Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

يوضح هذا البروتوكول استخدام ملاقط مغناطيسية أحادية الجزيء لدراسة التفاعلات بين البروتينات المرتبطة بالحمض النووي التيلوميري (عامل ربط التيلومير المتكرر 1 [TRF1] و TRF2) والتيلوميرات الطويلة المستخرجة من الخلايا البشرية. يصف الخطوات التحضيرية للتيلوميرات وعوامل الارتباط المتكرر التيلوميرية ، وتنفيذ تجارب الجزيء الوحيد ، وطرق جمع البيانات وتحليلها.

Abstract

تعتبر التيلوميرات ، وهي الهياكل الواقية في نهايات الكروموسومات ، ضرورية للحفاظ على طول عمر الخلية واستقرار الجينوم. تعتمد وظيفتها الصحيحة على عمليات منظمة بإحكام للنسخ المتماثل والاستطالة والاستجابة للضرر. يلعب مجمع الملاءة ، وخاصة عامل التيلومير المتكرر 1 (TRF1) و TRF2 ، دورا محوريا في حماية التيلومير وقد برز كهدف محتمل مضاد للسرطان لاكتشاف الأدوية. ترتبط هذه البروتينات بزخارف الحمض النووي التيلوميرية المتكررة TTAGGG ، مما يسهل تكوين الهياكل الواقية وتجنيد البروتينات التيلوميرية الأخرى. قدمت الأساليب الهيكلية وتقنيات التصوير المتقدمة رؤى حول تفاعلات البروتين والحمض النووي التيلوميري ، لكن التحقيق في العمليات الديناميكية يتطلب مناهج أحادية الجزيء. تم استخدام أدوات مثل الملقط المغناطيسي والملاقط البصرية والفحص المجهري للقوة الذرية (AFM) لدراسة تفاعلات البروتين التيلوميري والحمض النووي ، مما يكشف عن تفاصيل مهمة مثل تشويه الحمض النووي المعتمد على TRF2 وتحفيز التيلوميراز. ومع ذلك ، فإن إعداد تركيبات أحادية الجزيء ذات الزخارف المتكررة التيلوميرية لا يزال يمثل مهمة صعبة ، مما قد يحد من اتساع نطاق الدراسات التي تستخدم الأساليب الميكانيكية أحادية الجزيء. لمعالجة هذا الأمر ، قمنا بتطوير طريقة لدراسة التفاعلات باستخدام الحمض النووي التيلوميري البشري كامل الطول مع ملاقط مغناطيسية. يصف هذا البروتوكول كيفية التعبير عن TRF2 وتنقيته ، وإعداد الحمض النووي التيلوميري ، وإعداد المقايسات الميكانيكية أحادية الجزيء ، وتحليل البيانات. سيفيد هذا الدليل التفصيلي الباحثين في بيولوجيا التيلومير واكتشاف الأدوية المستهدفة بالتيلومير.

Introduction

التيلوميرات هي هياكل واقية في نهايات الكروموسومات1،2،3. يؤدي تآكل التيلومير أثناء انقسام الخلايا إلى شيخوخة الخلايا والشيخوخة ، بينما يساهم الاستطالة غير الطبيعية للتيلوميرات في الإصابة بالسرطان4،5. لكي تعمل التيلوميرات بشكل صحيح ، يجب أن تكون استجاباتها للتكرار والاستطالة والضرر منظمة للغاية6،7،8. يلعب Shelterin ، المكون من ست وحدات فرعية ، دورا مركزيا في حمايةالتيلومير 9،10،11. سيوفر الفهم الأعمق للتيلوميرات رؤى قيمة في بيولوجيا التيلومير.

TRF1 و TRF2 ، الوحدات الفرعية الأساسية للملاجأ ، هي بروتينات ربط تيلوميرية12،13. يرتبط كل من TRF1 و TRF2 بعزر الحمض النووي المتكرر TTAGGG في التيلوميرات عبر مجالات Myb14. يشكلون ثنائيات من خلال مجالات TRFH المشتركة الخاصة بهم ، والتي تسمح لهم بتطويق الحمض النووي التيلوميري مزدوج الشريطة وتجنيد البروتينات التيلوميرية15،16،17،18،19. TRF2 مهم بشكل خاص لتكوين حلقات D التيلوميرية والحلقات T20،21. نظرا لأدوارهما الحاسمة في حماية التيلومير ، برزت TRF1 و TRF2 كأهداف محتملة للأدوية المضادةللسرطان 22،23،24،25.

تم بذل جهود كبيرة للتحقيق في تفاعلات البروتين والحمض النووي في التيلوميرات. تم استخدام الطرق الكيميائية الحيوية مثل مقايسة تحول الحركة الكهربية (EMSA) ورنين البلازمون السطحي (SPR) لفحص صلات الربط20،26. تم توضيح العديد من هياكل بروتينات الربط التيلوميرية المعقدة بالحمض النووي باستخدام المجهر الإلكتروني بالتبريد (cryo-EM) ، وعلم البلورات بالأشعة السينية ، والرنين المغناطيسي النووي (NMR) 27،28،29. كشفت تقنيات التصوير فائقة الدقة مثل الفحص المجهري لإعادة البناء البصري العشوائي (STORM) عن تكوين حلقة T المعتمدة على TRF221. في الآونة الأخيرة ، تم تطوير تسلسل المسام النانوية لتوصيف التسلسلات التيلوميرية4،30،31. عززت هذه الأفكار الهيكلية بشكل كبير فهمنا لتفاعلات البروتين والحمض النووي التيلوميري. لمزيد من استكشاف ديناميكيات تفاعلات البروتين التيلوميري والحمض النووي ، يعد تطوير تقنيات جديدة أمرا ضروريا.

أدوات الجزيء الواحد هي تقنيات قوية لاستكشاف تفاعلات البروتين والحمض النووي فيالتيلومير 32،33،34. تم استخدام الطرق الميكانيكية أحادية الجزيء ، مثل الملقط المغناطيسي والملاقط البصرية و AFM ، للتحقيق في تشويه الحمض النووي المعتمد على TRF2 ، والكشف عن التراص العمودي بوساطة TRF2 للكروماتين التيلوميري البشري ومراقبة تحفيز التيلوميراز المعالج ، من بين تطبيقات أخرى35،36،37،38،39،40. هذه الطرق مفيدة بشكل خاص لاستكشاف المطابقات الطوبولوجية وحركية ارتباط البروتين والحمض النووي والتفكك.

ومع ذلك ، فإن إعداد تركيبات الجزيء الفردي ذات الزخارف المتكررة التيلوميرية لا يزال يمثل تحديات ، مما يحد من الدراسات باستخدام الأساليب الميكانيكية أحادية الجزيء. لمعالجة هذا القيد ، قمنا بتطوير طريقة ميكانيكية أحادية الجزيء لدراسة تفاعلات البروتين والحمض النووي العالمية على التيلوميرات البشريةكاملة الطول 41. تستخرج هذه الطريقة الحمض النووي التيلوميري مباشرة من الخلايا البشرية ، وتحايل على التحضير الشاق للحمض النووي التيلوميري الاصطناعي. يسهل التحقيق في العمليات الحركية على التيلوميرات الأصلية الطويلة التي تمتد على عدة كيلوقاعد.

في هذا البروتوكول ، نقدم وصفا تفصيليا لخطوات استكشاف تفاعلات البروتين التيلوميري والحمض النووي باستخدام ملاقط مغناطيسية ، وهي أداة ميكانيكية شائعة أحادية الجزيء42،43،44. نوضح كيفية التعبير عن البروتينات التيلوميرية وتنقيتها ، باستخدام TRF2 كمثال ، وكيفية تحضير الحمض النووي التيلوميري من الخلايا البشرية. بالإضافة إلى ذلك ، نوضح كيفية إعداد اختبار أحادي الجزيء على الملقط المغناطيسي لدراسة تفاعلات البروتين التيلوميري والحمض النووي ، ونغطي تحليل البيانات اللاحق لتجارب الجزيء الواحد. سيفيد هذا البروتوكول الباحثين في مجال بيولوجيا التيلومير واكتشاف الأدوية المستهدفة بالتيلومير.

Protocol

1. المواد والأساليب العامة

  1. يرجى الرجوع إلى ملف جدول المواد للاطلاع على الأملاح والمواد الكيميائية والمضادات الحيوية والإنزيمات والأجسام المضادة ومواد الراتنج المستخدمة في هذا البروتوكول.
  2. تحضير الوسط السائل Luria-Bertani (LB) ، وألواح أجار LB ، والمخزن المؤقت HEPES ، والرحلان الكهربائي لجل بولي أكريلاميد SDS (SDS-PAGE) ، والمحلول الملحي المخزن بالفوسفات (PBS) ، ومخزن Tris-EDTA (TE) وفقا للوصفات من بروتوكولات ميناء الربيع البارد45،46،47،48،49،50،51،52،53.
  3. الحصول على ناقل pET28a (Addgene) ، بدائية النواة ، وخطوط الخلايا حقيقية النواة (ATCC) من خلال المصادر التجارية. ثم استزراعها باستمرار ومرورها في المختبر.
  4. لكميات كبيرة من السائل ، الأوتوكلاف عند 120 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة. بالنسبة للأحجام الصغيرة ، استخدم مرشحا معقما بحجم مسام 0.22 ميكرومتر.
  5. اضبط درجة الحموضة في المحاليل على المستوى المطلوب باستخدام حمض الهيدروكلوريك أو هيدروكسيد الصوديوم قبل إحضارها إلى أحجامها النهائية.
    ملاحظة: يتم تصميم الملقط المغناطيسي خصيصا ويتم تشغيله في بيئة LabVIEW 2017 ، بينما يتم إجراء تحليل بيانات الجزيء الفردي في MATLAB 20172،54،55.
  6. لأسباب تتعلق بالسلامة ، ارتد معاطف المختبر ذات الأكمام الطويلة ، وقفازات النتريل (أو القفازات المصنوعة من مادة غير منفذة ومقاومة للمادة) ، ونظارات السلامة أو النظارات الواقية ، والأحذية المغلقة.

2. التعبير عن البروتين وتنقية البروتينات المرتبطة بالحمض النووي التيلوميري

  1. إجراء زراعة الخلايا والحث على التعبير عن البروتين.
    1. أدخل تسلسل الترميز للبروتينات المرتبطة بالحمض النووي التيلوميري (الشكل 1 أ) ، TRF2 كمثال في هذه الحالة ، في متجه pET28a عن طريق هضم الإنزيم وربطه ، مع استخدام SUMO كعلامة اندماج. أدخل بين مواقع التقييد ل BamHI و HindIII ، مما ينتج عنه بلازميد pET28a-SUMO-TRF2 (الشكل 1 ب).
    2. قم بتحويل خلايا BL21 (DE3) باستخدام البلازميد pET28a-SUMO-TRF2.
      1. قم بإذابة 50 ميكرولتر من خلايا BL21 (DE3) المختصة على الجليد.
      2. أضف 1 ميكرولتر من الحمض النووي لبلازميد pET28a-SUMO-TRF2 (الذي يحتوي على 50 نانوغرام من الحمض النووي) إلى الخلايا المختصة. حركها برفق للخلط دون سحب العينة لأعلى ولأسفل.
        ملاحظة: لا تدوام.
      3. احتضن الخليط على الثلج لمدة 30 دقيقة.
      4. للصدمة الحرارية ، قم بتسخين خليط الخلية عند 42 درجة مئوية لمدة 45 ثانية بالضبط في حمام مائي. أعد الخلايا على الفور إلى الجليد لمدة دقيقتين لتثبيت الخلايا المحولة.
      5. أضف 950 ميكرولتر من وسط رطل درجة حرارة الغرفة (RT) إلى الخلايا لتسهيل الاسترداد.
      6. احتضان الخلايا المحولة عند 37 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة أثناء الاهتزاز عند 220 دورة في الدقيقة.
      7. انشر 100 ميكرولتر من خليط التحويل على صفيحة أجار LB تحتوي على 50 ميكروغرام / مل كاناميسين (85.8 ميكرومتر).
      8. احتضان الخلايا المطلية طوال الليل عند 37 درجة مئوية. بعد الحضانة ، حدد مستعمرات مميزة لاستخدامها في تلقيح الثقافات البادئة.
        ملاحظة: يمكن تخزين المستعمرات على الأطباق عند 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى أسبوعين.
    3. التقط مستعمرة من خلايا BL21 (DE3) المحولة وزرعها في 5 مل من وسط LB مكمل ب 50 ميكروغرام / مل كاناميسين (85.8 ميكرومتر). احتضان لمدة 18 ساعة عند 37 درجة مئوية مع الاهتزاز عند 220 دورة في الدقيقة.
    4. للتوسع ، قم بنقل 2 مل من المزرعة الليلية إلى 200 مل من وسط LB الذي يحتوي على 50 ميكروغرام / مل كاناميسين (85.8 ميكرومتر). استمر في الحضانة عند 37 درجة مئوية مع الاهتزاز عند 220 دورة في الدقيقة حتى تصل الكثافة الضوئية عند 600 نانومتر (OD 600) إلى 0.6-0.8.
    5. خذ 1 مل من المزرعة كعينة تحكم غير مستحثة.
    6. حث المزرعة المتبقية بالأيزوبروبيل β-d-1-thiogalactopyranoside (IPTG) إلى تركيز نهائي قدره 1 ملي مولار واحتضانه عند 20 درجة مئوية لمدة 17 ساعة لتعزيز التعبير عن البروتين.
    7. قم بإجراء SDS-PAGE باستخدام جل تكديس بنسبة 5٪ وهلام فصل بنسبة 10٪. قم بتحميل العينات باستخدام المخزن المؤقت للتحميل SDS-PAGE وقم بتشغيل SDS-PAGE في البداية عند 100 فولت لمدة 30 دقيقة ، متبوعا ب 120 فولت لمدة 50 دقيقة في مخزن مؤقت Tris-Glycine. صبغة باللون الأزرق Coomassie لتصور تعبير البروتين (انظر الوصفات في الجدول التكميلي 1) (الشكل 1 ج).
      ملاحظة: راجع المناقشة لاستكشاف الأخطاء وإصلاحها إذا لم يتم ملاحظة التعبير.
  2. تنقية البروتين.
    1. حصاد الخلايا عن طريق الطرد المركزي عند 4 درجات مئوية ، 8500 × جم لمدة 10 دقائق. تخلص من المادة الطافية واغسل الحبيبات في 200 مل من PBS. جهاز الطرد المركزي مرة أخرى ، وتخلص من المادة الطافية ، وأعد تعليق حبيبات الخلية في 25 مل من محلول التحلل (20 ملي مولار HEPES ، 300 ملي كلوريد الصوديوم ، 20 ملي إيميدازول ، 10٪ جلسرين ، 0.5 ملي مولار DTT ، 1 ملي مولار فينيل ميثيل سلفونيل فلوريد [PMSF]).
      تنبيه: PMSF مادة أكالة وسامة وتسبب الحروق. ارتد ملابس واقية وقفازات وحماية للعين / الوجه.
      ملاحظة: قم بالتجميد عند -80 درجة مئوية إذا لم يتم المتابعة على الفور.
    2. أضف 5 ميكرولتر من 100 مجم / مل من الليزوزيم ، و 5 ميكرولتر من 1 U / ميكرولتر DNase I ، و 5 ميكرولتر من 10 مجم / مل RNase A إلى الخلايا المعلقة.
    3. أداء صوتنة على الجليد ، مع رشقات نارية 1 ثانية عند 250 واط متبوعة بتوقف مؤقت لمدة 2 ثانية ، لمدة 30 دقيقة إجمالية.
    4. جهاز طرد مركزي عند 38,000 × جم ، 4 درجات مئوية لمدة 40 دقيقة (30-60 دقيقة مقبول) وتصفية المادة الطافية من خلال مرشح حقنة 0.22 ميكرومتر.
    5. تحضير 500 مل من المخزن المؤقت لربط عمود النيكل عن طريق إذابة 8.76 جم من كلوريد الصوديوم (التركيز النهائي 300 ملم) و 0.68 جم من إيميدازول (التركيز النهائي 20 ملم) في 20 ملي مولار HEPES (درجة الحموضة 8.0). قم بتصفية المحلول من خلال مرشح 0.22 ميكرومتر.
      تنبيه: الإيميدازول خطير ويمكن أن يسبب تهيج الجلد والعين. قد يضر أيضا بالطفل الذي لم يولد بعد. تجنب ملامسة العينين والجلد والملابس. لا تبتلع أو تستنشق. ارتد معدات الحماية الشخصية ، بما في ذلك حماية الوجه.
    6. قم بإعداد مخازن شطف عمود النيكل (20 ملي مولار HEPES (درجة الحموضة 8.0) ، 300 ملي كلوريد الصوديوم) مع تركيزات متزايدة من الإيميدازول (100 ملي مولار ، 200 ملي مولار ، 300 ملي مولار ، 500 ملليمتر) للشطف التدريجي ، مما يضمن تصفية جميع المخازن المؤقتة بشكل مناسب.
    7. قم بتحميل المادة الطافية المفلترة على عمود النيكل المتوازن مسبقا في مخزن مؤقت ملزم (20 ملي مولار HEPES (درجة الحموضة 8.0) ، 300 ملي كلوريد الصوديوم ، 20 ملي إيميدازول). اغسل بمخزن مؤقت ملزم وقم بمسح البروتين بتدرج الإيميدازول المحضر ، وجمع 12 جزءا ، كل منها يحتوي على 1 مل (الشكل 1 ج). امزج الكسور مع نقاء >95٪.
    8. قم بقياس تركيز بروتين الاندماج 6xHis-sumo-TRF2 المملوث بواسطة A280 في مقياس الطيف الضوئي.
    9. بالنسبة للبروتين المستخدم في فحوصات الجزيء الفردي ، أضف بروتياز السومو وفقا لتعليمات الشركة المصنعة (عادة 0.125 وحدة من البروتياز لكل 2 ميكروغرام من بروتين الاندماج) والسماح بالهضم طوال الليل عند 4 درجات مئوية.
    10. بعد معالجة بروتياز السومو ، قم بتحميل الخليط مرة أخرى على عمود النيكل لربط أي بروتين اندماج غير مهضوم والسومو الذي يحمل علامة His ، مما يسمح لبروتين TRF2 الخالي من العلامات بالتدفق. اجمع التدفق.
  3. تحديد تركيز البروتين وتخزين البروتين.
    1. قم بتركيز بروتين TRF2 المنقى باستخدام وحدة مرشح طرد مركزي مقطوعة 30 كيلو دالتون واستبدله في مخزن تخزين يحتوي على 20 ملي مولار HEPES (درجة الحموضة 8.0) ، 150 ملي كلوريد الصوديوم ، 0.5 ملي مولار DTT ، لتقليل تركيز الإيميدازول إلى أقل من 150 مليمتر.
    2. كرر عملية التركيز حتى ينخفض الحجم إلى أقل من 1 مل.
    3. قم بتحليل العينات من كل خطوة تنقية بواسطة SDS-PAGE لتقييم نقاء وسلامة البروتين (الشكل 1 ج).
      ملاحظة: يستخدم كروماتوغرافيا التقارب لتنقية البروتينات ، وجمع العينات المملوءة وغسلها ، وإجراء SDS-PAGE لتقييم سلامة البروتين وضمان مراقبة الجودة. عندما لا يفي كروماتوغرافيا التقارب وحده بمتطلبات النقاء ، يتم استخدام كروماتوغرافيا استبعاد الحجم لزيادة تعزيز نقاء البروتين. تساعد منحنيات امتصاص الأشعة فوق البنفسجية في تقييم كسور الشطف، وتتحقق SDS-PAGE من سلامة البروتين، مما يضمن رقابة صارمة على الجودة طوال العملية.
    4. أضف الجلسرين إلى التركيز النهائي بنسبة 50٪ إلى البروتين المركز والتبادل المؤقت للتخزين.
    5. قم بتخزين البروتين عند -80 درجة مئوية.

3. تحضير شظايا تقييد التيلومير البشري

  1. استخراج الحمض النووي الجيني.
    1. باتباع المخطط الانسيابي (الشكل 2 أ) ، جهاز الطرد المركزي 1 × 107 خلايا عند 1000 × جم لمدة 3 دقائق وتخلص من المادة الطافية. للغسيل ، أعد تعليق الخلايا في 200 ميكرولتر من PBS ، وجهاز الطرد المركزي مرة أخرى عند 1000 × جم لمدة 3 دقائق ، وتخلص من المادة الطافية.
    2. أضف 760 ميكرولتر من المخزن المؤقت الذي يحتوي على 50 ملي مولار Tris-HCl (درجة الحموضة 8.0) و 100 ملي كلوريد الصوديوم و 100 ملي مولار EDTA و 1٪ SDS إلى الأنبوب الذي يحتوي على 1 × 107 خلايا وقم بتعليقها برفق عن طريق سحب العينات لتجنب فقاعات الهواء.
      ملاحظة: لا تدوام.
    3. لهضم البروتينات والقضاء على DNases و RNases في العينة ، أضف البروتيناز K إلى التركيز النهائي البالغ 0.5 مجم / مل ، أي ما يعادل 40 ميكرولتر من محلول مخزون 10 مجم / مل. اضغط على الجزء السفلي من الأنبوب للخلط (لا تقم بالدوامة).
    4. احتضان بين عشية وضحاها عند 37 درجة مئوية.
    5. أضف 265 ميكرولتر من 5.4 M كلوريد الصوديوم. امزج لمدة 5 دقائق عن طريق قلب الأنبوب خمس مرات كل دقيقة ، ثم ضعه على الثلج لمدة 20 دقيقة.
    6. جهاز طرد مركزي بأقصى سرعة (على سبيل المثال ، 16,900 × جم) لمدة 10 دقائق عند RT.
    7. انقل المادة الطافية إلى أنبوب طرد مركزي وأضف حجما متساويا من الأيزوبروبانول (حوالي 750 ميكرولتر) ، وتجنب الدهون أو الرواسب العائمة. الحمض النووي موجود في المادة الطافية.
    8. اقلب الأنبوب خمس مرات للخلط. تأكد بصريا من وجود حبيبات من الحمض النووي تترسب في أنبوب الطرد المركزي.
    9. جهاز طرد مركزي عند RT بأقصى سرعة لمدة 10 دقائق.
    10. تخلص من المادة الطافية. اغسل حبيبات الحمض النووي ب 500 ميكرولتر من 70٪ إيثانول عن طريق قلب أنبوب الطرد المركزي خمس مرات.
      ملاحظة: الحبيبات هي الحمض النووي.
    11. جهاز الطرد المركزي عند RT بأقصى سرعة (على سبيل المثال ، 16,900 × جم) لمدة 10 دقائق.
    12. قم بإزالة كل المادة الطافية بعناية ، وترك حبيبات الحمض النووي. دع الحبيبات تجف في الهواء عند RT لمدة 5 دقائق.
      ملاحظة: تجنب الإفراط في الجفاف ، حيث قد يصبح من الصعب إذابة الحمض النووي الجيني.
    13. أعد تعليق حبيبات الحمض النووي في 475 ميكرولتر من المخزن المؤقت TE (10 ملي مولار Tris-HCl [درجة الحموضة 8.0] ، 1 ملي مولار EDTA). امزج برفق عن طريق النقر على قاع الأنبوب. لهضم الحمض النووي الريبي أثناء تحضير الحمض النووي ، أضف 25 ميكرولتر من 10 مجم / مل RNase A (التركيز النهائي 0.5 مجم / مل) واخلطه عن طريق النقر برفق حتى تذوب حبيبات الحمض النووي تماما.
      ملاحظة: تجنب الدوامة لمنع قص الحمض النووي.
    14. احتضان عينة الحمض النووي عند 4 درجات مئوية طوال الليل.
    15. قم بإجراء استخراج الفينول المشبع بحجم متساو: أضف 500 ميكرولتر من الفينول إلى أنبوب الطرد المركزي ، واخلطه برفق باستخدام ماصة ، وجهاز طرد مركزي بأقصى سرعة لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية.
      تنبيه: قد يسبب التعرض للفينول تهيجا للجلد والعينين والأنف والحلق والجهاز العصبي. تجنب ملامسة العينين والجلد والملابس. لا تبتلع أو تستنشق. ارتد معدات الحماية الشخصية ، بما في ذلك حماية الوجه.
      ملاحظة: الحمض النووي في الطور المائي العلوي ، والبروتينات في الطور البيني ، والمرحلة العضوية في الأسفل.
    16. كرر ثلاث مرات. خذ المادة الطافية للحمض النووي (حوالي 280 ميكرولتر).
    17. وفقا لحجم عينة الحمض النووي ، أضف 1/10 حجم (28 ميكرولتر) من أسيتات الصوديوم 3 M (التركيز النهائي 0.3 M ، درجة الحموضة 5.2) و 2 حجم (616 ميكرولتر) من الإيثانول البارد 100٪. ضع أنبوب الطرد المركزي عند -80 درجة مئوية لمدة 2-3 ساعات.
    18. جهاز طرد مركزي بأقصى سرعة (على سبيل المثال ، 16,900 × جم) لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية. قم بإذابة المحلول على الثلج إذا تم تجميده قبل الطرد المركزي.
    19. تخلص من المادة الطافية واغسلها 3-4 مرات باستخدام 70٪ من الإيثانول عن طريق قلب أنبوب الطرد المركزي. جهاز طرد مركزي بأقصى سرعة لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية.
    20. قم بإزالة الإيثانول واترك الحبيبات تجف في الهواء عند RT لمدة 5 دقائق.
    21. أضف 100 ميكرولتر من المخزن المؤقت TE ، واضغط على الأنبوب للخلط ، واتركه عند 4 درجات مئوية لمدة ساعتين ليذوب تماما.
      ملاحظة: افحص سلامة الحمض النووي الجيني على هلام الاغاروز بنسبة 1٪ (الشكل 2 ب).
    22. قم بتخزين الحمض النووي عند -20 درجة مئوية في الفريزر. ستبقى مستقرة لمدة عام واحد على الأقل.
  2. إجراء هضم الحمض النووي الجيني وتعديله.
    1. خذ 4 ميكروغرام من الحمض النووي الجيني وامزجه مع 1 ميكرولتر من CviAII (10 U) ، 2 ميكرولتر من 10x عازلة الهضم (انظر الجدول التكميلي 1 للحصول على وصفات) ، وأضف الماء للوصول إلى الحجم الإجمالي 20 ميكرولتر. احتضن الخليط عند 25 درجة مئوية لمدة 12 ساعة.
      ملاحظة: يمكن أن تحل FatI محل CviAII ، والتي تم إيقافها الآن بواسطة NEB.
    2. أضف 1 ميكرولتر من NdeI (20 U) ، و 1 ميكرولتر من MseI (10 U) ، و 1 ميكرولتر من BfaI (10 U) إلى نفس الأنبوب الذي يحتوي على الخليط السابق (20 ميكرولتر). أضف أيضا 2 ميكرولتر من محلول الهضم 10x و 15 ميكرولتر من الماء لتحقيق حجم إجمالي يبلغ 40 ميكرولتر. احتضن عند 37 درجة مئوية لمدة 12 ساعة ، ثم قم بتعطيل جميع الإنزيمات بالحرارة عند 80 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة.
      ملاحظة: يمكن فحص هضم الحمض النووي الجيني باستخدام طريقة جزء التقييد النهائي (TRF) (الشكل 2 ج). يؤدي الجمع بين إنزيمات التقييد الأربعة (CviAII و NdeI و MseI و BfaI) إلى هضم الحمض النووي الجيني إلى أجزاء من حوالي 800 نقطة أساس وينتج TRFs مع الحد الأدنى من تلوث الحمض النووي تحت التيلوميري.
    3. لتعديل Digoxigenin ، خذ 40 ميكرولتر من الحمض النووي الجيني المهضوم وأضف 4 ميكرولتر من 1 ملي مولار dATP (التركيز النهائي 0.08 ملليمتر) ، 4 ميكرولتر من 1 ملي مولار digoxigenin-11-dUTP (التركيز النهائي 0.08 مليمتر) ، 1 ميكرولتر من جزء Klenow (5 U) ، 0.5 ميكرولتر من 100 ملي DTT (التركيز النهائي 1 ملليمتر) ، و 1 ميكرولتر من 10x المخزن المؤقت للهضم. احتضن عند 37 درجة مئوية لمدة 12 ساعة ، متبوعا بالتسخين عند 75 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة لتعطيل جزء Klenow.
    4. لوضع العلامات على البيوتين ، خذ 12.5 ميكرولتر من الحمض النووي الجيني المعدل بالديجوكسيجينين (1 ميكروغرام) وأضف 1 ميكرولتر من مسبار التيلومير الحيوي 1 ميكرومتر (أي 1 ميكرو بالمول) المكملة للنتوء التيلوميري أحادي الشريطة. أضف 611.5 ميكرولتر من المخزن المؤقت TE Li (10 ملي مولار Tris-HCl (الرقم الهيدروجيني 8.0) ، 1 ملي مولار EDTA ، 50 ملي ليكلوريد الهيدروكسيوم) لتخفيف أيونات 50 ملي كلفن إلى 1 ملي مولار ، مما يجعل الحجم الإجمالي 625 ميكرولتر ، والتي يمكن تقسيمها إلى 16 أنبوبا بسعة 39 ميكرولتر لكل منها.
    5. سخني عند 75 درجة مئوية لمدة 3 دقائق في دورة حرارية ، ثم اخفضي درجة الحرارة بمقدار 0.1 درجة مئوية كل 30 ثانية حتى تصل إلى 25 درجة مئوية.
    6. قم بتخزين عينات الحمض النووي عند -20 درجة مئوية لمدة عام على الأقل.

4. إنشاء خلية تدفق لعينة الحمض النووي التيلوميري على ملاقط مغناطيسية

  1. اصنع خلية تدفق لمقايسات الجزيء الواحد.
    1. استخدم مطحنة كهربائية لحفر ثقوب كمدخل ومخرج على الغطاء العلوي (# 2 غطاء زجاجي بسمك 0.2 مم).
    2. قم بتنظيف أغطية المنظفات عن طريق الصوتنة لمدة 30 دقيقة.
    3. اغسل زلات الغطاء بالماء فائق النقاء 3 مرات.
    4. قم بتنظيف الأغطية في الأيزوبروبانول عن طريق الصوتنة لمدة 30 دقيقة.
    5. اغسل الغطاء بالماء فائق النقاء 3 مرات.
    6. قم بتنظيف الأغطية في نقاء فائق عن طريق الصوتنة لمدة 15-30 دقيقة.
    7. جفف الغطاء بالنيتروجين.
      ملاحظة: يمكن إيقاف البروتوكول هنا ويمكن تخزين أغطية التنظيف لاستخدامها لاحقا.
    8. قم بتغطية الغطاء السفلي (بدون ثقوب) ب 20 ميكرولتر من 0.1٪ نيتروسليلوز وأضف حبات مرجعية (تخفيف 20x ، قطر 3 ميكرومتر). اخبزيها على حرارة 100 درجة مئوية لمدة 4 دقائق.
    9. استخدم مشرطا لقطع فواصل البارافيلم مزدوجة الطبقة وفقا لقالب معدني. القالب عبارة عن قطعة مستطيلة من سبائك الألومنيوم بنفس أبعاد الغطاء ، وتتميز بمركز مجوف لتسهيل قطع القناة.
    10. قم بتجميع شطيرة خلية التدفق (الشكل 3 أ). يسخن عند 85 درجة مئوية ويستخدم مسحتين للتدليك حتى يغلق البارافيلم القناة.
    11. قم بتغطية خلية التدفق بجسم مضاد. حقن 70 ميكرولتر من الجسم المضاد للديجوكسيجينين (0.1 مجم / مل) مباشرة في خلية التدفق. اتركيه في RT لمدة 1 ساعة.
    12. تخميل خلية التدفق. حقن 70 ميكرولتر من 10 مجم / مل BSA لإزاحة الجسم المضاد للديجوكسيجينين. اتركيه في RT لمدة 12 ساعة. سيتم التخلص من الأجسام المضادة غير المنضمة المضادة للديجوكسيجينين في الخطوات التالية مع التنظيف الصارم.
      ملاحظة: قم بتخزين خلية التدفق عند 4 درجات مئوية لمدة 1-2 أسابيع.
    13. اختبر الارتباط غير المحدد عن طريق شطف 5 ميكرولتر من حبات MyOne المغسولة (10 مجم / مل) (أو 5 ميكرولتر من حبات M270 المغسولة (10 مجم / مل)) بدون حمض نووي في خلية التدفق. اتركيه لمدة 10 دقائق ، ثم انزع الخرزات بعيدا باستخدام مخزن مؤقت يعمل (20 ملي هيبس (درجة الحموضة 7.5) ، 100 ملي كلوريد الصوديوم ، 1 ملي مولار EDTA). احسب عدد الخرزات الملتصقة على السطح في مجال رؤية واحد. يجب أن يظهر السطح المعالج جيدا صفرا أو عددا قليلا من الخرز.
  2. عزل وشل حركة حبال الحمض النووي التيلوميري في خلية التدفق.
    1. خذ 10 ميكرولتر من حبات M270 (10 مجم / مل) أو 5 ميكرولتر من 10 مجم / مل MyOne واغسلها خمس مرات ب 50 ميكرولتر من المخزن المؤقت العامل (20 ملي مولار HEPES [الرقم الهيدروجيني 7.5] ، 100 ملي كلوريد الصوديوم ، 1 ملي مولار EDTA) باستخدام مغناطيس.
    2. خذ 500 نانوغرام من الحمض النووي الجيني المهضوم وضعه في أنبوب طرد مركزي سعة 1.5 مل. أضف كل الخرزات (50 ميكرولتر) فوق عينة الحمض النووي.
    3. بدون سحب العينات، قم بنفض أنبوب الطرد المركزي برفق عدة مرات لخلط الخرزات وعينة الحمض النووي. اترك الخليط على الثلج لمدة 1 ساعة. اغسل ب 500 ميكرولتر من المخزن المؤقت ثلاث مرات باستخدام مغناطيس لسحب الخرزات لأسفل، مع فترات 10 دقائق بين الغسيل.
    4. أعد تعليق العينة باستخدام 30 ميكرولتر من المخزن المؤقت للعمل وقم بتحميل الخليط في خلية التدفق. اتركيه لمدة 30 دقيقة. امسح الخرز المغناطيسي غير المقيد.
      ملاحظة: يتم ربط الحمض النووي التيلوميري بين زلة الغطاء السفلي والخرزة المغناطيسية من خلال تفاعلات التقارب بوساطة الجسم المضاد للديجوكسيجينين والبيوتين والستربتافيدين (الشكل 3 ب).
  3. قم بإعداد خلية تدفق على ملاقط مغناطيسية
    1. نظف خلية التدفق بنسبة 70٪ من الإيثانول وجفف السطح باستخدام مناديل العدسة. ضع خلية التدفق التي تم تنظيفها على حامل العينة السفلي وقم بتجميع رف العينة العلوي برفق باستخدام مفك البراغي.
    2. ضع قطرة من زيت العدسة على السطح السفلي لخلية التدفق ، حيث تتماشى مع العدسة الشيئية. بعد ذلك ، ضع حامل العينة أعلى العدسة الموضوعية وقم بتثبيته باستخدام مفك البراغي.
    3. حدد زوجا من المغناطيس المكعب 5 مم مرتبة في تكوين رأسي. قم بمحاذاة حامل المغناطيس مع المحور X لمسار ضوء الملقط المغناطيسي للتصوير.
      ملاحظة: هذه خطوة حاسمة. يتم محاذاة اتجاه المجال المغناطيسي وبالتالي يتم تحديده من خلال اتجاه حامل المغناطيس.
    4. قم بتشغيل برنامج البرمجة الرسومية وقم بتوصيل وحدات التحكم بالملاقط المغناطيسية. اضبط مجال الرؤية لتحديد موقع حبة مرجعية في الجزء السفلي من خلية التدفق واضبط العدسة الموضوعية قليلا بحيث تظهر الخرزة المرجعية حلقات حيود واضحة.
    5. حرك المغناطيس لأسفل إلى أعلى خلية التدفق.
      ملاحظة: هذه خطوة حاسمة. تشير التغييرات المفاجئة في نمط حيود الخرزة إلى أن المغناطيس قد لامس للتو سطح خلية التدفق. يعتبر هذا الموضع هو الإزاحة لقياس نقطة الصفر.
      ملاحظة: اخفض المغناطيس بعناية ، بدءا من خطوات أكبر والانتقال تدريجيا إلى خطوات أصغر. تحرك بزيادات قدرها 0.1 مم لتجنب إتلاف خلية التدفق عند الاقتراب من خلية التدفق.
    6. ارفع المغناطيس إلى أعلى موضع له وقم بإزالة حامل المغناطيس.
    7. قم بتشغيل المضخة التمعجية المتصلة بزجاجة النفايات وتخلص من السائل. أضف 100 ميكرولتر من المخزن المؤقت للعمل إلى المدخل واضبط معدل تدفق المضخة التمعجية على 100 ميكرولتر / دقيقة لملء خلية التدفق بالمخزن المؤقت.

5. قياسات التيلومير باستخدام ملاقط مغناطيسية أحادية الجزيء

  1. قم بإعداد الكاميرا.
    1. اضبط التدرج الرمادي لكاميرا أشباه الموصلات التكميلية بأكسيد المعادن (CMOS) مع ضبط السطوع على 150 مستوى.
    2. تحديد حجم منطقة الاهتمام (ROI).
    3. اضبط معدل الإطارات على 200 هرتز مع وقت تعريض ضوئي يبلغ 5000 ميكرو ثانية.
      ملاحظة: هذه خطوة حاسمة. تأكد من ضبط وقت الغالق الميت على الصفر.
    4. حرك موضع المغناطيس إلى 3 سم (حوالي 8 pN) واضبط التركيز الموضوعي على الخرز.
  2. إنشاء جدول البحث (LUT).
    1. انقل المغناطيس إلى موضع يتوافق مع 8 pN لتمديد الخرزة المغناطيسية المربوطة بالحمض النووي بإحكام.
    2. اضبط جدول البحث على 200 خطوة بحجم خطوة 0.05 ميكرومتر.
    3. استخدم كاميرا CMOS لالتقاط ملفات تعريف الخرز المغناطيسي في مواضع مختلفة لإنشاء جدول البحث.
      ملاحظة: هذه خطوة حاسمة. تعمل حبات البوليسترين المثبتة في خلية التدفق كحبات مرجعية للقضاء على الانجراف للحبات ذات الأهمية.
  3. تصميم تجربة ميكانيكية أحادية الجزيء.
    1. اكتب برنامجا نصيا في MATLAB للتحكم في حركات المحرك لمنحدر القوة أو فحوصات قفزة القوة.
      ملاحظة: هذه خطوة حاسمة. يقوم هذا البرنامج النصي بتشفير أوامر حركات المغناطيس. يتم تعيين معدل تحميل القوة في هذه الخطوة لمقايسة منحدر القوة. يتم أيضا تحديد مستويات ومدد فحوصات قفزة القوة هنا (الشكل 4 ، الملف التكميلي 1 ، الملف التكميلي 2 ، والملف التكميلي 3).
    2. قم باستيراد البرنامج النصي إلى برنامج برمجة رسومية لاختبار تجارب الجزيء الواحد.
    3. تحقق من إجمالي الإطارات المطلوبة لتشغيل تجربة الجزيء الفردي وتأكد من أن الذاكرة المتوفرة تتجاوز هذا المطلب.
      ملاحظة: ستفقد البيانات إذا كانت الذاكرة المخصصة أقل من المطلوب لأن حفظ البيانات يستغرق وقتا.
    4. تحقق من سرعة التصوير القصوى لتحديد الحد الأقصى لعدد الخرزات التي يمكن مراقبتها في وقت واحد.
      ملاحظة: سيتم إنهاء التجربة إذا تم تجاوز حد سرعة التصوير.
    5. باستخدام مقايسة قفزة القوة كمثال ، قم بإجراء التجربة الميكانيكية أحادية الجزيء. يتم تطبيق القوى فجأة على الخرزة المغناطيسية ، التي تنقل هذه القوى إلى جزيء الحمض النووي ، وتمدها على الفور لأعلى.

6. قياسات TRF1 / 2 على التيلومير باستخدام ملاقط مغناطيسية

  1. اختبار منحدر القوة
    1. باستخدام TRF1 كمثال ، قم بتحميل 200 ميكرولتر من 10 نانومتر TRF1 في خلية التدفق بمعدل تدفق بطيء (على سبيل المثال ، 30 ميكرولتر / دقيقة). اترك 30 دقيقة حتى يرتبط TRF1 بالحمض النووي التيلوميري.
    2. اختر برنامجا نصيا لتجربة منحدر القوة بمعدل تحميل قوة يبلغ ±1 pN/s.
    3. قم بتسمية ملفات البيانات بشكل مناسب وقم بتشغيل التجربة. سيتم حفظ البيانات في الوجهة المحددة للتحليل (الشكل 5).
      ملاحظة: خلال هذه التجربة ، تزداد القوة وتنخفض خطيا بين 0 pN و 17 pN ، مما يمتد ويريح الحمض النووي التيلوميري ويكسر حلقات الحمض النووي بوساطة TRF1 / 2.
  2. اختبار القفز بالقوة
    1. حدد برنامجا نصيا لتشغيل مقايسة قفزة القوة.
      ملاحظة: يتم تطبيق قوى مختلفة لتمديد الحمض النووي التيلوميري ، على سبيل المثال ، "قوة الراحة" (فريست) عند 0 pN لمدة 40 ثانية ، و "قوة الاختبار" (Ftest) تتراوح من 2-8 pN لمدة 60 ثانية ، و "القوة العالية" (Fhigh) عند 10 pN لمدة 30 ثانية ، و "القوة القصوى" (Fmax) عند 20 pN لمدة 30 ثانية.
    2. قم بتسمية ملفات البيانات بشكل مناسب وقم بتشغيل التجربة. سيتم حفظ البيانات في الوجهة المحددة للتحليل (الشكل 5).

النتائج

يوضح الشكل 1 أ المجالات والهياكل التخطيطية ل TRF1 و TRF2 ، والتي تتكون من 439 و 542 من الأحماض الأمينية ، على التوالي ، والتي يمكن التعبير عنها في الخلايا بدائية النواة. تم وصف إعداد TRF1 سابقا في الأدبيات41. هنا ، نقدم وصفا شاملا ونتائج تمثيلية لإعداد TRF...

Discussion

يستخدم هذا البروتوكول ملاقط مغناطيسية لمعالجة TRFs على مستوى الجزيء الفردي57،58،59. نحن نستخدم الخرز المغناطيسي لفصل TRFs عن شظايا الحمض النووي الجيني. بعد تقييد الهضم ، ترتبط TRFs بالخرز المغناطيسي ، مما يتيح فصلها بسهولة عن ش...

Disclosures

ويعلن أصحاب البلاغ عدم وجود مصالح مالية متنافسة أو أي تضارب في المصالح.

Acknowledgements

تم دعم هذا العمل من قبل المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين [منحة 32071227 إلى Z.Y.] ، ومؤسسة تيانجين للعلوم الطبيعية في بلدية الصين (22JCYBJC01070 إلى Z.Y.) ، ومختبر الدولة الرئيسي لتكنولوجيا وأدوات القياس الدقيق (جامعة تيانجين) [منحة pilab2210 إلى Z.Y.].

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Anti-DigoxigeninRoche11214667001
BfaINew England Biolab (NEB)R0568S
BSASigma-AldrichV900933
CMOS camera MikrotronMC1362
CviAIINew England Biolab (NEB)R0640S
DIG-11-dUTPJena BioscienceNU-803-DIGXL
DNA extraction solutionG-CLONEEX0108
Dnase I, Rnase-Free, Hc EaThermo Fisher ScientificEN0523
dNTP mixtureNanjing Vazyme Biotech Co., Ltd (Vazyme)P032-02
DTTSolarbioD1070
Dynabeads M-270  beadsThermo Fisher Scientific65305Streptavidin beads
Dynabeads MyOne beadsThermo Fisher Scientific65001Streptavidin beads
EthanolTianjin No.6 Chemical Reagent Factory1083
GlycerolBeijing Hwrkchemical Co,. LtdSMG66258-1
ImidazoleSolarbioII0070
IPTGSolarbioI8070
IsopropanolTianjin No.6 Chemical Reagent FactoryA1079
KanamycinThermo Fisher ScientificEN0523
Klenow fragment (3′-5′ exo-)New England Biolab (NEB)M0212S
LabViewNational Instrumentshttps://www.ni.com/en-us/shop/product/labview.htmlGraphical programming software 
LiClBide Pharmatech Co., Ltd (bidepharm)BD136449
LysozymeSolarbioL8120-5
MseINew England Biolab (NEB)R0525S
NaClShanghai AladdinC111533
NanoDropThermo Fisher ScientificSpectrophotometer
NdeINew England Biolab (NEB)R0111S
Ni NTA Beads 6FFChangzhou Smart-Lifesciences Biotechnology Co.,LtdSA005025
Nitrocellulose membraneABclonalRM02801
PMSFSolarbioP8340
Proteinase KBeyotime Biotech Inc (beyotime)ST535-500mg
rCutSmart BufferNew England Biolab (NEB)B6004S
Rnase ASigma-AldrichR4875
Sodium acetateSERVA Electrophoresis GmbH2124902
Sumo proteaseBeyotime Biotech Inc (beyotime)P2312M

References

  1. Blackburn, E. H., Epel, E. S., Lin, J. Human telomere biology: A contributory and interactive factor in aging, disease risks, and protection. Science. 350 (6265), 1193-1198 (2015).
  2. Li, N., et al. The dynamics of forming a triplex in an artificial telomere inferred by DNA mechanics. Nucleic Acids Res. 47 (15), e86 (2019).
  3. Yu, Z., et al. Click chemistry assisted single-molecule fingerprinting reveals a 3d biomolecular folding funnel. J Am Chem Soc. 134 (30), 12338-12341 (2012).
  4. Karimian, K., et al. Human telomere length is chromosome end-specific and conserved across individuals. Science. 384 (6695), 533-539 (2024).
  5. Maciejowski, J., De Lange, T. Telomeres in cancer: Tumour suppression and genome instability. Nat Rev Mol Cell Biol. 18 (3), 175-186 (2017).
  6. Kinzig, C. G., Zakusilo, G., Takai, K. K., Myler, L. R., De Lange, T. Atr blocks telomerase from converting DNA breaks into telomeres. Science. 383 (6684), 763-770 (2024).
  7. Takai, H., Aria, V., Borges, P., Yeeles, J. T. P., De Lange, T. Cst-polymerase α-primase solves a second telomere end-replication problem. Nature. 627 (8004), 664-670 (2024).
  8. De Lange, T. How telomeres solve the end-protection problem. Science. 326 (5955), 948-952 (2009).
  9. De Lange, T. Shelterin-mediated telomere protection. Annual Review of Genetics. 52 (1), 223-247 (2018).
  10. Liu, B., et al. Structure of active human telomerase with telomere shelterin protein TPP1. Nature. 604 (7906), 578-583 (2022).
  11. Sfeir, A., De Lange, T. Removal of shelterin reveals the telomere end-protection problem. Science. 336 (6081), 593-597 (2012).
  12. Sarek, G., et al. Cdk phosphorylation of trf2 controls t-loop dynamics during the cell cycle. Nature. 575 (7783), 523-527 (2019).
  13. Myler, L. R., et al. DNA-PK and the TRF2 IDDR inhibit MRN-initiated resection at leading-end telomeres. Nat Struct Mol Biol. 30 (9), 1346-1356 (2023).
  14. Hanaoka, S., Nagadoi, A., Nishimura, Y. Comparison between TRF2 and TRF1 of their telomeric DNA-bound structures and DNA-binding activities. Protein Sci. 14 (1), 119-130 (2005).
  15. Chen, Y., et al. A shared docking motif in TRF1 and TRF2 used for differential recruitment of telomeric proteins. Science. 319 (5866), 1092-1096 (2008).
  16. Wan, B., et al. SLX4 assembles a telomere maintenance toolkit by bridging multiple endonucleases with telomeres. Cell Reports. 4 (5), 861-869 (2013).
  17. Rai, R., et al. NBS1 phosphorylation status dictates repair choice of dysfunctional telomeres. Molecular Cell. 65 (5), 801-817.e4 (2017).
  18. Benarroch-Popivker, D., et al. Trf2-mediated control of telomere DNA topology as a mechanism for chromosome-end protection. Mol Cell. 61 (2), 274-286 (2016).
  19. Poulet, A., et al. The n-terminal domains of TRF1 and TRF2 regulate their ability to condense telomeric DNA. Nucleic Acids Res. 40 (6), 2566-2576 (2012).
  20. Schmutz, I., Timashev, L., Xie, W., Patel, D. J., De Lange, T. TRF2 binds branched DNA to safeguard telomere integrity. Nat Struct Mol Biol. 24 (9), 734-742 (2017).
  21. Doksani, Y., Wu, J. Y., De Lange, T., Zhuang, X. Super-resolution fluorescence imaging of telomeres reveals TRF2-dependent t-loop formation. Cell. 155 (2), 345-356 (2013).
  22. Di Maro, S., et al. Shading the TRF2 recruiting function: A new horizon in drug development. J Am Chem Soc. 136 (48), 16708-16711 (2014).
  23. Gao, J., Pickett, H. A. Targeting telomeres: Advances in telomere maintenance mechanism-specific cancer therapies. Nat Rev Cancer. 22 (9), 515-532 (2022).
  24. Bejarano, L., et al. Inhibition of TRF1 telomere protein impairs tumor initiation and progression in glioblastoma mouse models and patient-derived xenografts. Cancer Cell. 32 (5), 590-607.e4 (2017).
  25. Chen, X., et al. Cyclic peptidic mimetics of apollo peptides targeting telomeric repeat binding factor 2 (TRF2) and apollo interaction. ACS Med Chem Lett. 9 (5), 507-511 (2018).
  26. Erdel, F., et al. Telomere recognition and assembly mechanism of mammalian shelterin. Cell Rep. 18 (1), 41-53 (2017).
  27. Pendlebury, D. F., et al. Dissecting the telomere-inner nuclear membrane interface formed in meiosis. Nat Struct Mol Biol. 24 (12), 1064-1072 (2017).
  28. Court, R., Chapman, L., Fairall, L., Rhodes, D. How the human telomeric proteins trf1 and trf2 recognize telomeric DNA: A view from high-resolution crystal structures. EMBO Rep. 6 (1), 39-45 (2005).
  29. Hu, H., et al. Structural basis of telomeric nucleosome recognition by shelterin factor trf1. Sci Adv. 9 (34), eadi4148 (2023).
  30. Nurk, S., et al. The complete sequence of a human genome. Science. 376 (6588), 44-53 (2022).
  31. Rhie, A., et al. The complete sequence of a human y chromosome. Nature. 621 (7978), 344-354 (2023).
  32. Chang, T. R., Long, X., Shastry, S., Parks, J. W., Stone, M. D. Single-molecule mechanical analysis of strand invasion in human telomere DNA. Biochemistry. 61 (15), 1554-1560 (2022).
  33. Kaur, P., et al. TIN2 is an architectural protein that facilitates TRF2-mediated trans- and cis-interactions on telomeric DNA. Nucleic Acids Res. 49 (22), 13000-13018 (2021).
  34. Parks, J. W., Stone, M. D. Single-molecule studies of telomeres and telomerase. Annu Rev Biophys. 46, 357-377 (2017).
  35. Zhao, X., et al. Exploring TRF2-dependent DNA distortion through single-DNA manipulation studies. Commun Biol. 7 (1), 148 (2024).
  36. Patrick, E. M., Slivka, J. D., Payne, B., Comstock, M. J., Schmidt, J. C. Observation of processive telomerase catalysis using high-resolution optical tweezers. Nat Chem Biol. 16 (7), 801-809 (2020).
  37. Soman, A., et al. Columnar structure of human telomeric chromatin. Nature. 609 (7929), 1048-1055 (2022).
  38. Jansson, L. I., et al. Telomere DNA G-quadruplex folding within actively extending human telomerase. Proc Natl Acad Sci U S A. 116 (19), 9350-9359 (2019).
  39. Soranno, A., et al. Shelterin components modulate nucleic acids condensation and phase separation in the context of telomeric DNA. J Mol Biol. 434 (16), 167685 (2022).
  40. Wong, S. Y., et al. The shelterin component TRF2 mediates columnar stacking of human telomeric chromatin. EMBO J. 43 (1), 87-111 (2024).
  41. Li, X., et al. Dynamics of TRF1 organizing a single human telomere. Nucleic Acids Res. 49 (2), 760-775 (2021).
  42. You, H., Le, S., Chen, H., Qin, L., Yan, J. Single-molecule manipulation of g-quadruplexes by magnetic tweezers. J Vis Exp. (127), e56328 (2017).
  43. Lipfert, J., Lee, M., Ordu, O., Kerssemakers, J. W., Dekker, N. H. Magnetic tweezers for the measurement of twist and torque. J Vis Exp. (87), e51503 (2014).
  44. Ma, K., et al. A DNA force circuit for exploring protein-protein interactions at the single-molecule level. Chinese Journal of Chemistry. 42 (13), 1456-1464 (2024).
  45. . LB liquid medium. Cold Spring Harb Protoc. 2016 (9), (2016).
  46. . LB agar plates. Cold Spring Harb Protoc. 2024 (4), (2024).
  47. . HEPES buffer. Cold Spring Harb Protoc. 2010 (7), (2010).
  48. . SDS-PAGE gel. Cold Spring Harb Protoc. 2015 (7), (2015).
  49. . 10x PBS. Cold Spring Harb Protoc. 2007 (4), (2007).
  50. . TE buffer (1x). Cold Spring Harb Protoc. 2016 (5), (2016).
  51. Green, M. R., Sambrook, J. Buffers. Cold Spring Harb Protoc. 2018 (2), (2018).
  52. . Tris buffer (1 M, pH 7.5). Cold Spring Harbor Protocols. 2011 (2), (2011).
  53. . EDTA. Cold Spring Harbor Protocols. 2006 (1), (2006).
  54. Yu, Z., et al. A force calibration standard for magnetic tweezers. Rev Sci Instrum. 85 (12), 123114 (2014).
  55. Wang, Z., et al. Reading time and DNA sequence preference of TET3 CXXC domain revealed by single-molecule profiling. Chinese J Chem. 41 (10), 1177-1184 (2023).
  56. Kimura, M., et al. Measurement of telomere length by the southern blot analysis of terminal restriction fragment lengths. Nat Protoc. 5 (9), 1596-1607 (2010).
  57. Dulin, D., et al. High spatiotemporal-resolution magnetic tweezers: Calibration and applications for DNA dynamics. Biophys J. 109 (10), 2113-2125 (2015).
  58. Lipfert, J., Hao, X., Dekker, N. H. Quantitative modeling and optimization of magnetic tweezers. Biophys J. 96 (12), 5040-5049 (2009).
  59. Te Velthuis, A. J., Kerssemakers, J. W., Lipfert, J., Dekker, N. H. Quantitative guidelines for force calibration through spectral analysis of magnetic tweezers data. Biophys J. 99 (4), 1292-1302 (2010).
  60. Cnossen, J. P., Dulin, D., Dekker, N. H. An optimized software framework for real-time, high-throughput tracking of spherical beads. Rev Sci Instrum. 85 (10), 103712 (2014).
  61. Green, M. R., Sambrook, J. Cloning and transformation with plasmid vectors. Cold Spring Harb Protoc. 2021 (11), (2021).
  62. Haneskog, L. Purification of histidine-tagged proteins using stepwise elution with imidazole. Cold Spring Harb Protoc. 2006 (1), (2006).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

210

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved