Análisis de las interacciones teloméricas proteína-ADN utilizando pinzas magnéticas de una sola molécula

Resumen

Este protocolo demuestra el uso de pinzas magnéticas de una sola molécula para estudiar las interacciones entre las proteínas teloméricas de unión al ADN (Telomere Repeat-binding Factor 1 [TRF1] y TRF2) y los telómeros largos extraídos de células humanas. Describe los pasos preparatorios para los telómeros y los factores de unión de repetición telomérica, la ejecución de experimentos de una sola molécula y los métodos de recopilación y análisis de datos.

Resumen

Los telómeros, las estructuras protectoras en los extremos de los cromosomas, son cruciales para mantener la longevidad celular y la estabilidad del genoma. Su función adecuada depende de procesos estrictamente regulados de replicación, elongación y respuesta al daño. El complejo shelterina, especialmente el factor de unión repetida a los telómeros 1 (TRF1) y TRF2, desempeña un papel fundamental en la protección de los telómeros y se ha convertido en un objetivo potencial contra el cáncer para el descubrimiento de fármacos. Estas proteínas se unen al motivo repetitivo de ADN telomérico TTAGGG, facilitando la formación de estructuras protectoras y el reclutamiento de otras proteínas teloméricas. Los métodos estructurales y las técnicas de imagen avanzadas han proporcionado información sobre las interacciones teloméricas proteína-ADN, pero el sondeo de los procesos dinámicos requiere enfoques de una sola molécula. Se han empleado herramientas como pinzas magnéticas, pinzas ópticas y microscopía de fuerza atómica (AFM) para estudiar las interacciones teloméricas proteína-ADN, revelando detalles importantes como la distorsión del ADN dependiente de TRF2 y la catálisis de la telomerasa. Sin embargo, la preparación de construcciones de una sola molécula con motivos repetitivos teloméricos sigue siendo una tarea desafiante, lo que podría limitar la amplitud de los estudios que utilizan métodos mecánicos de una sola molécula. Para abordar esto, desarrollamos un método para estudiar las interacciones utilizando ADN telomérico humano de longitud completa con pinzas magnéticas. Este protocolo describe cómo expresar y purificar TRF2, preparar ADN telomérico, configurar ensayos mecánicos de una sola molécula y analizar datos. Esta guía detallada beneficiará a los investigadores en biología de telómeros y descubrimiento de fármacos dirigidos a telómeros.

Introducción

Los telómeros son estructuras protectoras en los extremos de los cromosomas ^1,2,3. La erosión de los telómeros durante la división celular conduce a la senescencia celular y al envejecimiento, mientras que la elongación anormal de los telómeros contribuye al cáncer ^4,5. Para que los telómeros funcionen correctamente, sus respuestas de replicación, elongación y daño deben estar altamente reguladas ^6,7,8

Protocolo

1. Materiales y métodos generales

1. Consulte el archivo de la Tabla de materiales para conocer las sales, productos químicos, antibióticos, enzimas, anticuerpos y materiales de resina utilizados en este protocolo.
2. Prepare el medio líquido Luria-Bertani (LB), placas de agar LB, tampón HEPES, electroforesis en gel de poliacrilamida SDS (SDS-PAGE), solución salina tamponada con fosfato (PBS), tampón Tris-EDTA (TE) de acuerdo con las recetas de los protocolos de puerto de primavera fría 45,46,47,48,49,50,51,52,53.

Discusión

Este protocolo emplea pinzas magnéticas para la manipulación de TRFs a nivel de una sola molécula 57,58,59. Utilizamos perlas magnéticas para separar los TRF de los fragmentos de ADN genómico. Después de la digestión de restricción, los TRF se unen a las perlas magnéticas, lo que permite su fácil separación de los fragmentos de ADN genómico. Este enfoque permite la manipulación medi.......

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anti-Digoxigenin	Roche	11214667001
BfaI	New England Biolab (NEB)	R0568S
BSA	Sigma-Aldrich	V900933
CMOS camera	Mikrotron	MC1362
CviAII	New England Biolab (NEB)	R0640S
DIG-11-dUTP	Jena Bioscience	NU-803-DIGXL
DNA extraction solution	G-CLONE	EX0108
Dnase I, Rnase-Free, Hc Ea	Thermo Fisher Scientific	EN0523
dNTP mixture	Nanjing Vazyme Biotech Co., Ltd (Vazyme)	P032-02
DTT	Solarbio	D1070
Dynabeads M-270  beads	Thermo Fisher Scientific	65305	Streptavidin beads
Dynabeads MyOne beads	Thermo Fisher Scientific	65001	Streptavidin beads
Ethanol	Tianjin No.6 Chemical Reagent Factory	1083
Glycerol	Beijing Hwrkchemical Co,. Ltd	SMG66258-1
Imidazole	Solarbio	II0070
IPTG	Solarbio	I8070
Isopropanol	Tianjin No.6 Chemical Reagent Factory	A1079
Kanamycin	Thermo Fisher Scientific	EN0523
Klenow fragment (3′-5′ exo-)	New England Biolab (NEB)	M0212S
LabView	National Instruments	https://www.ni.com/en-us/shop/product/labview.html	Graphical programming software
LiCl	Bide Pharmatech Co., Ltd (bidepharm)	BD136449
Lysozyme	Solarbio	L8120-5
MseI	New England Biolab (NEB)	R0525S
NaCl	Shanghai Aladdin	C111533
NanoDrop	Thermo Fisher Scientific		Spectrophotometer
NdeI	New England Biolab (NEB)	R0111S
Ni NTA Beads 6FF	Changzhou Smart-Lifesciences Biotechnology Co.,Ltd	SA005025
Nitrocellulose membrane	ABclonal	RM02801
PMSF	Solarbio	P8340
Proteinase K	Beyotime Biotech Inc (beyotime)	ST535-500mg
rCutSmart Buffer	New England Biolab (NEB)	B6004S
Rnase A	Sigma-Aldrich	R4875
Sodium acetate	SERVA Electrophoresis GmbH	2124902
Sumo protease	Beyotime Biotech Inc (beyotime)	P2312M