAbcamab75875, RRID:AB_1310786Rabbit; 1:100 
Secondary antibodyDilution (μL)
 Alexa Fluor  594 goat anti-rabbit IgGThermo Fisher ScientificA-11012 1:400
Alexa Fluor  488 goat anti-rabbit IgGThermo Fisher ScientificA- 11008 1:400
Alexa Fluor  488 goat anti-rabbit IgGThermo Fisher ScientificA- 11008 1:400
Alexa Fluor  488 goat anti-rabbit IgGThermo Fisher ScientificA- 11008 1:400
Alexa Fluor  594 goat anti-rabbit IgG Thermo Fisher ScientificA-11012 1:400
Alexa Fluor  594 goat anti-rabbit IgG Thermo Fisher ScientificA-11012 1:400
Alexa Fluor  647 goat anti-chicken IgG Thermo Fisher ScientificA-21469 1:400

Ссылки

  1. Markram, H. Seven challenges for neuroscience. Funct Neurol. 28 (3), 145-151 (2013).
  2. Liang, K. X., et al. N-acetylcysteine amide ameliorates mitochondrial dysfunction and reduces oxidative stress in hiPSC-derived dopaminergic neurons with POLG mutation. Exp Neurol. 33 (7), 113-536 (2021).
  3. Chen, A., et al. Nicotinamide riboside and metformin ameliorate mitophagy defect in induced pluripotent stem cell-derived astrocytes with POLG mutations. Front Cell Dev Biol. 9, 304-737 (2021).
  4. Liang, K. X., et al. Disease-specific phenotypes in iPSC-derived neural stem cells with POLG mutations. EMBO Mol Med. 12 (10), 121-146 (2020).
  5. Xu, P., et al. Human midbrain dopaminergic neuronal differentiation markers predict cell therapy outcomes in a Parkinson's disease model. J Clin Invest. 132 (14), 156-768 (2022).
  6. Cooper, O., et al. Pharmacological rescue of mitochondrial deficits in iPSC-derived neural cells from patients with familial Parkinson's disease. Sci Transl Med. 4 (141), 141-190 (2012).
  7. Nguyen, H. N., et al. LRRK2 mutant iPSC-derived DA neurons demonstrate increased susceptibility to oxidative stress. Cell Stem Cell. 8 (3), 267-280 (2011).
  8. Fiorenzano, A., et al. Single-cell transcriptomics captures features of human midbrain development and dopamine neuron diversity in brain organoids. Nat Commun. 12 (1), 73-102 (2021).
  9. Velasco, S., et al. Individual brain organoids reproducibly form cell diversity of the human cerebral cortex. Nature. 570 (7762), 523-527 (2019).
  10. Qian, X., Song, H., Ming, G. L. Brain organoids: advances, applications and challenges. Development. 146 (8), dev166074 (2019).
  11. Lancaster, M. A., et al. Cerebral organoids model human brain development and microcephaly. Nature. 501 (7467), 373-379 (2013).
  12. Shariati, L., Esmaeili, Y., Haghjooy Javanmard, S., Bidram, E., Amini, A. Organoid technology: Current standing and future perspectives. Stem Cells. 39 (12), 1625-1649 (2021).
  13. Haycock, J. W. 3D cell culture: a review of current approaches and techniques. Methods Mol Biol. 695, 1-15 (2011).
  14. D'Avanzo, C., et al. Alzheimer's in 3D culture: challenges and perspectives. Bioessays. 37 (10), 1139-1148 (2015).
  15. Sun, A. X., Ng, H. H., Tan, E. K. Translational potential of human brain organoids. Ann Clin Transl Neurol. 5 (2), 226-235 (2018).
  16. Del Dosso, A., Urenda, J. P., Nguyen, T., Quadrato, G. Upgrading the physiological relevance of human brain organoids. Neuron. 107 (6), 1014-1028 (2020).
  17. Pasca, A. M., et al. Functional cortical neurons and astrocytes from human pluripotent stem cells in 3D culture. Nat Methods. 12 (7), 671-678 (2015).
  18. Asgrimsdottir, E. S., Arenas, E. Midbrain dopaminergic neuron development at the single cell level: In vivo and in stem cells. Front Cell Dev Biol. 8, 463 (2020).
  19. Zagare, A., et al. Midbrain organoids mimic early embryonic neurodevelopment and recapitulate LRRK2-p.Gly2019Ser-associated gene expression. Am J Hum Genet. 109 (2), 311-327 (2022).
  20. Mohamed, N. V., et al. Midbrain organoids with an SNCA gene triplication model key features of synucleinopathy. Brain Commun. 3 (4), fcab223 (2021).
  21. Jo, J., et al. Midbrain-like organoids from human pluripotent stem cells contain functional dopaminergic and neuromelanin-producing neurons. Cell Stem Cell. 19 (2), 248-257 (2016).
  22. Kwak, T. H., et al. Generation of homogeneous midbrain organoids with in vivo-like cellular composition facilitates neurotoxin-based Parkinson's disease modeling. Stem Cells. 38 (6), 727-740 (2020).
  23. Karmirian, K., et al. Modeling Alzheimer's disease using human brain organoids. Methods Mol Biol. 2561, 135-158 (2023).
  24. Smits, L. M., et al. Modeling Parkinson's disease in midbrain-like organoids. NPJ Parkinsons Dis. 5, 5 (2019).
  25. Qian, X., et al. Brain-region-specific organoids using mini-bioreactors for modeling ZIKV exposure. Cell. 165 (5), 1238-1254 (2016).
  26. Smits, L. M., et al. Single-cell transcriptomics reveals multiple neuronal cell types in human midbrain-specific organoids. Cell Tissue Res. 382 (3), 463-476 (2020).
  27. Sozzi, E., Nilsson, F., Kajtez, J., Parmar, M., Fiorenzano, A. Generation of human ventral midbrain organoids derived from pluripotent stem cells. Curr Protoc. 2 (9), 555 (2022).
  28. Tieng, V., et al. Engineering of midbrain organoids containing long-lived dopaminergic neurons. Stem Cells Dev. 23 (13), 1535-1547 (2014).
  29. Chambers, S. M., et al. Highly efficient neural conversion of human ES and iPS cells by dual inhibition of SMAD signaling. Nat Biotechnol. 27 (3), 275-280 (2009).
  30. Mercurio, S., Serra, L., Pagin, M., Nicolis, S. K. Deconstructing Sox2 function in brain development and disease. Cells. 11 (10), 1604 (2022).
  31. Hettige, N. C., Ernst, C. FOXG1 dose in brain development. Front Pediatr. 7, 482 (2019).
  32. Cooper, O., et al. Differentiation of human ES and Parkinson's disease iPS cells into ventral midbrain dopaminergic neurons requires a high activity form of SHH, FGF8a and specific regionalization by retinoic acid. Mol Cell Neurosci. 45 (3), 258-266 (2010).
  33. Millet, S., Bloch-Gallego, E., Simeone, A., Alvarado-Mallart, R. M. The caudal limit of Otx2 gene expression as a marker of the midbrain/hindbrain boundary: a study using in situ hybridisation and chick/quail homotopic grafts. Development. 122 (12), 3785-3797 (1996).
  34. Surmeier, D. J. Determinants of dopaminergic neuron loss in Parkinson's disease. FEBS J. 285 (19), 3657-3668 (2018).
  35. Chen, A., Yangzom, T., Sullivan, G. J., Liang, K. X. Mitochondrial dysfunction and neuronal anomalies in POLG mutant midbrain organoids. bioRxiv. , (2023).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

3DSMAD8b

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены