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Resumen

Este protocolo demuestra el uso de pinzas magnéticas de una sola molécula para estudiar las interacciones entre las proteínas teloméricas de unión al ADN (Telomere Repeat-binding Factor 1 [TRF1] y TRF2) y los telómeros largos extraídos de células humanas. Describe los pasos preparatorios para los telómeros y los factores de unión de repetición telomérica, la ejecución de experimentos de una sola molécula y los métodos de recopilación y análisis de datos.

Resumen

Los telómeros, las estructuras protectoras en los extremos de los cromosomas, son cruciales para mantener la longevidad celular y la estabilidad del genoma. Su función adecuada depende de procesos estrictamente regulados de replicación, elongación y respuesta al daño. El complejo shelterina, especialmente el factor de unión repetida a los telómeros 1 (TRF1) y TRF2, desempeña un papel fundamental en la protección de los telómeros y se ha convertido en un objetivo potencial contra el cáncer para el descubrimiento de fármacos. Estas proteínas se unen al motivo repetitivo de ADN telomérico TTAGGG, facilitando la formación de estructuras protectoras y el reclutamiento de otras proteínas teloméricas. Los métodos estructurales y las técnicas de imagen avanzadas han proporcionado información sobre las interacciones teloméricas proteína-ADN, pero el sondeo de los procesos dinámicos requiere enfoques de una sola molécula. Se han empleado herramientas como pinzas magnéticas, pinzas ópticas y microscopía de fuerza atómica (AFM) para estudiar las interacciones teloméricas proteína-ADN, revelando detalles importantes como la distorsión del ADN dependiente de TRF2 y la catálisis de la telomerasa. Sin embargo, la preparación de construcciones de una sola molécula con motivos repetitivos teloméricos sigue siendo una tarea desafiante, lo que podría limitar la amplitud de los estudios que utilizan métodos mecánicos de una sola molécula. Para abordar esto, desarrollamos un método para estudiar las interacciones utilizando ADN telomérico humano de longitud completa con pinzas magnéticas. Este protocolo describe cómo expresar y purificar TRF2, preparar ADN telomérico, configurar ensayos mecánicos de una sola molécula y analizar datos. Esta guía detallada beneficiará a los investigadores en biología de telómeros y descubrimiento de fármacos dirigidos a telómeros.

Introducción

Los telómeros son estructuras protectoras en los extremos de los cromosomas 1,2,3. La erosión de los telómeros durante la división celular conduce a la senescencia celular y al envejecimiento, mientras que la elongación anormal de los telómeros contribuye al cáncer 4,5. Para que los telómeros funcionen correctamente, sus respuestas de replicación, elongación y daño deben estar altamente reguladas 6,7,8. La shelterina, compuesta por seis subunidades, desempeña un papel central en la protección de los telómeros 9,10,11. Una comprensión más profunda de los telómeros proporcionará información valiosa sobre la biología de los telómeros.

TRF1 y TRF2, subunidades centrales de la shelterina, son proteínas de unión telomérica 12,13. Tanto TRF1 como TRF2 se unen al motivo repetitivo de ADN TTAGGG en los telómeros a través de sus dominios Myb14. Forman dímeros a través de sus dominios TRFH compartidos, que les permiten rodear el ADN telomérico bicatenario y reclutar proteínas teloméricas 15,16,17,18,19. TRF2 es particularmente importante para la formación de bucles D y bucles T teloméricos20,21. Debido a su papel crucial en la protección de los telómeros, TRF1 y TRF2 han surgido como posibles dianas farmacológicas contra el cáncer 22,23,24,25.

Se han realizado esfuerzos significativos para investigar las interacciones proteína-ADN en los telómeros. Se han utilizado métodos bioquímicos como el Ensayo de Cambio de Movilidad Electroforética (EMSA) y la Resonancia de Plasmón de Superficie (SPR) para examinar las afinidades de unión20,26. Numerosas estructuras de proteínas de unión telomérica complejadas con ADN han sido dilucidadas mediante criomicroscopía electrónica (crio-EM), cristalografía de rayos X y resonancia magnética nuclear (RMN)27,28,29. Las técnicas de imagen de superresolución, como la microscopía de reconstrucción óptica estocástica (STORM), han revelado la formación de bucles T21 dependientes de TRF2. Recientemente, se ha desarrollado la secuenciación de nanoporos para perfilar secuencias teloméricas 4,30,31. Estos conocimientos estructurales han mejorado en gran medida nuestra comprensión de las interacciones teloméricas proteína-ADN. Para explorar más a fondo la dinámica de las interacciones teloméricas proteína-ADN, es esencial el desarrollo de nuevas tecnologías.

Las herramientas de una sola molécula son técnicas poderosas para explorar las interacciones proteína-ADN en los telómeros 32,33,34. Se han empleado métodos mecánicos de una sola molécula, como pinzas magnéticas, pinzas ópticas y AFM, para investigar la distorsión del ADN dependiente de TRF2, revelar el apilamiento columnar mediado por TRF2 de la cromatina telomérica humana y observar la catálisis procesiva de la telomerasa, entre otras aplicaciones 35,36,37,38,39,40. Estos métodos son particularmente útiles para sondear las conformaciones topológicas y la cinética de la asociación y disociación proteína-ADN.

Sin embargo, la preparación de construcciones de una sola molécula con motivos repetitivos teloméricos aún presenta desafíos, lo que limita los estudios que utilizan métodos mecánicos de una sola molécula. Para abordar esta limitación, hemos desarrollado un método mecánico de una sola molécula para estudiar las interacciones globales proteína-ADN en telómeros humanos de longitud completa41. Este método extrae directamente el ADN telomérico de las células humanas, evitando la laboriosa preparación del ADN telomérico artificial. Facilita la investigación de los procesos cinéticos en telómeros nativos largos que abarcan varias kilobases.

En este protocolo, proporcionamos una descripción detallada de los pasos para sondear las interacciones teloméricas proteína-ADN utilizando pinzas magnéticas, una popular herramienta mecánica de una sola molécula 42,43,44. Demostramos cómo expresar y purificar proteínas teloméricas, utilizando TRF2 como ejemplo, y cómo preparar ADN telomérico a partir de células humanas. Además, mostramos cómo configurar un ensayo de una sola molécula en pinzas magnéticas para estudiar las interacciones teloméricas proteína-ADN, y cubrimos el análisis de datos posterior de experimentos de una sola molécula. Este protocolo beneficiará a los investigadores en el campo de la biología de los telómeros y el descubrimiento de fármacos dirigidos a los telómeros.

Protocolo

1. Materiales y métodos generales

  1. Consulte el archivo de la Tabla de materiales para conocer las sales, productos químicos, antibióticos, enzimas, anticuerpos y materiales de resina utilizados en este protocolo.
  2. Prepare el medio líquido Luria-Bertani (LB), placas de agar LB, tampón HEPES, electroforesis en gel de poliacrilamida SDS (SDS-PAGE), solución salina tamponada con fosfato (PBS), tampón Tris-EDTA (TE) de acuerdo con las recetas de los protocolos de puerto de primavera fría 45,46,47,48,49,50,51,52,53.
  3. Adquirir el vector pET28a (Addgene), líneas celulares procariotas y eucariotas (ATCC) a través de fuentes comerciales. Luego, cultivarlos y pasarlos continuamente al laboratorio.
  4. Para grandes volúmenes de líquido, autoclave a 120 °C durante 20 min. Para volúmenes pequeños, utilice un filtro estéril con un tamaño de poro de 0,22 μm.
  5. Ajuste el pH de las soluciones al nivel deseado utilizando HCl o NaOH antes de llevarlas a sus volúmenes finales.
    NOTA: Las pinzas magnéticas se construyen a medida y se ejecutan en un entorno de LabVIEW 2017, mientras que el análisis de datos de una sola molécula se realiza en MATLAB 2017 2,54,55.
  6. Por razones de seguridad, use batas de laboratorio de manga larga, guantes de nitrilo (o guantes hechos de un material que sea impermeable y resistente a la sustancia), anteojos o gafas de seguridad y zapatos cerrados.

2. Expresión proteica y purificación de proteínas teloméricas de unión al ADN

  1. Realizar cultivos celulares e inducir la expresión de proteínas.
    1. Inserte la secuencia codificante para las proteínas teloméricas de unión al ADN (Figura 1A), TRF2 como ejemplo en este caso, en el vector pET28a mediante digestión y ligadura de enzimas, con SUMO empleado como etiqueta de fusión. Inserte entre los sitios de restricción de BamHI y HindIII, produciendo el plásmido de pET28a-SUMO-TRF2 (Figura 1B).
    2. Transforme las células BL21(DE3) con el plásmido pET28a-SUMO-TRF2.
      1. Descongele una alícuota de 50 μL de células BL21(DE3) competentes en hielo.
      2. Añadir 1 μL de ADN del plásmido pET28a-SUMO-TRF2 (que contiene 50 ng de ADN) a las células competentes. Gire suavemente para mezclar sin pipetear hacia arriba y hacia abajo.
        NOTA: No haga vórtice.
      3. Incuba la mezcla en hielo durante 30 min.
      4. Para el choque térmico, caliente la mezcla de celdas a 42 °C durante exactamente 45 s en un baño de agua. Vuelva a congelar inmediatamente las células durante 2 minutos para estabilizar las células transformadas.
      5. Agregue 950 μL de medio LB a temperatura ambiente (RT) a las células para facilitar la recuperación.
      6. Incubar las células transformadas a 37 °C durante 1 h agitando a 220 rpm.
      7. Extienda 100 μL de la mezcla de transformación en una placa de agar LB que contenga 50 μg/mL de kanamicina (85,8 μM).
      8. Incubar las células plateadas durante la noche a 37 °C. Después de la incubación, seleccione colonias distintas para su uso en la inoculación de cultivos iniciadores.
        NOTA: Las colonias en placas se pueden almacenar a 4 °C hasta por 2 semanas.
    3. Recoger una colonia de células BL21(DE3) transformadas y cultivarla en 5 mL de medio LB suplementado con 50 μg/mL de kanamicina (85,8 μM). Incubar durante 18 h a 37 °C con agitación a 220 rpm.
    4. Para aumentar, transfiera 2 mL del cultivo durante la noche a 200 mL de medio LB que contenga 50 μg/mL de kanamicina (85,8 μM). Continúe incubando a 37 °C con agitación a 220 rpm hasta que la densidad óptica a 600 nm (OD 600) alcance 0,6-0,8.
    5. Tome 1 mL del cultivo como muestra de control no inducida.
    6. Inducir el cultivo restante con isopropil β-d-1-tiogalactopiranósido (IPTG) hasta una concentración final de 1 mM e incubar a 20 °C durante 17 h para promover la expresión de proteínas.
    7. Realice SDS-PAGE utilizando un gel de apilamiento al 5% y un gel de separación al 10%. Cargue muestras con el búfer de carga SDS-PAGE y ejecute SDS-PAGE inicialmente a 100 V durante 30 minutos, seguido de 120 V durante 50 minutos en un tampón de tris-glicina. Teñir con azul de Coomassie para visualizar la expresión de la proteína (ver recetas en la Tabla Suplementaria 1) (Figura 1C).
      NOTA: Consulte Discusión para solucionar problemas si no se observa la expresión.
  2. Purifica la proteína.
    1. Cosechar las células por centrifugación a 4 °C, 8500 x g durante 10 min. Deseche el sobrenadante y lave el pellet en 200 mL de PBS. Centrifugar de nuevo, desechar el sobrenadante y volver a suspender el pellet de la célula en 25 mL de tampón de lisis (20 mM de HEPES, 300 mM de NaCl, 20 mM de imidazol, 10% de glicerol, 0,5 mM de DTT, 1 mM de fluoruro de fenilmetilsulfonilo [PMSF]).
      PRECAUCIÓN: El PMSF es corrosivo y tóxico y causa quemaduras. Use ropa protectora adecuada, guantes y protección para los ojos y la cara.
      NOTA: Congele a -80 °C si no se procede inmediatamente.
    2. Agregue 5 μL de 100 mg/mL de lisozima, 5 μL de 1 U/μL de DNasa I y 5 μL de 10 mg/mL de ARNasa A a las células resuspendidas.
    3. Realiza la sonicación en hielo, con ráfagas de 1 s a 250 W seguidas de una pausa de 2 s, durante un total de 30 min.
    4. Centrifugar a 38.000 x g, 4 °C durante 40 min (30-60 min es aceptable) y filtrar el sobrenadante a través de un filtro de jeringa de 0,22 μm.
    5. Prepare 500 mL de tampón de unión a la columna de Ni disolviendo 8,76 g de NaCl (concentración final 300 mM) y 0,68 g de imidazol (concentración final 20 mM) en 20 mM HEPES (pH 8,0). Filtre la solución a través de un filtro de 0,22 μm.
      PRECAUCIÓN: El imidazol es peligroso y puede causar irritación de la piel y los ojos. También puede dañar al feto. Evite el contacto con los ojos, la piel y la ropa. No ingerir ni inhalar. Use equipo de protección personal, incluida la protección facial.
    6. Prepare tampones de elución en columna de Ni (20 mM HEPES (pH 8.0), 300 mM NaCl) con concentraciones crecientes de imidazol (100 mM, 200 mM, 300 mM y 500 mM) para la elución escalonada, asegurando que todos los tampones se filtren adecuadamente.
    7. Cargue el sobrenadante filtrado en la columna de Ni preequilibrada en tampón de unión (20 mM HEPES (pH 8.0),300 mM de NaCl, 20 mM de imidazol). Lavar con tampón de unión y eluir la proteína con el gradiente de imidazol preparado, recogiendo 12 fracciones, cada una con 1 mL (Figura 1C). Combine fracciones con >95% de pureza.
    8. Mida la concentración de la proteína de fusión 6xHis-sumo-TRF2 eluida por A280 en un espectrofotómetro.
    9. Para la proteína utilizada en los ensayos de molécula única, agregue sumo proteasa de acuerdo con las instrucciones del fabricante (normalmente 0,125 U de proteasa por 2 μg de proteína de fusión) y permita la digestión durante la noche a 4 °C.
    10. Después del tratamiento con proteasa de sumo, cargue la mezcla de nuevo en una columna de Ni para unirse a cualquier proteína de fusión no digerida y al sumo marcado con His, permitiendo que la proteína TRF2 sin etiquetas fluya a través de ella. Recoja el flujo continuo.
  3. Determine la concentración de proteínas y almacene la proteína.
    1. Concentre la proteína TRF2 purificada utilizando una unidad de filtro centrífugo de corte de 30 kDa e intercambie en un tampón de almacenamiento que contenga 20 mM de HEPES (pH 8,0), 150 mM de NaCl, 0,5 mM de DTT, para reducir la concentración de imidazol por debajo de 150 mM.
    2. Repita el proceso de concentración hasta que el volumen se reduzca a menos de 1 mL.
    3. Analice las muestras de cada paso de purificación con SDS-PAGE para evaluar la pureza e integridad de la proteína (Figura 1C).
      NOTA: La cromatografía de afinidad se utiliza para purificar proteínas, recolectar y lavar muestras eluidas y realizar SDS-PAGE para evaluar la integridad de las proteínas y garantizar el control de calidad. Cuando la cromatografía de afinidad por sí sola no cumple con los requisitos de pureza, se emplea la cromatografía de exclusión por tamaño para mejorar aún más la pureza de las proteínas. Las curvas de absorbancia UV ayudan a evaluar las fracciones de elución, y SDS-PAGE verifica la integridad de la proteína, lo que garantiza un estricto control de calidad durante todo el proceso.
    4. Agregue glicerol hasta una concentración final del 50% a la proteína concentrada e intercambiada por tampón para su almacenamiento.
    5. Almacene la proteína a -80 °C.

3. Preparación de fragmentos de restricción telomérica humana

  1. Extraer ADN genómico.
    1. Siguiendo el diagrama de flujo (Figura 2A), centrifugar 1 x 107 celdas a 1000 x g durante 3 min y desechar el sobrenadante. Para el lavado, vuelva a suspender las células en 200 μL de PBS, centrifugue nuevamente a 1000 x g durante 3 min y deseche el sobrenadante.
    2. Agregue 760 μL de tampón que contenga 50 mM de Tris-HCl (pH 8.0), 100 mM de NaCl, 100 mM de EDTA y 1% de SDS al tubo que contiene 1 x 107 celdas y vuelva a suspender suavemente mediante pipeteo para evitar burbujas de aire.
      NOTA: No haga vórtice.
    3. Para la digestión de las proteínas y la eliminación de DNasas y RNasas en la muestra, añadir proteinasa K hasta una concentración final de 0,5 mg/mL, correspondiente a 40 μL de una solución madre de 10 mg/mL. Golpee la parte inferior del tubo para mezclar (no haga vórtice).
    4. Incubar durante la noche a 37 °C.
    5. Añadir 265 μL de NaCl 5,4 M. Mezcle durante 5 minutos invirtiendo el tubo cinco veces por minuto, luego colóquelo en hielo durante 20 minutos.
    6. Centrifugar a velocidad máxima (por ejemplo, 16.900 x g) durante 10 min a RT.
    7. Transfiera el sobrenadante a un tubo de centrífuga y agregue un volumen igual de isopropanol (aproximadamente 750 μL), evitando lípidos flotantes o sedimentos. El ADN está en el sobrenadante.
    8. Invierta el tubo cinco veces para mezclar. Confirmar visualmente la presencia de una bolita de ADN precipitando en el tubo de centrífuga.
    9. Centrífuga a RT a velocidad máxima durante 10 min.
    10. Deseche el sobrenadante. Lave el pellet de ADN con 500 μL de etanol al 70% invirtiendo el tubo de centrífuga cinco veces.
      NOTA: La bolita es ADN.
    11. Centrifugar a RT a velocidad máxima (por ejemplo, 16.900 x g) durante 10 min.
    12. Retire con cuidado todo el sobrenadante, dejando la bolita de ADN. Deje que el pellet se seque al aire en RT durante 5 min.
      NOTA: Evite el secado excesivo, ya que el ADN genómico puede resultar difícil de disolver.
    13. Vuelva a suspender el gránulo de ADN en 475 μL de tampón TE (10 mM de Tris-HCl [pH 8,0], 1 mM de EDTA). Mezcle suavemente golpeando la parte inferior del tubo. Para la digestión del ARN durante la preparación del ADN, agregue 25 μL de 10 mg/mL de ARNasa A (concentración final de 0,5 mg/mL) y mezcle golpeando suavemente hasta que la pastilla de ADN se haya disuelto por completo.
      NOTA: Evite el vórtice para evitar el cizallamiento del ADN.
    14. Incubar la muestra de ADN a 4 °C durante la noche.
    15. Realice una extracción de fenol trissaturado de igual volumen: agregue 500 μL de fenol al tubo de centrífuga, mezcle suavemente con una pipeta y centrifuga a velocidad máxima durante 10 min a 4 °C.
      PRECAUCIÓN: La exposición al fenol puede causar irritación en la piel, los ojos, la nariz, la garganta y el sistema nervioso. Evite el contacto con los ojos, la piel y la ropa. No ingerir ni inhalar. Use equipo de protección personal, incluida la protección facial.
      NOTA: El ADN está en la fase acuosa superior, las proteínas están en la interfase y la fase orgánica está en la parte inferior.
    16. Repite tres veces. Tome el sobrenadante de ADN (aproximadamente 280 μL).
    17. De acuerdo con el volumen de la muestra de ADN, agregue 1/10 de volumen (28 μL) de acetato de sodio 3 M (concentración final 0,3 M, pH 5,2) y 2 volúmenes (616 μL) de etanol 100% frío. Coloque el tubo de centrífuga a -80 °C durante 2-3 h.
    18. Centrifugar a velocidad máxima (por ejemplo, 16.900 x g) durante 10 min a 4 °C. Descongele la solución en hielo si está congelada antes de la centrifugación.
    19. Deseche el sobrenadante y lave 3-4 veces con etanol al 70% invirtiendo el tubo de centrífuga. Centrifugar a velocidad máxima durante 5 min a 4 °C.
    20. Retire el etanol y deje que el pellet se seque al aire a RT durante 5 min.
    21. Añadir 100 μL de tampón TE, golpear el tubo para mezclar y dejar reposar a 4 °C durante 2 h para que se disuelva por completo.
      NOTA: Examine la integridad del ADN genómico en un gel de agarosa al 1% (Figura 2B).
    22. Almacene el ADN a -20 °C en el congelador. Se mantendrá estable durante al menos 1 año.
  2. Realizar la digestión y modificación del ADN genómico.
    1. Tome 4 μg de ADN genómico y combínelo con 1 μL de CviAII (10 U), 2 μL de tampón de digestión 10x (consulte la Tabla complementaria 1 para recetas) y agregue agua para alcanzar un volumen total de 20 μL. Incubar la mezcla a 25 °C durante 12 h.
      NOTA: FatI puede reemplazar a CviAII, que ahora está descontinuado por NEB.
    2. Agregue 1 μL de NdeI (20 U), 1 μL de MseI (10 U) y 1 μL de BfaI (10 U) al mismo tubo que contiene la mezcla anterior (20 μL). Además, agregue 2 μL de tampón de digestión 10x y 15 μL de agua para lograr un volumen total de 40 μL. Incubar a 37 °C durante 12 h, luego inactivar por calor todas las enzimas a 80 °C durante 20 min.
      NOTA: La digestión del ADN genómico se puede examinar utilizando el método de fragmento de restricción terminal (TRF) (Figura 2C). La combinación de las cuatro enzimas de restricción (CviAII, NdeI, MseI y BfaI) digiere el ADN genómico en fragmentos de aproximadamente 800 pb y produce los TRF con una contaminación mínima del ADN subtelomérico.
    3. Para la modificación de la digoxigenina, tome 40 μL del ADN genómico digerido y agregue 4 μL de 1 mM de dATP (concentración final de 0,08 mM), 4 μL de 1 mM de digoxigenina-11-dUTP (concentración final de 0,08 mM), 1 μL de fragmento de Klenow (5 U), 0,5 μL de DTT de 100 mM (concentración final de 1 mM) y 1 μL de tampón de digestión 10x. Incubar a 37 °C durante 12 h, seguido de calentar a 75 °C durante 20 min para inactivar el fragmento de Klenow.
    4. Para el marcaje de biotina, tome 12,5 μL del ADN genómico modificado con digoxigenina (1 μg) y agregue 1 μL de sonda telomérica biotinilada de 1 μM (es decir, 1 pmol) que sean complementarias al saliente telomérico monocatenario. Agregue 611,5 μL de tampón TE Li (10 mM de Tris-HCl (pH 8,0), 1 mM EDTA, 50 mM LiCl) para diluir los iones K de 50 mM a 1 mM, haciendo un volumen total de 625 μL, que se puede dividir en 16 tubos de 39 μL cada uno.
    5. Calentar a 75 °C durante 3 min en un termociclador, luego disminuir la temperatura en 0,1 °C cada 30 s hasta alcanzar los 25 °C.
    6. Almacene las muestras de ADN a -20 °C durante al menos un año.

4. Configuración de una celda de flujo para muestras de ADN telomérico en pinzas magnéticas

  1. Cree una celda de flujo para ensayos de una sola molécula.
    1. Utilice una amoladora eléctrica para perforar agujeros como la entrada y la salida en los cubreobjetos superiores (# 2 cubreobjetos con un grosor de 0,2 mm).
    2. Limpie los cubreobjetos con detergente por sonicación durante 30 min.
    3. Lave los cubreobjetos con agua ultrapura 3 veces.
    4. Limpie los cubreobjetos en isopropanol por sonicación durante 30 min.
    5. Lave los cubreobjetos con agua ultrapura 3 veces.
    6. Limpie los cubreobjetos en ultrapura por sonicación durante 15-30 min.
    7. Seque los cubreobjetos con nitrógeno.
      NOTA: El protocolo se puede detener aquí y los cubreobjetos limpios se pueden almacenar para su uso posterior.
    8. Recubrir los cubreobjetos inferiores (sin agujeros) con 20 μL de nitrocelulosa al 0,1% y añadir perlas de referencia (dilución 20x, 3 μm de diámetro). Hornea a 100 °C durante 4 min.
    9. Utilice un bisturí para cortar espaciadores de parafilm de doble capa de acuerdo con un molde de metal. El molde es una pieza rectangular de aleación de aluminio con las mismas dimensiones que el cubreobjetos, con un centro ahuecado para facilitar el corte del canal.
    10. Ensamble el sándwich de celda de flujo (Figura 3A). Calentar a 85 °C y masajear con dos bastoncillos hasta que el parafilm selle el canal.
    11. Cubra la celda de flujo con un anticuerpo. Inyecte 70 μL de anticuerpo anti-digoxigenina (0,1 mg/mL) directamente en la celda de flujo. Dejar en RT durante 1 h.
    12. Pasivar la celda de flujo. Inyectar 70 μL de BSA de 10 mg/mL para desplazar el anticuerpo anti-digoxigenina. Dejar en RT durante 12 h. Los anticuerpos anti-digoxigenina no unidos se eliminarán en los siguientes pasos con un lavado riguroso.
      NOTA: Almacene la celda de flujo a 4 °C durante 1-2 semanas.
    13. Pruebe la unión inespecífica enjuagando 5 μL de MyOne lavado (10 mg/mL) (o 5 μL de perlas M270 (10 mg/mL) lavadas) sin ADN en la celda de flujo. Dejar actuar durante 10 min, luego enjuagar las perlas con un tampón de trabajo (20 mM HEPES (pH 7,5), 100 mM de NaCl, 1 mM de EDTA). Cuente el número de cuentas pegadas a la superficie en un campo de visión. Una superficie bien tratada debe mostrar cero o solo unas pocas cuentas.
  2. Aísle e inmovilice las ataduras de ADN telomérico en una celda de flujo.
    1. Tome 10 μL de perlas M270 (10 mg/mL) o 5 μL de MyOne de 10 mg/mL y lávelas cinco veces con 50 μL de tampón de trabajo (20 mM HEPES [pH 7,5], 100 mM de NaCl, 1 mM de EDTA) utilizando un imán.
    2. Tome 500 ng de ADN genómico digerido y colóquelo en un tubo de centrífuga de 1,5 ml. Agregue todas las perlas (50 μL) encima de la muestra de ADN.
    3. Sin pipetar, agite suavemente el tubo de centrífuga unas cuantas veces para mezclar las perlas y la muestra de ADN. Deja la mezcla en hielo durante 1 h. Lavar con 500 μL de tampón de trabajo tres veces usando un imán para tirar de las perlas hacia abajo, con intervalos de 10 minutos entre lavados.
    4. Vuelva a suspender la muestra con 30 μL de tampón de trabajo y cargue la mezcla en la celda de flujo. Dejar actuar durante 30 min. Cuentas magnéticas sin atajar al ras.
      NOTA: El ADN telomérico está unido entre el cubreobjetos inferior y el cordón magnético a través de interacciones de afinidad mediadas por digoxigenina-anticuerpo y biotina-estreptavidina (Figura 3B).
  3. Configurar una celda de flujo en pinzas magnéticas
    1. Limpie la celda de flujo con etanol al 70% y seque la superficie con papel de lente. Coloque la celda de flujo limpia en el portamuestras inferior y ensamble suavemente el estante de muestras superior con un destornillador.
    2. Aplique una gota de aceite para lentes en la superficie inferior de la celda de flujo, donde se alinea con la lente del objetivo. A continuación, coloque el portamuestras encima de la lente del objetivo y asegúrelo con un destornillador.
    3. Seleccione un par de imanes cúbicos de 5 mm dispuestos en configuración vertical. Alinee el soporte del imán con el eje X de la trayectoria de la luz de las pinzas magnéticas para obtener imágenes.
      NOTA: Este es un paso crítico. La dirección del campo magnético está alineada y, por lo tanto, determinada por la orientación del soporte del imán.
    4. Inicie el software de programación gráfica y conecte los controladores para las pinzas magnéticas. Ajuste el campo de visión para ubicar un cordón de referencia en la parte inferior de la celda de flujo y ajuste ligeramente la lente del objetivo para que el cordón de referencia muestre anillos de difracción claros.
    5. Mueva los imanes hacia abajo hasta la parte superior de la celda de flujo.
      NOTA: Este es un paso crítico. Los cambios repentinos en el patrón de difracción del cordón indican que los imanes acaban de tocar la superficie de la celda de flujo. Esta posición se considera el desplazamiento para el punto cero de medición.
      NOTA: Baje los imanes con cuidado, comenzando con pasos más grandes y cambiando gradualmente a pasos más pequeños. Muévase en incrementos de 0,1 mm para evitar dañar la celda de flujo al acercarse a la celda de flujo.
    6. Levante los imanes a su posición más alta y retire el soporte del imán.
    7. Encienda la bomba peristáltica conectada a la botella de residuos y deseche el líquido. Agregue 100 μL de tampón de trabajo a la entrada y ajuste el caudal de la bomba peristáltica a 100 μL/min para llenar la celda de flujo con tampón.

5. Mediciones de un telómero mediante pinzas magnéticas de una sola molécula

  1. Configura la cámara.
    1. Establezca la escala de grises de la cámara complementaria de semiconductor de óxido metálico (CMOS) con un ajuste de brillo en 150 niveles.
    2. Defina el tamaño de la región de interés (ROI).
    3. Ajusta la velocidad de fotogramas a 200 Hz con un tiempo de exposición de 5000 μs.
      NOTA: Este es un paso crítico. Asegúrese de que el tiempo muerto del obturador esté establecido en cero.
    4. Mueva la posición del imán a 3 cm (aproximadamente 8 pN) y ajuste el enfoque del objetivo en las cuentas.
  2. Establecer la tabla de búsqueda (LUT).
    1. Mueva los imanes a una posición correspondiente a 8 pN para estirar firmemente la cuenta magnética atada al ADN.
    2. Establece la LUT en 200 pasos con un tamaño de paso de 0,05 μm.
    3. Utilice una cámara CMOS para capturar los perfiles de las cuentas magnéticas en diferentes posiciones para establecer la LUT.
      NOTA: Este es un paso crítico. Las perlas de poliestireno fijadas en la celda de flujo sirven como perlas de referencia para eliminar la deriva de las perlas de interés.
  3. Diseñar un experimento mecánico de una sola molécula.
    1. Escriba un script en MATLAB para controlar los movimientos del motor para ensayos de rampa de fuerza o salto de fuerza.
      NOTA: Este es un paso crítico. Este script codifica los comandos para los movimientos del imán. La tasa de carga de fuerza se establece en este paso para un ensayo de rampa de fuerza. Aquí también se determinan los niveles y duraciones de los ensayos de salto de fuerza (Figura 4, Archivo Suplementario 1, Archivo Suplementario 2 y Archivo Suplementario 3).
    2. Importe el script en un software de programación gráfica para probar los experimentos de una sola molécula.
    3. Compruebe el total de fotogramas necesarios para ejecutar el experimento de una sola molécula y asegúrese de que la memoria disponible supera este requisito.
      NOTA: Los datos se perderán si la memoria asignada es menor que la necesaria, ya que el almacenamiento de datos lleva tiempo.
    4. Verifique la velocidad máxima de generación de imágenes para determinar el número máximo de cuentas que se pueden monitorear simultáneamente.
      NOTA: El experimento finalizará si se excede el límite de velocidad de obtención de imágenes.
    5. Usando un ensayo de salto de fuerza como ejemplo, ejecute el experimento mecánico de una sola molécula. Las fuerzas se aplican bruscamente a la perla magnética, que transmite estas fuerzas a la molécula de ADN, estirándola inmediatamente hacia arriba.

6. Mediciones de TRF1/2 en un telómero utilizando pinzas magnéticas

  1. Ensayo de rampa de fuerza
    1. Usando TRF1 como ejemplo, cargue 200 μL de TRF1 de 10 nM en la celda de flujo a un caudal lento (por ejemplo, 30 μL/min). Espere 30 minutos para que TRF1 se una al ADN telomérico.
    2. Elija un script para un experimento de rampa de fuerza con una tasa de carga de fuerza de ±1 pN/s.
    3. Asigne un nombre adecuado a los archivos de datos y ejecute el experimento. Los datos se guardarán en el destino especificado para su análisis (Figura 5).
      NOTA: Durante este experimento, la fuerza aumenta y disminuye linealmente entre 0 pN y 17 pN, lo que estira y relaja el ADN telomérico y rompe los bucles de ADN mediados por TRF1/2.
  2. Ensayo de salto de fuerza
    1. Seleccione un script para ejecutar un ensayo de salto forzado.
      NOTA: Se aplican varias fuerzas para estirar el ADN telomérico, por ejemplo, "Fuerza de reposo" (Frest) a 0 pN durante 40 s, "Fuerza de prueba" (Ftest) que oscila entre 2 y 8 pN durante 60 s, "Fuerza alta" (Fhigh) a 10 pN durante 30 s y "Fuerza máxima" (Fmax) a 20 pN durante 30 s.
    2. Asigne un nombre adecuado a los archivos de datos y ejecute el experimento. Los datos se guardarán en el destino especificado para su análisis (Figura 5).

Resultados

La figura 1A ilustra los dominios esquemáticos y las estructuras de TRF1 y TRF2, que constan de 439 y 542 aminoácidos, respectivamente, que pueden expresarse en células procariotas. La preparación de TRF1 ha sido descrita previamente en la literatura41. Aquí, proporcionamos una descripción completa y resultados representativos de la preparación de TRF2. La Figura 1B muestra el mapa de plásmidos ut...

Discusión

Este protocolo emplea pinzas magnéticas para la manipulación de TRFs a nivel de una sola molécula 57,58,59. Utilizamos perlas magnéticas para separar los TRF de los fragmentos de ADN genómico. Después de la digestión de restricción, los TRF se unen a las perlas magnéticas, lo que permite su fácil separación de los fragmentos de ADN genómico. Este enfoque permite la manipulación medi...

Divulgaciones

Los autores declaran no tener intereses financieros contrapuestos ni otros conflictos de intereses.

Agradecimientos

Este trabajo fue apoyado por la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China [Subvención 32071227 a Z.Y.], la Fundación Municipal de Ciencias Naturales de Tianjin de China (22JCYBJC01070 a Z.Y.) y el Laboratorio Estatal Clave de Tecnología e Instrumentos de Medición de Precisión (Universidad de Tianjin) [Subvención pilab2210 a Z.Y.].

Materiales

NameCompanyCatalog NumberComments
Anti-DigoxigeninRoche11214667001
BfaINew England Biolab (NEB)R0568S
BSASigma-AldrichV900933
CMOS camera MikrotronMC1362
CviAIINew England Biolab (NEB)R0640S
DIG-11-dUTPJena BioscienceNU-803-DIGXL
DNA extraction solutionG-CLONEEX0108
Dnase I, Rnase-Free, Hc EaThermo Fisher ScientificEN0523
dNTP mixtureNanjing Vazyme Biotech Co., Ltd (Vazyme)P032-02
DTTSolarbioD1070
Dynabeads M-270  beadsThermo Fisher Scientific65305Streptavidin beads
Dynabeads MyOne beadsThermo Fisher Scientific65001Streptavidin beads
EthanolTianjin No.6 Chemical Reagent Factory1083
GlycerolBeijing Hwrkchemical Co,. LtdSMG66258-1
ImidazoleSolarbioII0070
IPTGSolarbioI8070
IsopropanolTianjin No.6 Chemical Reagent FactoryA1079
KanamycinThermo Fisher ScientificEN0523
Klenow fragment (3′-5′ exo-)New England Biolab (NEB)M0212S
LabViewNational Instrumentshttps://www.ni.com/en-us/shop/product/labview.htmlGraphical programming software 
LiClBide Pharmatech Co., Ltd (bidepharm)BD136449
LysozymeSolarbioL8120-5
MseINew England Biolab (NEB)R0525S
NaClShanghai AladdinC111533
NanoDropThermo Fisher ScientificSpectrophotometer
NdeINew England Biolab (NEB)R0111S
Ni NTA Beads 6FFChangzhou Smart-Lifesciences Biotechnology Co.,LtdSA005025
Nitrocellulose membraneABclonalRM02801
PMSFSolarbioP8340
Proteinase KBeyotime Biotech Inc (beyotime)ST535-500mg
rCutSmart BufferNew England Biolab (NEB)B6004S
Rnase ASigma-AldrichR4875
Sodium acetateSERVA Electrophoresis GmbH2124902
Sumo proteaseBeyotime Biotech Inc (beyotime)P2312M

Referencias

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