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요약

이 프로토콜은 인간 유도 만능 줄기 세포에서 3D 중뇌 오가노이드를 생성하는 새로운 방법을 설명하고, 천연 중뇌 조직을 모방하도록 형성을 안내하여 발달 및 장애 연구를 지원합니다.

초록

인간 만능 줄기세포(hPSC)에서 중뇌 오가노이드(MO)의 개발은 뇌 발달에 대한 이해, 정확한 질병 모델링 촉진 및 치료 연구 발전에 있어 상당한 진전을 나타냅니다. 이 프로토콜은 전략적 차별화 접근 방식을 사용하여 유도 만능 줄기 세포(iPSC)를 사용하여 중뇌 특이적 오가노이드를 생성하는 방법을 설명합니다. 주요 기술로는 SMAD 신호 전달을 억제하기 위한 이중 SMAD 억제, 섬유아세포 성장 인자 8b(FGF-8b) 투여, 작용제 푸르모르파민을 사용한 음파 고슴도치 경로 활성화가 있으며, 이는 iPSC를 중뇌의 운명으로 안내합니다.

이 방법으로 생성된 오가노이드는 최대 2mm의 직경을 달성하고 중뇌의 고유한 세포 다양성을 반영하는 다양한 신경 상피 세포 유형을 통합합니다. 이러한 오가노이드가 진정한 중뇌 구조임을 검증하려면 중뇌 특이적 마커의 발현을 통해 그 정체성을 확인하는 것이 포함됩니다. 이 방법론의 주목할 만한 결과는 iPSC가 중뇌의 특징인 도파민 뉴런으로 효과적으로 분화되었다는 것입니다.

이 프로토콜의 중요성은 중뇌의 필수 측면을 밀접하게 복제하는 기능적으로 성숙한 중뇌 특이적 오가노이드를 생성하는 능력에 있으며, 중뇌 발달 과정과 파킨슨병과 같은 관련 질환의 병태생리학에 대한 심층적인 탐구를 위한 귀중한 모델을 제공합니다. 따라서 이 프로토콜은 인간 뇌에 대한 이해를 높이고 신경퇴행성 질환에 대한 새로운 치료법을 개발하려는 연구자에게 중요한 리소스 역할을 하여 신경학 연구 분야에서 없어서는 안될 도구가 되었습니다.

서문

인간의 뇌는 복잡한 구조와 복잡한 세포 및 분자 구성을 가지고 있기 때문에 신경과학 연구, 특히 질병 모델링 및 세포 치료제 개발의 맥락에서 만만치 않은 도전 과제를 제시합니다1. 이러한 과제는 인간 두뇌의 복잡성을 진정으로 나타내는 정교한 체외 모델의 가용성이 제한되어 있기 때문에 더욱 복잡합니다. 그러나 최근 인간 유도 만능 줄기세포(iPSC) 기술의 발전으로 특정 신경 세포 아형에 대한 제어된 분화가 가능해짐에 따라 인간 뇌 발달, 질병 발병 기전 및 세포 기반 치료 전략을 탐구할 수 있는 유망한 길이 열렸습니다.

전통적으로 iPSC에서 파생된 2차원(2D) 신경 세포 배양은 인간 신경 생리학 및 병리학을 모방하는 것을 목표로 하는 체외 연구의 초석이 되어 왔습니다. 이러한 단층 배양은 신경 질환에 대한 이해를 높이고 신경 보호제인 2,3,4,5,6,7을 발견하는 데 중요한 역할을 했습니다. 이러한 2D 시스템은 유용성에도 불구하고 인간 두뇌의 진정한 세포 다양성과 3차원(3D) 구조를 모방하는 데는 부족합니다.

뇌 오가노이드 기술의 출현은 체외 모델링의 중요한 도약을 의미하며, 생리학적으로 관련된 프레임워크 내에서 인간 뇌의 복잡한 생물학을 밀접하게 모방하는 도구를 제공합니다8. 뇌 오가노이드 발달의 초기 기술은 iPSC의 고유한 조절 특성을 활용하여 자발적으로 외배엽 유도체를 형성함으로써 뇌 발달의 초기 단계를 모방했습니다 5,9,10,11,12. 뉴런이 다른 뉴런 및 비뉴런 세포와 함께 형성한 복잡한 네트워크를 감안할 때 3D 모델링은 신경퇴행성 질환을 정확하게 연구하는 데 필수적입니다. 3D 배양은 보다 대표적인 생체 내 환경을 제공하여 뉴런 분화 및 네트워크 형성을 가속화하고12,13,14 2D 배양에 비해 뉴런 유전자의 광범위한 발현을 촉진합니다 15. 3D 맥락에서 발달된 뉴런은 생체 내 뉴런을 더 연상시키는 형태와 생리학적 속성을 얻습니다16.

최근 3D 뇌 모델의 발전은 인간 두뇌의 공간적, 기능적 복잡성을 보다 효과적으로 포착하는 데 중추적인 역할을 했습니다. 지난 10년 동안 전뇌 오가노이드와 지역 특이적 뇌 모델 11,17,18,19,20,21,22을 모두 생성하기 위한 다양한 프로토콜의 발전은 소두증11, 알츠하이머병 14,23 및 파킨슨병24과 같은 신경 장애를 모델링하는 데 매우 중요하다는 것이 입증되었습니다. 이 프로토콜의 목표는 인간 iPSC에서 파생된 3D 인간 MO를 생성하는 방법을 개발하고 개선하는 것입니다. 이 프로토콜은 특히 도파민 뉴런이 풍부하고 인간 중뇌의 자연스러운 구조와 기능을 밀접하게 모방하는 방식으로 공간적으로 조직된 오가노이드를 생성하는 것을 목표로 합니다. 이러한 오가노이드의 주요 목적은 파킨슨병을 연구하기 위한 고급 체외 모델 역할을 하여 이 질환과 관련된 신경 발달 과정 및 병리학을 탐구하기 위한 보다 정확하고 생리학적으로 관련된 시스템을 제공하는 것입니다. 이 프로토콜은 환자 유래 iPSC를 활용하여 이러한 중뇌 특이적 오가노이드를 생성함으로써 파킨슨병 메커니즘에 대한 이해를 높이고, 잠재적인 치료 표적의 발견을 촉진하며, 세포 기반 치료법의 개발을 개선하고자 합니다. 이 혁신적인 접근 방식을 통해 이 프로토콜은 체외 질환 모델링 및 새로운 치료 전략 탐색을 위한 강력한 도구를 제공함으로써 기존 2D 신경 세포 배양의 한계를 극복하고 신경 퇴행성 질환 연구 분야에 크게 기여하는 것을 목표로 합니다.

지난 10년 동안 다양한 연구팀이 몇 가지 주요 유사성을 보여주는 방법론을 활용하여 중뇌 오가노이드(MO)8,21,25,26,27,28을 개발했습니다. 파킨슨병에 대한 이해를 심화하기 위한 노력의 일환으로 당사는 인간 iPSC에서 파생된 3D 인간 MO를 생성하기 위한 프로토콜을 개발했습니다. 공간적으로 배열된 도파민 뉴런이 풍부한 이러한 오가노이드는 파킨슨병을 연구하기 위한 이상적인 모델을 제시합니다. 중뇌 특이적 오가노이드 프로토콜의 개발 및 개선은 신경 발달 과정과 신경 퇴행성 질환에 대한 이해에 크게 기여한 고급 체외 모델을 산출했습니다. 이러한 모델은 특히 환자 유래 MO에 적용될 때 체외 질환 모델링을 위한 강력한 도구로서의 효능을 입증하여 고급 3D 세포 배양 분야에서 새로운 관점과 방법론을 제공합니다.

프로토콜

앞서설명한 바와 같이 인간 정상 섬유아세포 디트로이트 551 및 인간 배아 줄기세포(ESC) hESC 라인 360에서 생성된 iPSC 4. iPSC는 서노르웨이 윤리적 건강 연구 위원회(Western Norway Committee for Ethical Health Research REK nr)의 승인을 받아 획득되었습니다. 2012/919. 모든 세포는 MycoAlert Mycoplasma Detection Kit를 사용하여 Mycoplasma 오염에 대해 정기적으로 모니터링되었습니다. Table of Materials 에는 이 프로토콜에 사용되는 모든 재료, 시약 및 장비에 대한 정보가 포함되어 있습니다. 표 1 은 사용된 매체 및 기타 재고를 설명합니다.

1. iPSC의 해동

  1. 매트릭스 코팅 플레이트 및 필수 8(E8) 배지 준비
    1. 기저막 매트릭스 바이알을 얼음 위에서 밤새 해동합니다. 저온에서 1:100으로 희석합니다.Advanced Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)/Ham's F12 DMEM/F12 (1% 최종 농도) (재료 표 및 표 1 참조). 장기 사용을 위해 부분 표본을 -20 °C에서 보관하십시오.
    2. 희석 된 기저막을 4 °C에서 해동한다. 6웰 플레이트를 웰당 1mL의 용액으로 코팅합니다. 37 ° C에서 1 시간 동안 배양하십시오.
    3. 인큐베이터에서 플레이트를 제거하고 실온(RT)과 평형을 이루도록 합니다.
      알림: 플레이트는 최대 2주 동안 냉장 보관할 수 있습니다(사용하기 전에 RT로 예열해야 함). 장기간 보관하려면 코팅된 플레이트에 E8 배지 1mL( 재료 표 및 표 1 참조)를 추가하여 겔이 건조되는 것을 방지합니다.
  2. E8 배지 제제
    1. 멸균 환경에서 E8 기초 배지와 E8 보충제를 결합합니다( 재료 표 및 표 1 참조).
      알림: 4 °C에서 2 주 동안 보관할 수 있습니다. 전체 배지를 준비하기 전에 냉동 E8 보충제를 4°C에서 밤새 해동합니다. 안정성이 손상될 수 있으므로 37°C에서 해동하지 마십시오. 사용하기 전에 필요한 양의 E8 Medium만 만졌을 때 더 이상 냉각되지 않을 때까지 실온(RT)으로 가열하십시오.

2. iPSC 파종

  1. 매트릭스 코팅된 플레이트와 E8 배지를 RT에서 예열하거나 인큐베이터에서 37°C로 예열합니다.
  2. 흡인 배양 매체; 칼슘과 마그네슘이 없는 Dulbecco의 인산염 완충 식염수(DPBS Ca2+/Mg2+-free, 6-well plate의 웰당 4mL)로 60%-70% flum의 iPSC를 헹굽니다.
  3. 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA, 0.5mM, 웰당 1mL, 재료 표 및 표 1 참조)을 추가합니다. 군체 가장자리가 분리될 때까지 37°C에서 배양합니다(3-5분).
  4. 해리 솔루션을 흡인합니다. 콜로니를 분리하려면 예열된 E8 배지(웰당 4mL)를 피펫에서 평소보다 강한 힘으로 콜로니에 직접 조심스럽게 피펫팅하여 세포 표면에 국부적인 유체 운동을 생성합니다.
  5. 세포를 매트릭스로 코팅된 6-well 플레이트의 두 개의 새로운 well로 옮기고 well당 2mL의 배지를 추가하여 세포를 1:2 비율로 분할합니다. 그런 다음 37 ° C에서 배양하십시오.
  6. 군체가 80% 합류점에 도달할 때까지 매일 미디어를 교환합니다.
  7. 10배 배율의 현미경을 사용하여 군체를 관찰하여 군체가 적절한 크기인지, 일반적으로 직경이 0.5mm에서 1mm 사이인 뚜렷하고 둥근 모양이 특징인지 확인합니다. 군체가 조밀하고 조밀한 구조이며 윤곽이 뚜렷하고 부드러운 경계가 있는지 확인합니다.

3. 신경 유도

  1. 중간 준비 및 Day 0 설정
    1. 재료 표 및 표 1을 참조하여 CDM(Chemically Defined Medium), NIM(Neural Induction Medium) 및 NSC SF(Neural Stem Cell Serum-free) 배지를 각각 500mL 준비합니다.
    2. 웰당 4mL의 DPBS(1x)(Ca2+/Mg2+- free)가 포함된 6-well 플레이트에서 세포를 헹구고, Day 0 설정을 위해 well당 3mL의 NIM을 추가합니다.
    3. 1일, 3일, 5일에 NIM(웰당 3mL)을 교체합니다. 현미경으로 매일 관찰하십시오.
    4. 6일차에는 다음 단계를 사용하여 신경 로제트를 현탁 배양으로 분리합니다.
      1. DPBS(1x)(Ca2+/Mg2+-free)(6웰 플레이트에 웰당 4mL)로 한 번 부드럽게 세척합니다. 콜라겐분해효소 IV(6웰 플레이트의 웰당 1mL)를 추가하고 1분 동안 배양합니다. 콜라겐 분해 효소 IV를 제거하고 DPBS (1x) (Ca2+/Mg2+-free) (6-well plate에 웰당 4mL)로 한 번 섬세하게 헹굽니다.
      2. 2mL의 NSC SF Medium을 6웰 플레이트의 각 웰에 추가합니다. 웰 바닥을 긁어내어 세포를 분리하고 200μL 피펫 팁이 있는 그리드를 만듭니다.
      3. 6-well 플레이트의 세포 현탁액을 10cm 비접착성 접시로 옮깁니다. NSC SF 배지를 사용하여 부피를 12mL로 조정합니다.
      4. 응집을 방지하기 위해 응집을 방지하기 위해 37°C로 설정된 인큐베이터에서 85rpm, 0° 각도로 5rpm의 셰이커(SSM1 소형 오비탈 셰이커)에 비 접착성 접시를 놓습니다.

4. 중뇌의 패터닝

  1. 7일차에 12mL의 CDM을 100ng/mL FGF-8b와 함께 추가합니다. 오비탈 셰이커 인큐베이터에 놓습니다.
  2. 8-13일에는 2일마다 매체를 교체하십시오. 매일 현미경으로 관찰하십시오.
  3. 14일차에 12mL의 CDM에 100ng/mL FGF-8b 및 1μM 푸르모르파민(PM)을 추가합니다. 오비탈 셰이커에 놓습니다.
  4. 15-20일에는 2일마다 매체를 교체하십시오. 매일 현미경으로 관찰하십시오.

5. Matrigel 임베딩 및 MO 종결 및 성숙

  1. 2 °C에서 8 °C 사이의 온도에서 1-2 시간 동안 얼음 위에서 Matrigel을 해동합니다.
    참고: 각 배아체(EB)에 15μL를 공급하기 위해 적절한 양의 Matrigel을 해동합니다. 조기 중합을 방지하기 위해 Matrigel을 얼음 위에서 차갑게 유지하십시오. Matrigel과 접촉하는 모든 플라스틱 용기를 사용하기 전에 최소 20분 동안 -30°C에서 냉각하십시오.
  2. 멸균 오가노이드 임베딩 시트를 빈 접시에 넣습니다.
  3. 넓은 구멍의 200μL 피펫 팁을 사용하여 접시에서 오가노이드를 부드럽게 꺼내 웰당 하나의 오가노이드를 사용하여 매립 표면으로 옮깁니다. 12-16개의 EB가 임베딩 표면에 수집될 때까지 이 과정을 반복합니다.
  4. 각 EB에서 여분의 배지를 조심스럽게 제거한 다음 각 EB에 15μL의 차가운 Matrigel을 적가합니다. 피펫을 사용하여 EB를 Matrigel 액적의 중앙으로 재배치합니다.
  5. 37°C로 설정된 인큐베이터에서 15-20분 동안 플레이트를 배양하여 Matrigel이 중합될 수 있도록 합니다.
  6. 멸균 집게를 사용하여 Matrigel 방울이 있는 임베딩 시트를 들어 올립니다. 6-well ultra-low adherent plate에서 1 well 바로 위의 시트를 잡습니다. 10ng/mL BDNF(Brain-Derived Neurotrophic Factor) 및 10ng/mL GDNF(Glial cell line-Derived Neurotrophic Factor)가 포함된 CDM 3mL를 피펫으로 주입하고 시트의 Matrigel 방울을 각 웰로 부드럽게 헹굽니다. 6-8개의 모든 Matrigel 방울이 하나의 웰로 옮겨질 때까지 이 과정을 반복합니다.
  7. 85rpm에서 37°C 인큐베이터의 오비탈 셰이커에 플레이트를 놓고 3일마다 10ng/mL BDNF 및 10ng/mL GDNF로 CDM을 변경합니다.
    참고: 최대 3개월 동안 차별화된 배양을 유지합니다. 신경 형태학은 종결 후 2주 후에 나타납니다. BDNF와 GDNF는 3개월 이상 배양하는 데 필요하지 않습니다.

6. 면역형광 염색

  1. 1,000μL 피펫을 사용하여 배지에서 오가노이드를 부드럽게 꺼내고 최소한의 배지로 현미경 슬라이드에 부드럽게 놓습니다.
  2. RT에서 완전히 자연 건조시킵니다.4% 파라포름알데히드(PFA)(샘플당 300μL)를 30분 동안 추가합니다.
    참고: PFA는 유해하며 발암 특성을 가질 수 있습니다. 주의해서 취급하고, 피부와 눈에 직접 닿지 않도록 하고, 화학 흄 후드 내에서 사용하십시오.
  3. 슬라이드에 30% 자당 용액(샘플당 300μL)을 추가하고 4°C에서 밤새 배양합니다.
  4. PBS(Ca2+/Mg2+ 포함), 0.3% Triton X-100 및 10% 일반 염소 혈청을 포함하는 차단 완충액(BB)(샘플당 300μL)을 추가하여 실온에서 2시간(또는 4°C에서 하룻밤) 동안 오가노이드를 차단 및 투과합니다. 소수성 배리어 펜을 사용하여 오가노이드를 묘사하고 슬라이드의 버퍼를 제한합니다.
  5. 차단 완충액(시료당 300μL), 항-포크헤드 박스 단백질 G1(FOXG1, 1:200), 항-직교성 호메오박스 2(OTX2, 1:100), 항-포크헤드 박스 A2(FOXA2, 1:100), 항-티로신 하이드록실라제(TH, 1:100), 항-SRY(성 결정 영역 Y)-박스 2(SOX2, 1:100), 안티-쌍 박스 단백질(PAX6, 1:100) 및 항-미세소관 관련 단백질 2(MAP2 1:500)에 적절한 양의 1차 항체를 포함합니다. 어둠 속에서 4 ° C에서 밤새 배양하십시오 ( 재료 표 참조).
  6. 부드럽게 흔들리는 플랫폼에서 2-3번의 완충액 교체와 함께 3시간 동안 1x PBS로 샘플을 세척합니다.
  7. 2차 항체(샘플당 300μL), anti-Alexa Fluor 488(1:800), anti-Alexa Fluor 594(1:800) 및 anti-Alexa Fluor 647(1:800)을 4°C에서 하룻밤 동안 가습된 암실에서 배양합니다. Hoechst 33342 (1:5,000) 핵 염색을 동시에 추가합니다( 재료 표 참조).
  8. 항체를 제거하고 PBS로 빠르게 헹군 후 0.01% 아지드화나트륨이 함유된 PBS를 4°C에서 1-2일 동안 첨가하여 오염을 억제합니다.
  9. PBS를 흡인하고, 여분의 용액을 제거하고, 장착 매체를 사용하여 오가노이드를 장착합니다( 재료 표 참조). 기포 형성을 방지하기 위해 커버슬립을 놓고 실장 매체가 완전히 중합될 수 있도록 최소 12시간 동안 RT의 암실에 보관하십시오.
    참고: 이제 표본을 형광 현미경을 사용하여 관찰할 준비가 되었습니다.

결과

이 연구에서는 iPSC에서 MO를 유도하기 위한 선구적인 프로토콜을 소개합니다. 우리 방법론의 핵심은 FGF-8b 및 음파 고슴도치(SHH) 경로 작용제 푸르모르파민(PM)과 시너지 효과를 발휘하여 결합된 이중 SMAD 억제의 혁신적인 사용입니다. 이 방법은 그림 1에 나와 있습니다. 분화 과정은 iPSC를 neuroectoderm 계통으로 조종하여 신경 상피 또는 신경 장미 군체?...

토론

이 연구에서는 MO와 iPSC를 구별하기 위한 방법론을 개발했습니다. 당사의 프로토콜은 FGF-8b 및 SHH 작용제 PM을 포함한 형태 유발 인자로 강화된 이중 SMAD 억제 전략을 사용합니다. 이 접근법은 중뇌 존재발생에 중요한 발달 단서를 면밀히 시뮬레이션합니다. 우리가 도입한 분화 경로는 자연적인 뇌 발달 과정에서 관찰되는 신경 로제트를 연상시키는 신경 상피 구조의 형성?...

공개

저자는 공개할 이해 상충이 없습니다.

감사의 말

그림 1 은 BioRender.com 를 사용하여 만든 것입니다. 자금을 지원해 주신 University of Bergen Meltzers Høyskolefonds(프로젝트 번호: 103517133), Gerda Meyer Nyquist Guldbrandson, Gerdt Meyer Nyquists legat(프로젝트 번호: 103816102)에게 감사드립니다.

자료

NameCompanyCatalog NumberComments
CCD Microscope Camera Leica DFC3000 GLeica Microsystems, Germany
Chemically Defined Lipid ConcentrateThermo Fisher Scientific11905031CDM ingredient
Collagenase  IVThermo Fisher Scientific17104019Reagent for gentle dissociation of human iPSCs
Corning non-treated culture dishesSigma-AldrichCLS430589Suspension culture 
DMEM/F-12, GlutaMAX supplementThermo Fisher Scientific10565018Astrocyte differentiation basal Medium
DPBSThermo Fisher Scientific14190250Used for a variety of cell culture wash
EDTAThermo Fisher Scientific15575020Reagent for gentle dissociation of human iPSCs
Essential 8 Basal MediumThermo Fisher ScientificA1516901Basal medium for iPSC culture
Essential 8 Supplement (50x)Thermo Fisher ScientificA1517101Supplement for iPSC culture
FCCPAbcamab120081Eliminates mitochondrial membrane potential and TMRE staining
FGF-basicPeproTech100-18BAstrocyte differentiation medium ingredient
Fluid aspiration system BVC controlVacuubrand, Germany
Formaldehyde (PFA) 16%Thermo Fisher Scientific28908Cell fixation 
GDNFPeprotech450-10DA neurons medium ingredient
Geltrex (Basement membrane matrix)Thermo Fisher ScientificA1413302Used for attachment and maintenance of human iPSCs
GlutaMAX SupplementThermo Fisher Scientific35050061Supplement for NSC culture
Heracell 150i CO2 IncubatorsFisher Scientific, USA
IMDMThermo Fisher Scientific21980032Basal medium for CDM
InSolution AMPK InhibitorSigma-Aldrich171261Neural induction medium ingredient
InsulinRoche1376497CDM ingredient
iPSCs derived from Detroit 551 fibroblats ATCCCCL-110
Leica TCS SP8 STED confocal microscopeLeica Microsystems, Germany
MatrigelLife Science354230Matrigel embedding
MonothioglycerolSigma-AldrichM6145CDM ingredient
Normal goat serumThermo Fisher ScientificPCN5000Used for blocking buffer
Orbital shakers - SSM1Stuart Equipment, UK
Organoid Embedding SheetSTEMCELL Technologies8579Matrigel embedding
Organoid Embedding SheetSTEMCELL Technologies 8579
PBS 1xThermo Fisher Scientific18912014Used for a variety of washes
Poly-D-lysine hydrobromideSigma-AldrichP7405Promotes attachment and growth of neural cells in vitro
Poly-L-ornithine solutionSigma-AldrichP4957Promotes attachment and growth of neural cells in vitro
ProLong Gold Antifade MountantThermo Fisher ScientificP36930Mounting the coverslip for confocal image
PurmorphamineSTEMCELL Technologies72204Promotes DA neuron differentiation
Recombinant Human/Mouse FGF-8b Protein R&D Systems423-F8-025/CFPromotes DA neuron differentiation 
SB 431542Tocris BioscienceTB1614-GMPNeural Induction Medium ingredient
TRITON X-100VWR International9002-93-1Used for cells permeabilization in immunostaining assays
SSM1 compact orbital shaker Norrscope51901-10 SSM1 Shaker, orbital, mini 230VRotator for organoid culturing.
Water Bath Jb Academy Basic Jba5 JBA5 Grant InstrumentsGrant Instruments, USA
Antibodies used for immunostaining
Primary antibody
anti-DATAbcamab128848, RRID:AB_2665470Rabbit; 1:100 
anti-FOXA2ProteinTech22474-1-AP, RRID:AB_2879110Rabbit; 1:100 
anti-FOXG1Abcamab196868, RRID:AB_2892604Rabbit; 1:200
anti-LMX1Abcamab139726, RRID:AB_2827684Rabbit; 1:100 
anti-MAP2Abcamab5392 ,RRID:AB_2138153Chicken; 1:500
anti-OTX2ProteinTech13497-1-AP, RRID:AB_2157176Rabbit; 1:100 
anti-THAbcamab75875, RRID:AB_1310786Rabbit; 1:100 
Secondary antibodyDilution (μL)
 Alexa Fluor  594 goat anti-rabbit IgGThermo Fisher ScientificA-11012 1:400
Alexa Fluor  488 goat anti-rabbit IgGThermo Fisher ScientificA- 11008 1:400
Alexa Fluor  488 goat anti-rabbit IgGThermo Fisher ScientificA- 11008 1:400
Alexa Fluor  488 goat anti-rabbit IgGThermo Fisher ScientificA- 11008 1:400
Alexa Fluor  594 goat anti-rabbit IgG Thermo Fisher ScientificA-11012 1:400
Alexa Fluor  594 goat anti-rabbit IgG Thermo Fisher ScientificA-11012 1:400
Alexa Fluor  647 goat anti-chicken IgG Thermo Fisher ScientificA-21469 1:400

참고문헌

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