Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

פרוטוקול זה מתאר שיטה חדשה ליצירת אורגנואידים תלת מימדיים במוח התיכון מתאי גזע פלוריפוטנטיים המושרים על ידי בני אדם, המנחה את היווצרותם לחקות רקמת מוח תיכון טבעית, ובכך לסייע בחקר התפתחות והפרעות.

Abstract

הפיתוח של אורגנואידים במוח התיכון (MOs) מתאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים (hPSCs) מייצג התקדמות משמעותית בהבנת התפתחות המוח, הקלה על מודלים מדויקים של מחלות וקידום מחקר טיפולי. פרוטוקול זה מתאר שיטה ליצירת אורגנואידים ספציפיים למוח התיכון באמצעות תאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים (iPSCs), תוך שימוש בגישת התמיינות אסטרטגית. טכניקות מפתח כוללות עיכוב SMAD כפול לדיכוי איתות SMAD, מתן גורם גדילה פיברובלסטים 8b (FGF-8b), והפעלת מסלול הקיפוד הקולי באמצעות הפורמורפמין האגוניסטי, המנחה iPSCs לעבר גורל המוח האמצעי.

האורגנואידים המיוצרים בשיטה זו מגיעים לקוטר של עד 2 מ"מ ומשלבים מגוון רחב של סוגי תאים נוירו-אפיתליים, המשקפים את המגוון התאי המובנה במוח האמצעי. אימות האורגנואידים הללו כמבנים אותנטיים במוח התיכון כרוך בביטוי של סמנים ספציפיים למוח האמצעי, המאשרים את זהותם. תוצאה בולטת של מתודולוגיה זו היא התמיינות יעילה של iPSCs לנוירונים דופמינרגיים, האופייניים למוח האמצעי.

חשיבותו של פרוטוקול זה טמונה ביכולתו לייצר אורגנואידים בוגרים מבחינה תפקודית, ספציפיים למוח האמצעי, המשכפלים באופן הדוק היבטים חיוניים של המוח האמצעי, ומציעים מודל רב ערך לחקירה מעמיקה של תהליכים התפתחותיים במוח התיכון והפתופיזיולוגיה של הפרעות קשורות כגון מחלת פרקינסון. לפיכך, פרוטוקול זה משמש כמשאב חיוני עבור חוקרים המבקשים לשפר את הבנתנו את המוח האנושי ולפתח טיפולים חדשים למחלות נוירודגנרטיביות, מה שהופך אותו לכלי הכרחי בתחום המחקר הנוירולוגי.

Introduction

המוח האנושי, עם הארכיטקטורה המורכבת וההרכב התאי והמולקולרי המורכב שלו, מציב אתגרים אדירים במחקר מדעי המוח, במיוחד בהקשר של מידול מחלות ופיתוח טיפול תאי1. אתגרים אלה מסובכים עוד יותר בגלל הזמינות המוגבלת של מודלים מתוחכמים במבחנה המייצגים באמת את המורכבות של המוח האנושי. עם זאת, ההתקדמות האחרונה בטכנולוגיית תאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים אנושיים (iPSC), המאפשרת התמיינות מבוקרת לתת-סוגים נוירונים ספציפיים, פתחה אפיקים מבטיחים לחקר התפתחות המוח האנושי, פתוגנזה של מחלות ואסטרטגיות טיפוליות מבוססות תאים.

באופן מסורתי, תרביות עצביות דו-ממדיות (2D) שמקורן ב-iPSCs היו אבן הפינה של מחקרי מבחנה שמטרתם לחקות את הפיזיולוגיה והפתולוגיה של הנוירונים האנושיים. תרבויות חד-שכבתיות אלה היו חיוניות בשיפור ההבנה שלנו של מחלות נוירולוגיות ובגילוי חומרים נוירו-פרוטקטיביים 2,3,4,5,6,7. למרות התועלת שלהן, מערכות דו-ממדיות אלה אינן מצליחות לחקות את המגוון התאי האמיתי ואת המבנה התלת-ממדי (3D) של המוח האנושי.

הופעתה של טכנולוגיית אורגנואידים במוח מייצגת קפיצת מדרגה משמעותית במודלים במבחנה, ומספקת כלי המחקה מקרוב את הביולוגיה המורכבת של המוח האנושי במסגרת רלוונטית מבחינה פיזיולוגית8. טכניקות מוקדמות בהתפתחות אורגנואידים במוח ניצלו את התכונות הרגולטוריות הטבועות של iPSCs כדי ליצור באופן ספונטני נגזרות אקטודרם, ובכך חיקו את השלבים המוקדמים של התפתחות המוח 5,9,10,11,12. בהתחשב ברשתות המורכבות שנוצרות על ידי נוירונים עם תאים עצביים ולא עצביים אחרים, מודלים תלת מימדיים הופכים חיוניים למחקר מדויק של מחלות ניווניות. תרביות תלת מימד מספקות סביבה מייצגת יותר in vivo, מאפשרות התמיינות עצבית מואצת ויצירת רשת 12,13,14, ומקדמות ביטוי רחב יותר של גנים עצביים בהשוואה לתרביות דו-ממדיות 15. נוירונים שפותחו בהקשרים תלת-ממדיים משיגים מורפולוגיות ותכונות פיזיולוגיות המזכירות יותר את עמיתיהם in vivo 16.

ההתקדמות האחרונה במודלים תלת מימדיים של מוח הייתה מרכזית בלכידת המורכבות המרחבית והתפקודית של המוח האנושי בצורה יעילה יותר. במהלך העשור האחרון, התקדמותם של פרוטוקולים מגוונים ליצירת אורגנואידים של המוח השלם ומודלים מוחיים ספציפיים לאזור 11,17,18,19,20,21,22, הוכחה כבעלת ערך רב במודלים של הפרעות נוירולוגיות כגון מיקרוצפליה 11, מחלת אלצהיימר14,23 ומחלת פרקינסון24. מטרת פרוטוקול זה היא לפתח ולחדד שיטה ליצירת MOs אנושיים תלת-ממדיים שמקורם ב-iPSCs אנושיים. פרוטוקול זה מכוון במיוחד ליצירת אורגנואידים המועשרים בנוירונים דופמינרגיים ומאורגנים מרחבית באופן המחקה מקרוב את המבנה הטבעי והפונקציונליות של המוח התיכון האנושי. המטרה העיקרית של אורגנואידים אלה היא לשמש מודלים מתקדמים במבחנה לחקר מחלת פרקינסון, ולספק מערכת מדויקת ורלוונטית יותר מבחינה פיזיולוגית לחקר התהליכים והפתולוגיות הנוירו-התפתחותיות הקשורות למצב זה. על ידי מינוף iPSCs שמקורם בחולה ליצירת אורגנואידים ספציפיים למוח האמצעי, הפרוטוקול מבקש לשפר את ההבנה של מנגנוני מחלת פרקינסון, להקל על גילוי מטרות טיפוליות פוטנציאליות ולשפר את הפיתוח של טיפולים מבוססי תאים. באמצעות גישה חדשנית זו, הפרוטוקול שואף להתגבר על המגבלות של תרביות עצביות דו-ממדיות מסורתיות ולתרום באופן משמעותי לתחום המחקר של מחלות נוירודגנרטיביות על ידי הצעת כלי רב עוצמה למודלים של מחלות חוץ גופיות וחקר אסטרטגיות טיפול חדשות.

במהלך 10 השנים האחרונות, צוותי מחקר שונים פיתחו אורגנואידים של המוח התיכון (MOs)8,21,25,26,27,28, תוך שימוש במתודולוגיות המציגות מספר קווי דמיון מרכזיים. במרדף שלנו להעמיק את ההבנה של מחלת הפרקינסון, פיתחנו פרוטוקול ליצירת MOs אנושיים תלת-ממדיים שמקורם ב-iPSCs אנושיים. אורגנואידים אלה, המועשרים בנוירונים דופמינרגיים המסודרים מרחבית, מהווים מודל אידיאלי לחקר מחלת פרקינסון. הפיתוח והשכלול שלנו של פרוטוקולים של אורגנואידים ספציפיים למוח התיכון הניבו מודלים מתקדמים במבחנה שתרמו באופן משמעותי להבנתנו תהליכים נוירו-התפתחותיים ומחלות ניווניות. מודלים אלה, במיוחד כאשר הם מיושמים על MOs שמקורם בחולה, הוכיחו את יעילותם ככלים רבי עוצמה למודלים של מחלות חוץ גופיות, ומציעים נקודות מבט ומתודולוגיות חדשות בתחום תרבית תאים תלת מימדית מתקדמת.

Protocol

ה-iPSCs שנוצרו מפיברובלסטים נורמליים אנושיים דטרויט 551 ותאי גזע עובריים אנושיים (ESCs) hESC line 360 כפי שתואר קודם לכן4. ה-iPSCs הושגו באישור הוועדה המערבית של נורבגיה למחקר בריאות אתי REK nr. 2012/919. כל התאים נוטרו באופן קבוע לזיהום מיקופלזמה באמצעות ערכת זיהוי מיקופלזמה MycoAlert. טבלת החומרים מכילה מידע על כל החומרים, הריאגנטים והציוד המשמשים בפרוטוקול זה. טבלה 1 מתארת את המדיה ושאר החומרים שבהם נעשה שימוש.

1. הפשרת iPSCs

  1. צלחת מצופה מטריצה והכנה בינונית חיונית 8 (E8)
    1. הפשירו את בקבוקון מטריצת קרום המרתף על קרח למשך הלילה. לדלל 1:100 בקור מתקדם דולבקו מדיום נשר שונה (DMEM)/F12 DMEM/F12 של האם (1% ריכוז סופי) (ראה טבלת חומרים וטבלה 1). יש לאחסן בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס לשימוש ארוך טווח.
    2. להפשיר את קרום הבסיס המדולל ב -4 מעלות צלזיוס; מצפים צלחת של 6 בארות עם 1 מ"ל תמיסה לכל באר. יש לדגור בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך שעה.
    3. הסר את הצלחת מהחממה ואפשר לה להתאזן לטמפרטורת החדר (RT).
      הערה: ניתן לקרר צלחות למשך שבועיים לכל היותר (הקפידו על חימום ל-RT לפני השימוש). לאחסון ממושך, הוסף 1 מ"ל של E8 Medium (ראה טבלת חומרים וטבלה 1) לצלחת המצופה כדי למנוע התייבשות של הג'ל.
  2. הכנה בינונית E8
    1. בסביבה סטרילית, שלב את המדיום הבסיסי E8 עם תוסף E8 (ראה טבלת חומרים וטבלה 1).
      הערה: ניתן לאחסן בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך שבועיים. יש להפשיר את תוסף ה-E8 הקפוא למשך הלילה בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס לפני הכנת המדיום המלא. אין להפשיר ב-37 מעלות צלזיוס, מכיוון שהדבר עלול לפגוע ביציבותו. לפני השימוש, יש לחמם רק את הנפח הנדרש של E8 בינוני לטמפרטורת החדר (RT) עד שהוא כבר לא קריר למגע.

2. זריעת iPSCs

  1. מחממים מראש את הצלחות המצופות מטריצה ו-E8 Medium ב-RT או בחממה ב-37 מעלות צלזיוס.
  2. מדיום תרבות שאיפה; שטפו את iPSCs, שהם במפגש של 60%-70%, עם תמיסת מלח עם חוצץ פוספט של Dulbecco ללא סידן ומגנזיום (DPBS Ca2+/Mg2+ חינם, 4 מ"ל לבאר בצלחת של 6 בארות).
  3. הוסף חומצה אתילנדיאמינטטראצטית (EDTA, 0.5 מ"מ, 1 מ"ל לבאר, ראה טבלת חומרים וטבלה 1); דוגרים בחום של 37 מעלות צלזיוס עד ששולי המושבה מתנתקים (3-5 דקות).
  4. שאפו את תמיסת הדיסוציאציה; כדי לנתק מושבות, פיפטה בזהירות את מדיום E8 שחומם מראש (4 מ"ל לבאר) ישירות על המושבות בכוח חזק מהרגיל מהפיפטה, מה שיוצר תנועת נוזל מקומית על פני התא.
  5. פצלו את התאים ביחס של 1:2 על ידי העברתם לשתי בארות חדשות של צלחת מצופה מטריצה עם 6 בארות, והוסיפו 2 מ"ל מדיום לבאר. לאחר מכן, דגרו בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס.
  6. החליפו את המדיה מדי יום עד שהמושבות מגיעות למפגש של 80%.
  7. בעזרת מיקרוסקופ בהגדלה של פי 10, התבונן במושבות כדי לוודא שהן בגודל מתאים, המאופיינות בדרך כלל בצורה עגולה מובחנת בקוטר שנע בין 0.5 ל-1 מ"מ. ודא שמושבות הן מבנים צפופים וקומפקטיים הכוללים גבולות מוגדרים וחלקים.

3. אינדוקציה עצבית

  1. הכנה בינונית והתקנה של יום 0
    1. הכן 500 מ"ל כל אחד ממדיום מוגדר כימית (CDM), מדיום אינדוקציה עצבית (NIM) ומדיום ללא סרום תאי גזע עצביים (NSC SF), תוך התייחסות לטבלת החומרים ולטבלה 1.
    2. שוטפים את התאים בצלחת של 6 בארות עם 4 מ"ל DPBS (1x) (Ca2+/Mg2+- חינם) לבאר, ולאחר מכן תוספת של 3 מ"ל NIM לבאר להגדרת יום 0.
    3. החלף את NIM (3 מ"ל לבאר) בימים 1, 3 ו-5; התבוננו מדי יום במיקרוסקופ.
    4. ביום 6, נתק את הרוזטות העצביות לתרבית מתלה באמצעות השלבים הבאים.
      1. יש לשטוף בעדינות פעם אחת עם DPBS (1x) (Ca2+/Mg2+ ללא תשלום) (4 מ"ל לבאר בצלחת של 6 בארות). מוסיפים קולגנאז IV (1 מ"ל לבאר בצלחת של 6 בארות) ודוגרים למשך דקה. הסר את הקולגנאז IV, ושטוף בעדינות פעם אחת עם DPBS (1x) (Ca2+/Mg2+ ללא תשלום) (4 מ"ל לבאר בצלחת של 6 בארות).
      2. הוסף 2 מ"ל של NSC SF Medium לכל באר של צלחת 6 בארות. נתק את התאים על ידי גירוד תחתית הבאר, וצור רשתות עם קצה פיפטה של 200 מיקרוליטר.
      3. העבירו את מתלה התאים מצלחת 6 הבארות לכלי 10 ס"מ שאינו דבק. כוונן את עוצמת הקול ל-12 מ"ל עם NSC SF Medium.
      4. הנח את המנה הלא נדבקת על שייקר (שייקר מסלולי קומפקטי ssm1) ב-85 סל"ד בזווית של 0° בחממה המוגדרת ל-37 מעלות צלזיוס עם 5% CO2 למניעת צבירה.

4. דפוס המוח האמצעי

  1. ביום השביעי, הוסף 12 מ"ל CDM עם 100 ננוגרם/מ"ל FGF-8b; מניחים על חממת שייקר מסלולית.
  2. בימים 8-13, החלף את המדיום כל יומיים; התבוננו במיקרוסקופ מדי יום.
  3. ביום ה-14, הוסיפו 12 מ"ל CDM עם 100 ננוגרם/מ"ל FGF-8b ו-1 מיקרומטר פורמורפמין (PM); מניחים על שייקר מסלולי.
  4. בימים 15-20, החלף את המדיום כל יומיים; התבוננו במיקרוסקופ מדי יום.

5. הטמעת מטריג'ל וסיום והתבגרות MO

  1. להפשיר מטריג'ל על קרח בטמפרטורה שבין 2 מעלות צלזיוס ל-8 מעלות צלזיוס למשך 1-2 שעות.
    הערה: יש להפשיר כמות מספקת של מטריג'ל כדי לספק 15 מיקרוליטר לכל גוף עוברי (EB). שמור את המטריגל מקורר על קרח כדי למנוע פילמור מוקדם. יש לקרר את כל כלי הפלסטיק שיהיו במגע עם מטריג'ל בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות לפחות לפני השימוש.
  2. מניחים יריעת הטמעה אורגנואידית סטרילית בכלי ריק.
  3. בעזרת קצה פיפטה רחב של 200 מיקרוליטר, הוציאו בעדינות את האורגנואיד מהצלחת והעבירו אותו למשטח ההטבעה עם אורגנואיד אחד לכל באר. חזור על תהליך זה עד לאיסוף 12-16 EBs על משטח ההטבעה.
  4. הסר בזהירות את המדיום העודף מכל EB ולאחר מכן הוסף 15 מיקרוליטר של מטריג'ל קר טיפה על כל EB. בעזרת פיפטה, מקם מחדש את ה- EB למרכז טיפת המטריגל.
  5. דגרו את הצלחת באינקובטור המוגדר ל-37 מעלות צלזיוס למשך 15-20 דקות כדי לאפשר למטריג'ל להתפלמר.
  6. בעזרת מלקחיים סטריליים, הרם את יריעת ההטבעה עם טיפות המטריגל. החזק את הסדין ישירות מעל באר אחת בצלחת דביקה נמוכה במיוחד של 6 בארות. יש להעלות 3 מ"ל CDM עם 10 ננוגרם/מ"ל גורם נוירוטרופי מוחי (BDNF) ו-10 ננוגרם/מ"ל גורם נוירוטרופי הנגזר מקו תאי גליה (GDNF) ולשטוף בעדינות את טיפות המטריגל מהסדין לכל באר. חזור על תהליך זה עד שכל 6-8 טיפות המטריג'ל מועברות לבאר אחת.
  7. הנח את הצלחות על שייקר אורביטלי באינקובטור של 37 מעלות צלזיוס ב-85 סל"ד והחלף את ה-CDM עם 10 ננוגרם/מ"ל BDNF ו-10 ננוגרם/מ"ל GDNF כל 3 ימים.
    הערה: שמור על תרביות מבדילות עד 3 חודשים; מורפולוגיה עצבית מופיעה לאחר שבועיים לאחר הפסקת ההיריון. BDNF ו-GDNF אינם נחוצים לתרבית מעבר ל-3 חודשים.

6. צביעה אימונופלואורסצנטית

  1. השתמש בפיפטה של 1,000 מיקרוליטר כדי להוציא בעדינות את האורגנואיד מהמדיום ולהניח אותו בעדינות על שקופית מיקרוסקופ עם מדיום מינימלי.
  2. הניחו לו להתייבש לחלוטין באוויר ב-RT. הוסיפו 4% פרפורמלדהיד (PFA) (300 מיקרוליטר לדגימה) למשך 30 דקות.
    הערה: PFA מסוכן ועלול להיות בעל תכונות מסרטנות. טפל בו בזהירות, הימנע ממגע ישיר עם העור והעיניים והקפד על שימוש בתוך קולט אדים כימי.
  3. הוסף 30% תמיסת סוכרוז (300 מיקרוליטר לדגימה) לשקופיות ותן להן לדגור למשך הלילה ב-4 מעלות צלזיוס.
  4. חסום וחלחל את האורגנואידים על ידי הוספת מאגר חוסם (BB) (300 מיקרוליטר לדגימה), הכולל PBS (עם Ca2+/Mg2+), 0.3% טריטון X-100 ו-10% סרום עזים רגיל, למשך שעתיים ב-RT (או לילה ב-4 מעלות צלזיוס). השתמש בעט מחסום הידרופובי כדי לתחום את האורגנואידים ולהגביל את המאגר על המגלשה.
  5. כסו את הדגימות בנפח מתאים של נוגדן ראשוני במאגר חוסם (300 מיקרוליטר לדגימה), חלבון קופסת מזלג G1 (FOXG1, 1:200), הומאובוקס אנטי-אורתודנטי 2 (OTX2, 1:100), אנטי-מזלג קופסה A2 (FOXA2, 1:100), אנטי-טירוזין הידרוקסילאז (TH, 1:100), אנטי-SRY (אזור קביעת מין Y)-קופסה 2 (SOX2, 1:100), חלבון קופסה אנטי-מזווג (PAX6, 1:100), וחלבון קשור אנטי-מיקרו-צינוריות 2 (MAP2 1:500), ולדגור למשך הלילה ב-4 מעלות צלזיוס בחושך (ראה טבלת חומרים).
  6. שטפו את הדגימות ב-1x PBS למשך 3 שעות עם שניים עד שלושה החלפות חיץ על פלטפורמה מתנדנדת בעדינות.
  7. דגירה עם הנוגדן המשני (300 מיקרוליטר לדגימה), אנטי-אלקסה פלואור 488 (1:800), אנטי-אלקסה פלואור 594 (1:800) ואנטי-אלקסה פלואור 647 (1:800) למשך הלילה ב-4 מעלות צלזיוס בחדר חושך לח. הוסף כתם גרעיני Hoechst 33342 (1:5,000) בו זמנית (ראה טבלת חומרים).
  8. הסר את הנוגדן, שטוף במהירות עם PBS, ולאחר מכן הוסף PBS המכיל 0.01% נתרן אזיד למשך 1-2 ימים ב-4 מעלות צלזיוס כדי לעכב זיהום.
  9. שאפו את ה-PBS, הסירו את כל התמיסה העודפת והרכיבו את האורגנואידים באמצעות אמצעי הרכבה (עיין בטבלת החומרים). הנח כיסוי, הקפיד למנוע היווצרות בועות אוויר, ואחסן בחדר חשוך ב-RT למשך 12 שעות לפחות כדי לאפשר למדיום ההרכבה להתפלמר במלואו.
    הערה: הדגימה מוכנה כעת לתצפית באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי.

תוצאות

במחקר זה, אנו מציגים פרוטוקול חלוצי לגזירת MOs מ-iPSCs. מרכזי במתודולוגיה שלנו הוא השימוש החדשני בעיכוב SMAD כפול, בשילוב סינרגטי עם FGF-8b ומסלול אגוניסט קיפוד קולי (SHH) פורמורפמין (PM). גישה זו מתוארת באיור 1. תהליך ההתמיינות מתחיל בהפניית iPSCs לעבר שושלת נוירואקטודר...

Discussion

במחקר זה, פיתחנו מתודולוגיה לבידול של MO מ-iPSCs. הפרוטוקול שלנו משתמש באסטרטגיית עיכוב SMAD כפולה המשופרת עם גורמים מורפוגניים, כולל FGF-8b ו-SHH אגוניסט PM. גישה זו מדמה מקרוב את הרמזים ההתפתחותיים החיוניים לאונטוגניה של המוח האמצעי. מסלול ההתמיינות שהקמנו מעודד היווצרות מבנים נ?...

Disclosures

למחברים אין ניגודי אינטרסים לחשוף.

Acknowledgements

איור 1 נוצר באמצעות BioRender.com. אנו מודים לאוניברסיטת ברגן מלצרס Høyskolefonds (מספר פרויקט: 103517133), לגרדה מאייר נייקוויסט גולדברנדסון ולגרדט מאייר נייקוויסט לגאט (מספר פרויקט: 103816102) על המימון.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
CCD Microscope Camera Leica DFC3000 GLeica Microsystems, Germany
Chemically Defined Lipid ConcentrateThermo Fisher Scientific11905031CDM ingredient
Collagenase  IVThermo Fisher Scientific17104019Reagent for gentle dissociation of human iPSCs
Corning non-treated culture dishesSigma-AldrichCLS430589Suspension culture 
DMEM/F-12, GlutaMAX supplementThermo Fisher Scientific10565018Astrocyte differentiation basal Medium
DPBSThermo Fisher Scientific14190250Used for a variety of cell culture wash
EDTAThermo Fisher Scientific15575020Reagent for gentle dissociation of human iPSCs
Essential 8 Basal MediumThermo Fisher ScientificA1516901Basal medium for iPSC culture
Essential 8 Supplement (50x)Thermo Fisher ScientificA1517101Supplement for iPSC culture
FCCPAbcamab120081Eliminates mitochondrial membrane potential and TMRE staining
FGF-basicPeproTech100-18BAstrocyte differentiation medium ingredient
Fluid aspiration system BVC controlVacuubrand, Germany
Formaldehyde (PFA) 16%Thermo Fisher Scientific28908Cell fixation 
GDNFPeprotech450-10DA neurons medium ingredient
Geltrex (Basement membrane matrix)Thermo Fisher ScientificA1413302Used for attachment and maintenance of human iPSCs
GlutaMAX SupplementThermo Fisher Scientific35050061Supplement for NSC culture
Heracell 150i CO2 IncubatorsFisher Scientific, USA
IMDMThermo Fisher Scientific21980032Basal medium for CDM
InSolution AMPK InhibitorSigma-Aldrich171261Neural induction medium ingredient
InsulinRoche1376497CDM ingredient
iPSCs derived from Detroit 551 fibroblats ATCCCCL-110
Leica TCS SP8 STED confocal microscopeLeica Microsystems, Germany
MatrigelLife Science354230Matrigel embedding
MonothioglycerolSigma-AldrichM6145CDM ingredient
Normal goat serumThermo Fisher ScientificPCN5000Used for blocking buffer
Orbital shakers - SSM1Stuart Equipment, UK
Organoid Embedding SheetSTEMCELL Technologies8579Matrigel embedding
Organoid Embedding SheetSTEMCELL Technologies 8579
PBS 1xThermo Fisher Scientific18912014Used for a variety of washes
Poly-D-lysine hydrobromideSigma-AldrichP7405Promotes attachment and growth of neural cells in vitro
Poly-L-ornithine solutionSigma-AldrichP4957Promotes attachment and growth of neural cells in vitro
ProLong Gold Antifade MountantThermo Fisher ScientificP36930Mounting the coverslip for confocal image
PurmorphamineSTEMCELL Technologies72204Promotes DA neuron differentiation
Recombinant Human/Mouse FGF-8b Protein R&D Systems423-F8-025/CFPromotes DA neuron differentiation 
SB 431542Tocris BioscienceTB1614-GMPNeural Induction Medium ingredient
TRITON X-100VWR International9002-93-1Used for cells permeabilization in immunostaining assays
SSM1 compact orbital shaker Norrscope51901-10 SSM1 Shaker, orbital, mini 230VRotator for organoid culturing.
Water Bath Jb Academy Basic Jba5 JBA5 Grant InstrumentsGrant Instruments, USA
Antibodies used for immunostaining
Primary antibody
anti-DATAbcamab128848, RRID:AB_2665470Rabbit; 1:100 
anti-FOXA2ProteinTech22474-1-AP, RRID:AB_2879110Rabbit; 1:100 
anti-FOXG1Abcamab196868, RRID:AB_2892604Rabbit; 1:200
anti-LMX1Abcamab139726, RRID:AB_2827684Rabbit; 1:100 
anti-MAP2Abcamab5392 ,RRID:AB_2138153Chicken; 1:500
anti-OTX2ProteinTech13497-1-AP, RRID:AB_2157176Rabbit; 1:100 
anti-THAbcamab75875, RRID:AB_1310786Rabbit; 1:100 
Secondary antibodyDilution (μL)
 Alexa Fluor  594 goat anti-rabbit IgGThermo Fisher ScientificA-11012 1:400
Alexa Fluor  488 goat anti-rabbit IgGThermo Fisher ScientificA- 11008 1:400
Alexa Fluor  488 goat anti-rabbit IgGThermo Fisher ScientificA- 11008 1:400
Alexa Fluor  488 goat anti-rabbit IgGThermo Fisher ScientificA- 11008 1:400
Alexa Fluor  594 goat anti-rabbit IgG Thermo Fisher ScientificA-11012 1:400
Alexa Fluor  594 goat anti-rabbit IgG Thermo Fisher ScientificA-11012 1:400
Alexa Fluor  647 goat anti-chicken IgG Thermo Fisher ScientificA-21469 1:400

References

  1. Markram, H. Seven challenges for neuroscience. Funct Neurol. 28 (3), 145-151 (2013).
  2. Liang, K. X., et al. N-acetylcysteine amide ameliorates mitochondrial dysfunction and reduces oxidative stress in hiPSC-derived dopaminergic neurons with POLG mutation. Exp Neurol. 33 (7), 113-536 (2021).
  3. Chen, A., et al. Nicotinamide riboside and metformin ameliorate mitophagy defect in induced pluripotent stem cell-derived astrocytes with POLG mutations. Front Cell Dev Biol. 9, 304-737 (2021).
  4. Liang, K. X., et al. Disease-specific phenotypes in iPSC-derived neural stem cells with POLG mutations. EMBO Mol Med. 12 (10), 121-146 (2020).
  5. Xu, P., et al. Human midbrain dopaminergic neuronal differentiation markers predict cell therapy outcomes in a Parkinson's disease model. J Clin Invest. 132 (14), 156-768 (2022).
  6. Cooper, O., et al. Pharmacological rescue of mitochondrial deficits in iPSC-derived neural cells from patients with familial Parkinson's disease. Sci Transl Med. 4 (141), 141-190 (2012).
  7. Nguyen, H. N., et al. LRRK2 mutant iPSC-derived DA neurons demonstrate increased susceptibility to oxidative stress. Cell Stem Cell. 8 (3), 267-280 (2011).
  8. Fiorenzano, A., et al. Single-cell transcriptomics captures features of human midbrain development and dopamine neuron diversity in brain organoids. Nat Commun. 12 (1), 73-102 (2021).
  9. Velasco, S., et al. Individual brain organoids reproducibly form cell diversity of the human cerebral cortex. Nature. 570 (7762), 523-527 (2019).
  10. Qian, X., Song, H., Ming, G. L. Brain organoids: advances, applications and challenges. Development. 146 (8), dev166074 (2019).
  11. Lancaster, M. A., et al. Cerebral organoids model human brain development and microcephaly. Nature. 501 (7467), 373-379 (2013).
  12. Shariati, L., Esmaeili, Y., Haghjooy Javanmard, S., Bidram, E., Amini, A. Organoid technology: Current standing and future perspectives. Stem Cells. 39 (12), 1625-1649 (2021).
  13. Haycock, J. W. 3D cell culture: a review of current approaches and techniques. Methods Mol Biol. 695, 1-15 (2011).
  14. D'Avanzo, C., et al. Alzheimer's in 3D culture: challenges and perspectives. Bioessays. 37 (10), 1139-1148 (2015).
  15. Sun, A. X., Ng, H. H., Tan, E. K. Translational potential of human brain organoids. Ann Clin Transl Neurol. 5 (2), 226-235 (2018).
  16. Del Dosso, A., Urenda, J. P., Nguyen, T., Quadrato, G. Upgrading the physiological relevance of human brain organoids. Neuron. 107 (6), 1014-1028 (2020).
  17. Pasca, A. M., et al. Functional cortical neurons and astrocytes from human pluripotent stem cells in 3D culture. Nat Methods. 12 (7), 671-678 (2015).
  18. Asgrimsdottir, E. S., Arenas, E. Midbrain dopaminergic neuron development at the single cell level: In vivo and in stem cells. Front Cell Dev Biol. 8, 463 (2020).
  19. Zagare, A., et al. Midbrain organoids mimic early embryonic neurodevelopment and recapitulate LRRK2-p.Gly2019Ser-associated gene expression. Am J Hum Genet. 109 (2), 311-327 (2022).
  20. Mohamed, N. V., et al. Midbrain organoids with an SNCA gene triplication model key features of synucleinopathy. Brain Commun. 3 (4), fcab223 (2021).
  21. Jo, J., et al. Midbrain-like organoids from human pluripotent stem cells contain functional dopaminergic and neuromelanin-producing neurons. Cell Stem Cell. 19 (2), 248-257 (2016).
  22. Kwak, T. H., et al. Generation of homogeneous midbrain organoids with in vivo-like cellular composition facilitates neurotoxin-based Parkinson's disease modeling. Stem Cells. 38 (6), 727-740 (2020).
  23. Karmirian, K., et al. Modeling Alzheimer's disease using human brain organoids. Methods Mol Biol. 2561, 135-158 (2023).
  24. Smits, L. M., et al. Modeling Parkinson's disease in midbrain-like organoids. NPJ Parkinsons Dis. 5, 5 (2019).
  25. Qian, X., et al. Brain-region-specific organoids using mini-bioreactors for modeling ZIKV exposure. Cell. 165 (5), 1238-1254 (2016).
  26. Smits, L. M., et al. Single-cell transcriptomics reveals multiple neuronal cell types in human midbrain-specific organoids. Cell Tissue Res. 382 (3), 463-476 (2020).
  27. Sozzi, E., Nilsson, F., Kajtez, J., Parmar, M., Fiorenzano, A. Generation of human ventral midbrain organoids derived from pluripotent stem cells. Curr Protoc. 2 (9), 555 (2022).
  28. Tieng, V., et al. Engineering of midbrain organoids containing long-lived dopaminergic neurons. Stem Cells Dev. 23 (13), 1535-1547 (2014).
  29. Chambers, S. M., et al. Highly efficient neural conversion of human ES and iPS cells by dual inhibition of SMAD signaling. Nat Biotechnol. 27 (3), 275-280 (2009).
  30. Mercurio, S., Serra, L., Pagin, M., Nicolis, S. K. Deconstructing Sox2 function in brain development and disease. Cells. 11 (10), 1604 (2022).
  31. Hettige, N. C., Ernst, C. FOXG1 dose in brain development. Front Pediatr. 7, 482 (2019).
  32. Cooper, O., et al. Differentiation of human ES and Parkinson's disease iPS cells into ventral midbrain dopaminergic neurons requires a high activity form of SHH, FGF8a and specific regionalization by retinoic acid. Mol Cell Neurosci. 45 (3), 258-266 (2010).
  33. Millet, S., Bloch-Gallego, E., Simeone, A., Alvarado-Mallart, R. M. The caudal limit of Otx2 gene expression as a marker of the midbrain/hindbrain boundary: a study using in situ hybridisation and chick/quail homotopic grafts. Development. 122 (12), 3785-3797 (1996).
  34. Surmeier, D. J. Determinants of dopaminergic neuron loss in Parkinson's disease. FEBS J. 285 (19), 3657-3668 (2018).
  35. Chen, A., Yangzom, T., Sullivan, G. J., Liang, K. X. Mitochondrial dysfunction and neuronal anomalies in POLG mutant midbrain organoids. bioRxiv. , (2023).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

SMAD8b

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved