تحليل تفاعلات البروتين التيلوميري والحمض النووي باستخدام ملاقط مغناطيسية أحادية الجزيء

Summary

يوضح هذا البروتوكول استخدام ملاقط مغناطيسية أحادية الجزيء لدراسة التفاعلات بين البروتينات المرتبطة بالحمض النووي التيلوميري (عامل ربط التيلومير المتكرر 1 [TRF1] و TRF2) والتيلوميرات الطويلة المستخرجة من الخلايا البشرية. يصف الخطوات التحضيرية للتيلوميرات وعوامل الارتباط المتكرر التيلوميرية ، وتنفيذ تجارب الجزيء الوحيد ، وطرق جمع البيانات وتحليلها.

Abstract

تعتبر التيلوميرات ، وهي الهياكل الواقية في نهايات الكروموسومات ، ضرورية للحفاظ على طول عمر الخلية واستقرار الجينوم. تعتمد وظيفتها الصحيحة على عمليات منظمة بإحكام للنسخ المتماثل والاستطالة والاستجابة للضرر. يلعب مجمع الملاءة ، وخاصة عامل التيلومير المتكرر 1 (TRF1) و TRF2 ، دورا محوريا في حماية التيلومير وقد برز كهدف محتمل مضاد للسرطان لاكتشاف الأدوية. ترتبط هذه البروتينات بزخارف الحمض النووي التيلوميرية المتكررة TTAGGG ، مما يسهل تكوين الهياكل الواقية وتجنيد البروتينات التيلوميرية الأخرى. قدمت الأساليب الهيكلية وتقنيات التصوير المتقدمة رؤى حول تفاعلات البروتين والحمض النووي التيلوميري ، لكن التحقيق في العمليات الديناميكية يتطلب مناهج أحادية الجزيء. تم استخدام أدوات مثل الملقط المغناطيسي والملاقط البصرية والفحص المجهري للقوة الذرية (AFM) لدراسة تفاعلات البروتين التيلوميري والحمض النووي ، مما يكشف عن تفاصيل مهمة مثل تشويه الحمض النووي المعتمد على TRF2 وتحفيز التيلوميراز. ومع ذلك ، فإن إعداد تركيبات أحادية الجزيء ذات الزخارف المتكررة التيلوميرية لا يزال يمثل مهمة صعبة ، مما قد يحد من اتساع نطاق الدراسات التي تستخدم الأساليب الميكانيكية أحادية الجزيء. لمعالجة هذا الأمر ، قمنا بتطوير طريقة لدراسة التفاعلات باستخدام الحمض النووي التيلوميري البشري كامل الطول مع ملاقط مغناطيسية. يصف هذا البروتوكول كيفية التعبير عن TRF2 وتنقيته ، وإعداد الحمض النووي التيلوميري ، وإعداد المقايسات الميكانيكية أحادية الجزيء ، وتحليل البيانات. سيفيد هذا الدليل التفصيلي الباحثين في بيولوجيا التيلومير واكتشاف الأدوية المستهدفة بالتيلومير.

Introduction

التيلوميرات هي هياكل واقية في نهايات الكروموسومات^1،2،3. يؤدي تآكل التيلومير أثناء انقسام الخلايا إلى شيخوخة الخلايا والشيخوخة ، بينما يساهم الاستطالة غير الطبيعية للتيلوميرات في الإصابة بالسرطان^4،5. لكي تعمل التيلوميرات بشكل صحيح ، يجب أن تكون استجاباتها للتكرار والاستطالة والضرر منظمة للغاية^6،7،8. يلعب Shelterin ، المكون من ست وحدات فرعية ، دورا مركزيا في حماية^{التيلومير 9}

Protocol

1. المواد والأساليب العامة

1. يرجى الرجوع إلى ملف جدول المواد للاطلاع على الأملاح والمواد الكيميائية والمضادات الحيوية والإنزيمات والأجسام المضادة ومواد الراتنج المستخدمة في هذا البروتوكول.
2. تحضير الوسط السائل Luria-Bertani (LB) ، وألواح أجار LB ، والمخزن المؤقت HEPES ، والرحلان الكهربائي لجل بولي أكريلاميد SDS (SDS-PAGE) ، والمحلول الملحي المخزن بالفوسفات (PBS) ، ومخزن Tris-EDTA (TE) وفقا للوصفات من بروتوكولات ميناء الربيع البارد^{45،46،47،48،}

النتائج

يوضح الشكل 1 أ المجالات والهياكل التخطيطية ل TRF1 و TRF2 ، والتي تتكون من 439 و 542 من الأحماض الأمينية ، على التوالي ، والتي يمكن التعبير عنها في الخلايا بدائية النواة. تم وصف إعداد TRF1 سابقا في الأدبيات⁴¹. هنا ، نقدم وصفا شاملا ونتائج تمثيلية لإعداد TRF.......

Discussion

يستخدم هذا البروتوكول ملاقط مغناطيسية لمعالجة TRFs على مستوى الجزيء الفردي^57،58،59. نحن نستخدم الخرز المغناطيسي لفصل TRFs عن شظايا الحمض النووي الجيني. بعد تقييد الهضم ، ترتبط TRFs بالخرز المغناطيسي ، مما يتيح فصلها بسهولة عن ش.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anti-Digoxigenin	Roche	11214667001
BfaI	New England Biolab (NEB)	R0568S
BSA	Sigma-Aldrich	V900933
CMOS camera	Mikrotron	MC1362
CviAII	New England Biolab (NEB)	R0640S
DIG-11-dUTP	Jena Bioscience	NU-803-DIGXL
DNA extraction solution	G-CLONE	EX0108
Dnase I, Rnase-Free, Hc Ea	Thermo Fisher Scientific	EN0523
dNTP mixture	Nanjing Vazyme Biotech Co., Ltd (Vazyme)	P032-02
DTT	Solarbio	D1070
Dynabeads M-270  beads	Thermo Fisher Scientific	65305	Streptavidin beads
Dynabeads MyOne beads	Thermo Fisher Scientific	65001	Streptavidin beads
Ethanol	Tianjin No.6 Chemical Reagent Factory	1083
Glycerol	Beijing Hwrkchemical Co,. Ltd	SMG66258-1
Imidazole	Solarbio	II0070
IPTG	Solarbio	I8070
Isopropanol	Tianjin No.6 Chemical Reagent Factory	A1079
Kanamycin	Thermo Fisher Scientific	EN0523
Klenow fragment (3′-5′ exo-)	New England Biolab (NEB)	M0212S
LabView	National Instruments	https://www.ni.com/en-us/shop/product/labview.html	Graphical programming software
LiCl	Bide Pharmatech Co., Ltd (bidepharm)	BD136449
Lysozyme	Solarbio	L8120-5
MseI	New England Biolab (NEB)	R0525S
NaCl	Shanghai Aladdin	C111533
NanoDrop	Thermo Fisher Scientific		Spectrophotometer
NdeI	New England Biolab (NEB)	R0111S
Ni NTA Beads 6FF	Changzhou Smart-Lifesciences Biotechnology Co.,Ltd	SA005025
Nitrocellulose membrane	ABclonal	RM02801
PMSF	Solarbio	P8340
Proteinase K	Beyotime Biotech Inc (beyotime)	ST535-500mg
rCutSmart Buffer	New England Biolab (NEB)	B6004S
Rnase A	Sigma-Aldrich	R4875
Sodium acetate	SERVA Electrophoresis GmbH	2124902
Sumo protease	Beyotime Biotech Inc (beyotime)	P2312M