Erzeugung von 3D-Mittelhirn-Organoiden aus human-induzierten pluripotenten Stammzellen

Zusammenfassung

Dieses Protokoll beschreibt eine neuartige Methode zur Herstellung von 3D-Mittelhirn-Organoiden aus humanen induzierten pluripotenten Stammzellen, die ihre Bildung so steuern, dass sie natives Mittelhirngewebe nachahmen, wodurch die Erforschung von Entwicklung und Störungen unterstützt wird.

Zusammenfassung

Die Entwicklung von Mittelhirn-Organoiden (MOs) aus humanen pluripotenten Stammzellen (hPSCs) stellt einen bedeutenden Fortschritt für das Verständnis der Gehirnentwicklung, die Erleichterung einer präzisen Krankheitsmodellierung und die Förderung der therapeutischen Forschung dar. Dieses Protokoll beschreibt eine Methode zur Generierung von Mittelhirn-spezifischen Organoiden unter Verwendung von induzierten pluripotenten Stammzellen (iPSCs) unter Verwendung eines strategischen Differenzierungsansatzes. Zu den Schlüsseltechniken gehören die Dual-SMAD-Hemmung zur Unterdrückung der SMAD-Signalgebung, die Verabreichung des Fibroblasten-Wachstumsfaktors 8b (FGF-8b) und die Aktivierung des Sonic Hedgehog-Signalwegs mit dem Agonisten Purmorpholamin, der iPSCs in ein Schicksal des Mittelhirns führt.

Die mit dieser Methode hergestellten Organoide erreichen Durchmesser von bis zu 2 mm und umfassen eine Vielzahl von Neuroepithelzelltypen, die die dem Mittelhirn innewohnende zelluläre Vielfalt widerspiegeln. Die Validierung dieser Organoide als authentische Strukturen des Mittelhirns beinhaltet die Expression von mittelhirnspezifischen Markern, die ihre Identität bestätigen. Ein bemerkenswertes Ergebnis dieser Methodik ist die effektive Differenzierung von iPSCs in dopaminerge Neuronen, die für das Mittelhirn charakteristisch sind.

Die Bedeutung dieses Protokolls liegt in seiner Fähigkeit, funktionell ausgereifte, mittelhirnspezifische Organoide herzustellen, die wesentliche Aspekte des Mittelhirns genau nachbilden und ein wertvolles Modell für die eingehende Erforschung der Entwicklungsprozesse des Mittelhirns und der Pathophysiologie verwandter Erkrankungen wie der Parkinson-Krankheit bieten. Daher dient dieses Protokoll als wichtige Ressource für Forscher, die unser Verständnis des menschlichen Gehirns verbessern und neue Behandlungen für neurodegenerative Erkrankungen entwickeln wollen, was es zu einem unverzichtbaren Werkzeug auf dem Gebiet der neurologischen Forschung macht.

Einleitung

Das menschliche Gehirn mit seiner komplizierten Architektur und seiner komplexen zellulären und molekularen Zusammensetzung stellt die neurowissenschaftliche Forschung vor gewaltige Herausforderungen, insbesondere im Zusammenhang mit der Modellierung von Krankheiten und der Entwicklung zellulärer Therapien¹. Diese Herausforderungen werden durch die begrenzte Verfügbarkeit ausgefeilter In-vitro-Modelle, die die Komplexität des menschlichen Gehirns wirklich repräsentieren, noch komplizierter. Jüngste Fortschritte in der Technologie der humanen induzierten pluripotenten Stammzellen (iPSC), die eine kontrollierte Differenzierung in spezifische neuronale Subtypen ermöglichen, haben jedoch vielversprechende Wege für die Erforschung der menschlichen Gehirnentwicklung, der Krankheitspathogenese und zellbasierter therapeutischer Strategien eröffnet.

Traditionell sind zweidimensionale (2D) neuronale Kulturen, die aus iPSCs gewonnen werden, der Eckpfeiler von In-vitro-Studien, die darauf abzielen, die neuronale Physiologie und Pathologie des Menschen nachzuahmen. Diese Monolayer-Kulturen haben maßgeblich dazu beigetragen, unser Verständnis neurologischer Erkrankungen zu verbessern und neuroprotektive Wirkstoffe^zu entdecken 2,3,4,5,6,7. Trotz ihres Nutzens sind diese 2D-Systeme nicht in der Lage, die wahre zelluläre Vielfalt und dreidimensionale (3D) Struktur des menschlichen Gehirns zu emulieren.

Das Aufkommen der Hirnorganoid-Technologie stellt einen bedeutenden Sprung in der In-vitro-Modellierung dar und bietet ein Werkzeug, das die komplizierte Biologie des menschlichen Gehirns innerhalb eines physiologisch relevanten Rahmens genau nachahmt⁸. Frühe Techniken in der Entwicklung von Hirnorganoiden nutzten die inhärenten regulatorischen Eigenschaften von iPSCs, um spontan Ektodermderivate zu bilden, wodurch die frühen Stadien der Gehirnentwicklung nachgeahmt^wurden 5,9,10,11,12. Angesichts der komplexen Netzwerke, die Neuronen mit anderen neuronalen und nicht-neuronalen Zellen bilden, ist die 3D-Modellierung für die genaue Untersuchung neurodegenerativer Erkrankungen unerlässlich. 3D-Kulturen bieten eine repräsentativere In-vivo-Umgebung, erleichtern eine beschleunigte neuronale Differenzierung und Netzwerkbildung 12,13,14 und fördern eine breitere Expression neuronaler Gene im Vergleich zu 2D-Kulturen¹⁵. Neuronen, die in 3D-Kontexten entwickelt wurden, erreichen Morphologien und physiologische Eigenschaften, die eher an ihre in vivo-Gegenstücke erinnern¹⁶.

Die jüngsten Fortschritte bei 3D-Gehirnmodellen waren entscheidend für die effektivere Erfassung der räumlichen und funktionellen Komplexität des menschlichen Gehirns. In den letzten zehn Jahren hat sich die Weiterentwicklung verschiedener Protokolle zur Generierung von Ganzhirn-Organoiden und regionenspezifischen Gehirnmodellen 11,17,18,19,20,21,22 bei der Modellierung neurologischer Erkrankungen wie Mikrozephalie¹¹, Alzheimer ^14,23 und Parkinson 24 als unschätzbar wertvoll erwiesen. Das Ziel dieses Protokolls ist es, eine Methode zur Erstellung von menschlichen 3D-MOs zu entwickeln und zu verfeinern, die von menschlichen iPSCs abgeleitet sind. Dieses Protokoll zielt speziell darauf ab, Organoide zu erzeugen, die mit dopaminergen Neuronen angereichert und räumlich so organisiert sind, dass sie die natürliche Struktur und Funktionalität des menschlichen Mittelhirns genau nachahmen. Der Hauptzweck dieser Organoide besteht darin, als fortschrittliche In-vitro-Modelle für die Untersuchung der Parkinson-Krankheit zu dienen und ein genaueres und physiologisch relevanteres System zur Erforschung der neurologischen Entwicklungsprozesse und Pathologien bereitzustellen, die mit dieser Erkrankung verbunden sind. Durch die Nutzung von patienteneigenen iPSCs zur Erzeugung dieser Mittelhirn-spezifischen Organoide zielt das Protokoll darauf ab, das Verständnis der Mechanismen der Parkinson-Krankheit zu verbessern, die Entdeckung potenzieller therapeutischer Ziele zu erleichtern und die Entwicklung zellbasierter Therapien zu verbessern. Durch diesen innovativen Ansatz zielt das Protokoll darauf ab, die Einschränkungen traditioneller 2D-Neurokulturen zu überwinden und einen wichtigen Beitrag zur Erforschung neurodegenerativer Erkrankungen zu leisten, indem es ein wirksames Werkzeug für die In-vitro-Modellierung von Krankheiten und die Erforschung neuartiger Behandlungsstrategien bietet.

In den letzten 10 Jahren haben verschiedene Forschungsteams Mittelhirn-Organoide (MOs)8,21,25,26,27,28 entwickelt, wobei Methoden verwendet wurden, die mehrere wichtige Ähnlichkeiten aufweisen. In unserem Bestreben, das Verständnis der Parkinson-Krankheit zu vertiefen, haben wir ein Protokoll zur Erstellung von menschlichen 3D-MOs entwickelt, die aus menschlichen iPSCs abgeleitet sind. Diese Organoide, angereichert mit räumlich angeordneten dopaminergen Neuronen, stellen ein ideales Modell für die Erforschung der Parkinson-Krankheit dar. Unsere Entwicklung und Verfeinerung von mittelhirnspezifischen Organoid-Protokollen hat zu fortschrittlichen In-vitro-Modellen geführt, die wesentlich zu unserem Verständnis von neurologischen Entwicklungsprozessen und neurodegenerativen Erkrankungen beigetragen haben. Diese Modelle, insbesondere wenn sie auf patienteneigene MOs angewendet werden, haben ihre Wirksamkeit als wirksame Werkzeuge für die In-vitro-Modellierung von Krankheiten unter Beweis gestellt und bieten neue Perspektiven und Methoden auf dem Gebiet der fortschrittlichen 3D-Zellkultur.

Protokoll

Die iPSCs, die aus humanen normalen Fibroblasten Detroit 551 und humanen embryonalen Stammzellen (ESCs) der hESC-Linie 360 erzeugt wurden, wie zuvor beschrieben⁴. Die iPSCs wurden mit Genehmigung des Westnorwegischen Komitees für ethische Gesundheitsforschung REK nr. 2012/919. Alle Zellen wurden regelmäßig mit dem MycoAlert Mycoplasma Detection Kit auf Mykoplasmenkontamination überwacht. Die Materialtabelle enthält Informationen über alle Materialien, Reagenzien und Geräte, die in diesem Protokoll verwendet werden. Tabelle 1 beschreibt die verwendeten Medien und sonstigen Materialien.

1. Auftauen von iPSCs

1. Matrixbeschichtete Platte und Essential 8 (E8) Mediumvorbereitung
   1. Tauen Sie das Basalmembranmatrix-Fläschchen über Nacht auf Eis auf. 1:100 in kaltem Advanced Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)/Ham's F12 DMEM/F12 (1 % Endkonzentration) verdünnen (siehe Materialtabelle und Tabelle 1). Lagern Sie die Aliquote für den Langzeitgebrauch bei -20 °C.
   2. Tauen Sie die verdünnte Basalmembran bei 4 °C auf; Beschichten Sie eine 6-Well-Platte mit 1 ml Lösung pro Well. Bei 37 °C 1 h inkubieren.
   3. Nehmen Sie die Platte aus dem Inkubator und lassen Sie sie auf Raumtemperatur (RT) ausgleichen.
      HINWEIS: Die Platten können maximal 2 Wochen im Kühlschrank aufbewahrt werden (vor Gebrauch auf RT erwärmen). Für eine längere Lagerung geben Sie 1 ml E8 Medium (siehe Materialtabelle und Tabelle 1) in die beschichtete Platte, um ein Austrocknen des Gels zu vermeiden.
2. E8 mittlere Zubereitung
   1. Kombinieren Sie in einer sterilen Umgebung das E8-Basalmedium mit dem E8-Präparat (siehe Materialtabelle und Tabelle 1).
      HINWEIS: Dieser kann 2 Wochen lang bei 4 °C gelagert werden. Tauen Sie das gefrorene E8-Präparat über Nacht bei 4 °C auf, bevor Sie das volle Medium zubereiten. Nicht bei 37 °C auftauen, da dies die Stabilität beeinträchtigen kann. Erwärmen Sie vor dem Gebrauch nur die erforderliche Menge E8 Medium auf Raumtemperatur (RT), bis es sich nicht mehr kühl anfühlt.

2. Aussaat von iPSCs

1. Die matrixbeschichteten Platten und E8 Medium bei RT oder Inkubator bei 37 °C vorwärmen.
2. Nährmedium aspirieren; Spülen Sie iPSCs, die eine Konfluenz von 60 % bis 70 % aufweisen, mit Dulbecco's phosphatgepufferter Kochsalzlösung ohne Calcium und Magnesium (DPBS Ca²⁺/Mg²⁺-frei, 4 mL pro Well in einer 6-Well-Platte).
3. Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA, 0,5 mM, 1 mL pro Vertiefung, siehe Materialtabelle und Tabelle 1) zugeben; Bei 37 °C inkubieren, bis sich die Ränder des Bienenvolkes lösen (3-5 min).
4. Aspirieren Sie die Dissoziationslösung; Um Kolonien zu lösen, pipettieren Sie das vorgewärmte E8 Medium (4 mL pro Well) vorsichtig direkt auf die Kolonien mit einer stärkeren Kraft als üblich aus der Pipette, wodurch eine lokalisierte Flüssigkeitsbewegung über die Zelloberfläche erzeugt wird.
5. Teilen Sie die Zellen im Verhältnis 1:2 auf, indem Sie sie in zwei neue Vertiefungen einer matrixbeschichteten 6-Well-Platte überführen und 2 ml Medium pro Vertiefung hinzufügen. Anschließend bei 37 °C inkubieren.
6. Tauschen Sie die Medien täglich aus, bis die Kolonien zu 80% zusammenfließen.
7. Beobachten Sie die Kolonien mit einem Mikroskop bei 10-facher Vergrößerung, um sicherzustellen, dass sie eine angemessene Größe haben, die sich typischerweise durch eine ausgeprägte, runde Form mit einem Durchmesser von 0,5 bis 1 mm auszeichnet. Vergewissern Sie sich, dass es sich bei den Kolonien um dichte, kompakte Strukturen mit abgegrenzten, glatten Rändern handelt.

3. Neuronale Induktion

1. Mittlere Vorbereitung und Einrichtung von Tag 0
   1. Bereiten Sie jeweils 500 ml chemisch definiertes Medium (CDM), neuronales Induktionsmedium (NIM) und neuronales Stammzellserum-freies (NSC SF) Medium unter Bezugnahme auf die Materialtabelle und Tabelle 1 vor.
   2. Spülen Sie die Zellen in einer 6-Well-Platte mit 4 mL DPBS (1x) (Ca²⁺/Mg²⁺- frei) pro Well, gefolgt von der Zugabe von 3 mL NIM pro Well für die Einrichtung an Tag 0.
   3. Ersetzen Sie NIM (3 mL pro Well) an den Tagen 1, 3 und 5; Täglich unter dem Mikroskop beobachten.
   4. Trennen Sie an Tag 6 die neuralen Rosetten mit den folgenden Schritten in eine Suspensionskultur.
      1. Einmal vorsichtig mit DPBS (1x) (Ca²⁺/Mg²⁺-frei) waschen (4 mL pro Vertiefung in einer 6-Well-Platte). Kollagenase IV (1 ml pro Vertiefung in einer 6-Well-Platte) hinzufügen und 1 Minute inkubieren. Entfernen Sie die Kollagenase IV und spülen Sie sie einmal vorsichtig mit DPBS (1x) (Ca²⁺/Mg²⁺-frei) ab (4 mL pro Vertiefung in einer 6-Well-Platte).
      2. Geben Sie 2 mL NSC SF Medium in jede Vertiefung einer 6-Well-Platte. Entfernen Sie die Zellen, indem Sie die Vertiefungsböden abkratzen und mit einer 200-μl-Pipettenspitze Gitter erstellen.
      3. Übertragen Sie die Zellsuspension von der 6-Well-Platte in eine 10 cm große, nicht anhaftende Schale. Stellen Sie das Volumen mit NSC SF Medium auf 12 mL ein.
      4. Die nicht haftende Schale auf den Schüttler (SSM1 Compact Orbital Shaker) bei 85 U/min im Winkel von 0° in einen auf 37 °C eingestellten Inkubator mit 5 % CO₂ stellen, um eine Aggregation zu verhindern.

4. Musterung des Mittelhirns

1. An Tag 7 fügen Sie 12 mL CDM mit 100 ng/ml FGF-8b hinzu; Auf den orbitalen Shaker-Inkubator stellen.
2. Wechseln Sie an den Tagen 8-13 alle 2 Tage das Medium; Täglich unter dem Mikroskop beobachten.
3. An Tag 14 fügen Sie 12 ml CDM mit 100 ng/ml FGF-8b und 1 μM Purmorphamin (PM) hinzu; Auf den Orbitalschüttler stellen.
4. Wechseln Sie an den Tagen 15-20 alle 2 Tage das Medium; Täglich unter dem Mikroskop beobachten.

5. Matrigel-Einbettung und MO-Terminierung und -Reifung

1. Matrigel auf Eis bei einer Temperatur zwischen 2 °C und 8 °C für eine Dauer von 1-2 h auftauen.
   HINWEIS: Tauen Sie eine ausreichende Menge Matrigel auf, um 15 μl für jeden Embryoidkörper (EB) bereitzustellen. Bewahren Sie Matrigel auf Eis ab, um eine frühe Polymerisation zu vermeiden. Kühlen Sie alle Kunststoffe, die mit Matrigel in Berührung kommen, vor der Verwendung mindestens 30 Minuten lang bei -20 °C ab.
2. Legen Sie ein steriles Organoid-Einbettblatt in eine leere Schale.
3. Nehmen Sie das Organoid mit einer 200-μl-Pipettenspitze mit breiter Bohrung vorsichtig aus der Schale und übertragen Sie es mit einem Organoid pro Vertiefung auf die Einbettungsoberfläche. Wiederholen Sie diesen Vorgang, bis sich 12-16 EBs auf der Einbettungsfläche angesammelt haben.
4. Entfernen Sie vorsichtig das überschüssige Medium von jedem EB und fügen Sie dann 15 μl kaltes Matrigel tropfenweise auf jedes EB hinzu. Positionieren Sie das EB mit Hilfe einer Pipette wieder in die Mitte des Matrigel-Tröpfchens.
5. Inkubieren Sie die Platte in einem auf 37 °C eingestellten Inkubator für 15-20 Minuten, damit das Matrigel polymerisieren kann.
6. Heben Sie mit einer sterilen Pinzette das Einbettblatt mit den Matrigel-Tröpfchen an. Halten Sie das Blech direkt über einer Vertiefung in einer 6-Well-Platte mit extrem geringer Haftung. Pipettieren Sie 3 ml CDM mit 10 ng/ml Brain-Derived Neurotrophic Factor (BDNF) und 10 ng/ml Glial cell line-Derived Neurotrophic Factor (GDNF) und spülen Sie die Matrigel-Tröpfchen vorsichtig aus dem Blatt in jede Vertiefung. Wiederholen Sie diesen Vorgang, bis alle 6-8 Matrigel-Tröpfchen in eine Vertiefung überführt sind.
7. Legen Sie die Platten auf einen Orbitalschüttler in einem 37 °C Inkubator bei 85 U/min und wechseln Sie das CDM alle 3 Tage mit 10 ng/mL BDNF und 10 ng/mL GDNF.
   HINWEIS: Pflegen Sie differenzierende Kulturen bis zu 3 Monate lang; Die neuronale Morphologie tritt 2 Wochen nach der Beendigung auf. BDNF und GDNF sind für eine Kultivierung über 3 Monate hinaus nicht erforderlich.

6. Immunfluoreszenz-Färbung

1. Verwenden Sie eine 1.000-μl-Pipette, um das Organoid vorsichtig aus dem Medium zu entnehmen, und platzieren Sie es vorsichtig auf einem Objektträger mit minimalem Medium.
2. Lassen Sie es vollständig an der Luft trocknen und geben Sie 4 % Paraformaldehyd (PFA) (300 μl pro Probe) für 30 Minuten hinzu.
   HINWEIS: PFA ist gefährlich und kann krebserregende Eigenschaften haben. Gehen Sie vorsichtig damit um, vermeiden Sie direkten Kontakt mit Haut und Augen und stellen Sie sicher, dass sie in einem chemischen Abzug verwendet werden.
3. Geben Sie 30%ige Saccharoselösung (300 μl pro Probe) zu den Objektträgern und lassen Sie sie über Nacht bei 4 °C inkubieren.
4. Blockieren und pervenieren Sie die Organoide durch Zugabe von Blockierungspuffer (BB) (300 μl pro Probe), der PBS (mit Ca²⁺/Mg²⁺), 0,3 % Triton X-100 und 10 % normales Ziegenserum für 2 Stunden bei RT (oder über Nacht bei 4 °C) enthält. Verwenden Sie einen hydrophoben Barrierestift, um die Organoide abzugrenzen und den Puffer auf dem Objektträger einzuschließen.
5. Die Proben werden mit einem geeigneten Volumen Primärantikörper in Blockierungspuffer (300 μl pro Probe), Anti-Forkhead-Box-Protein G1 (FOXG1, 1:200), Anti-Orthodentikel-Homöobox 2 (OTX2, 1:100), Anti-Forkhead-Box A2 (FOXA2, 1:100), Anti-Tyrosin-Hydroxylase (TH, 1:100), Anti-SRY (geschlechtsbestimmende Region Y)-Box 2 (SOX2, 1:100), anti-gepaartes Box-Protein (PAX6, 1:100) und anti-Mikrotubuli-assoziiertes Protein 2 (MAP2 1:500) abgedeckt. und über Nacht bei 4 °C im Dunkeln inkubieren (siehe Materialtabelle).
6. Waschen Sie die Proben in 1x PBS für 3 h mit zwei bis drei Pufferwechseln auf einer leicht schaukelnden Plattform.
7. Inkubieren Sie mit dem Sekundärantikörper (300 μl pro Probe), anti-Alexa Fluor 488 (1:800), anti-Alexa Fluor 594 (1:800) und anti-Alexa Fluor 647 (1:800) über Nacht bei 4 °C in einer befeuchteten Dunkelkammer. Fügen Sie gleichzeitig Hoechst 33342 (1:5.000) Kernfleck hinzu (siehe Materialtabelle).
8. Entfernen Sie den Antikörper, spülen Sie ihn schnell mit PBS aus und fügen Sie anschließend 1-2 Tage lang bei 4 °C PBS mit 0,01 % Natriumazid hinzu, um eine Kontamination zu verhindern.
9. Aspirieren Sie das PBS, entfernen Sie überschüssige Lösung und mounten Sie die Organoide mit einem Einbettmedium (siehe Materialtabelle). Legen Sie ein Deckglas an, um die Bildung von Luftblasen zu verhindern, und lagern Sie es mindestens 12 Stunden lang in einem dunklen Raum bei RT, damit das Eindeckmedium vollständig polymerisieren kann.
   HINWEIS: Die Probe ist nun bereit für die Betrachtung mit einem Fluoreszenzmikroskop.

Ergebnisse

In dieser Studie stellen wir ein bahnbrechendes Protokoll für die Ableitung von MOs aus iPSCs vor. Im Mittelpunkt unserer Methodik steht der innovative Einsatz der Dual-SMAD-Hemmung, synergetisch kombiniert mit FGF-8b und dem Sonic Hedgehog (SHH)-Signalweg-Agonisten Purmorphamin (PM). Dieser Ansatz ist in Abbildung 1 dargestellt. Der Differenzierungsprozess beginnt damit, dass iPSCs in Richtung Neuroektodermlinie gelenkt werden und neuroepitheliale oder neu...

Diskussion

In dieser Untersuchung haben wir eine Methodik zur Unterscheidung von MO von iPSCs entwickelt. Unser Protokoll verwendet eine duale SMAD-Hemmstrategie, die mit morphogenen Faktoren wie FGF-8b und dem SHH-Agonisten PM verstärkt ist. Dieser Ansatz simuliert genau die Entwicklungshinweise, die für die Ontogenese des Mittelhirns entscheidend sind. Der von uns eingerichtete Differenzierungsweg führt zur Bildung von neuroepithelialen Strukturen, die an neuronale Rosetten erinnern, die währ...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
CCD Microscope Camera Leica DFC3000 G	Leica Microsystems, Germany
Chemically Defined Lipid Concentrate	Thermo Fisher Scientific	11905031	CDM ingredient
Collagenase  IV	Thermo Fisher Scientific	17104019	Reagent for gentle dissociation of human iPSCs
Corning non-treated culture dishes	Sigma-Aldrich	CLS430589	Suspension culture
DMEM/F-12, GlutaMAX supplement	Thermo Fisher Scientific	10565018	Astrocyte differentiation basal Medium
DPBS	Thermo Fisher Scientific	14190250	Used for a variety of cell culture wash
EDTA	Thermo Fisher Scientific	15575020	Reagent for gentle dissociation of human iPSCs
Essential 8 Basal Medium	Thermo Fisher Scientific	A1516901	Basal medium for iPSC culture
Essential 8 Supplement (50x)	Thermo Fisher Scientific	A1517101	Supplement for iPSC culture
FCCP	Abcam	ab120081	Eliminates mitochondrial membrane potential and TMRE staining
FGF-basic	PeproTech	100-18B	Astrocyte differentiation medium ingredient
Fluid aspiration system BVC control	Vacuubrand, Germany
Formaldehyde (PFA) 16%	Thermo Fisher Scientific	28908	Cell fixation
GDNF	Peprotech	450-10	DA neurons medium ingredient
Geltrex (Basement membrane matrix)	Thermo Fisher Scientific	A1413302	Used for attachment and maintenance of human iPSCs
GlutaMAX Supplement	Thermo Fisher Scientific	35050061	Supplement for NSC culture
Heracell 150i CO2 Incubators	Fisher Scientific, USA
IMDM	Thermo Fisher Scientific	21980032	Basal medium for CDM
InSolution AMPK Inhibitor	Sigma-Aldrich	171261	Neural induction medium ingredient
Insulin	Roche	1376497	CDM ingredient
iPSCs derived from Detroit 551 fibroblats	ATCC	CCL-110
Leica TCS SP8 STED confocal microscope	Leica Microsystems, Germany
Matrigel	Life Science	354230	Matrigel embedding
Monothioglycerol	Sigma-Aldrich	M6145	CDM ingredient
Normal goat serum	Thermo Fisher Scientific	PCN5000	Used for blocking buffer
Orbital shakers - SSM1	Stuart Equipment, UK
Organoid Embedding Sheet	STEMCELL Technologies	8579	Matrigel embedding
Organoid Embedding Sheet	STEMCELL Technologies	8579
PBS 1x	Thermo Fisher Scientific	18912014	Used for a variety of washes
Poly-D-lysine hydrobromide	Sigma-Aldrich	P7405	Promotes attachment and growth of neural cells in vitro
Poly-L-ornithine solution	Sigma-Aldrich	P4957	Promotes attachment and growth of neural cells in vitro
ProLong Gold Antifade Mountant	Thermo Fisher Scientific	P36930	Mounting the coverslip for confocal image
Purmorphamine	STEMCELL Technologies	72204	Promotes DA neuron differentiation
Recombinant Human/Mouse FGF-8b Protein	R&D Systems	423-F8-025/CF	Promotes DA neuron differentiation
SB 431542	Tocris Bioscience	TB1614-GMP	Neural Induction Medium ingredient
TRITON X-100	VWR International	9002-93-1	Used for cells permeabilization in immunostaining assays
SSM1 compact orbital shaker	Norrscope	51901-10 SSM1 Shaker, orbital, mini 230V	Rotator for organoid culturing.
Water Bath Jb Academy Basic Jba5 JBA5 Grant Instruments	Grant Instruments, USA
Antibodies used for immunostaining
Primary antibody
anti-DAT	Abcam	ab128848, RRID:AB_2665470	Rabbit; 1:100
anti-FOXA2	ProteinTech	22474-1-AP, RRID:AB_2879110	Rabbit; 1:100
anti-FOXG1	Abcam	ab196868, RRID:AB_2892604	Rabbit; 1:200
anti-LMX1	Abcam	ab139726, RRID:AB_2827684	Rabbit; 1:100
anti-MAP2	Abcam	ab5392 ,RRID:AB_2138153	Chicken; 1:500
anti-OTX2	ProteinTech	13497-1-AP, RRID:AB_2157176	Rabbit; 1:100
anti-TH	Abcam	ab75875, RRID:AB_1310786	Rabbit; 1:100
Secondary antibody			Dilution (μL)
Alexa Fluor  594 goat anti-rabbit IgG	Thermo Fisher Scientific	A-11012	1:400
Alexa Fluor  488 goat anti-rabbit IgG	Thermo Fisher Scientific	A- 11008	1:400
Alexa Fluor  488 goat anti-rabbit IgG	Thermo Fisher Scientific	A- 11008	1:400
Alexa Fluor  488 goat anti-rabbit IgG	Thermo Fisher Scientific	A- 11008	1:400
Alexa Fluor  594 goat anti-rabbit IgG	Thermo Fisher Scientific	A-11012	1:400
Alexa Fluor  594 goat anti-rabbit IgG	Thermo Fisher Scientific	A-11012	1:400
Alexa Fluor  647 goat anti-chicken IgG	Thermo Fisher Scientific	A-21469	1:400