1分子磁気ピンセットを用いたテロメアタンパク質-DNA相互作用の解析

要約

このプロトコルは、テロメアDNA結合タンパク質(テロメア反復結合因子1 [TRF1]およびTRF2)とヒト細胞から抽出された長いテロメアとの間の相互作用を研究するために、単一分子磁気ピンセットを使用する方法を示しています。テロメアとテロメア反復結合因子の準備手順、1分子実験の実行、データ収集と分析の方法について説明します。

要約

染色体の末端にある保護構造であるテロメアは、細胞の寿命とゲノムの安定性を維持するために重要です。それらの適切な機能は、複製、伸長、および損傷応答の厳密に制御されたプロセスに依存します。シェルタリン複合体、特にテロメア反復結合因子1(TRF1)とTRF2は、テロメア防御において極めて重要な役割を果たしており、創薬の潜在的な抗がん標的として浮上しています。これらのタンパク質は、反復テロメアDNAモチーフTTAGGGに結合し、保護構造の形成と他のテロメアタンパク質の動員を促進します。構造的手法と高度なイメージング技術により、テロメアタンパク質-DNA相互作用に関する知見が得られてきましたが、その動的プロセスを解明するには、1分子のアプローチが必要です。磁気ピンセット、光ピンセット、原子間力顕微鏡(AFM)などのツールを使用して、テロメアタンパク質-DNA相互作用を研究し、TRF2依存性DNAの歪みやテロメラーゼ触媒などの重要な詳細を明らかにしています。しかし、テロメア反復モチーフを用いた単一分子コンストラクトの調製は依然として困難な課題であり、単一分子の機械的手法を利用する研究の幅が限られる可能性があります。これに対処するために、私たちは磁気ピンセットを備えた完全長ヒトテロメアDNAを使用して相互作用を研究する方法を開発しました。このプロトコルでは、TRF2の発現と精製、テロメアDNAの調製、単一分子メカニカルアッセイの設定、およびデータの分析の方法について説明します。この詳細なガイドは、テロメア生物学およびテロメア標的創薬の研究者に役立ちます。

概要

テロメアは、染色体^1,2,3の末端にある保護構造です。細胞分裂中のテロメアの侵食は細胞の老化と老化につながり、テロメアの異常な伸長はがんの一因となります^4,5。テロメアが適切に機能するためには、その複製、伸長、および損傷応答を高度に制御する必要があります^6,7,8。シェルタリンは6つのサブユニットで構成され、テロメア保護において中心的な役割を果たしています^9,10,11。テロメアをより深く理解することで、テロメアの生物学に関する貴重な洞察を得ることができます。

TRF1およびTRF2は、シェルタリンのコアサブユニットであり、テロメア結合タン....

プロトコル

1. 一般的な材料と方法

1. このプロトコールで使用される塩、化学物質、抗生物質、酵素、抗体、および樹脂材料については、 材料ファイルの表 を参照してください。
2. 冷泉港プロトコル45,46,47,48,49,50,51,52,53のレシピに従って、ルリア・ベルターニ(LB)液体培地、LB寒天培地、HEPES緩衝液、SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS-PAGE)、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)、トリスEDTA(TE)緩衝液を準備します。
3. pET28aベクター(Addgene)、原核細胞株、および真核細胞株(ATCC)を市販のソースから入手....

結果

図1Aは、原核細胞で発現可能な439アミノ酸と542アミノ酸からなるTRF1とTRF2の概略的なドメインと構造を示しています。TRF1の調製は、文献⁴¹に以前に記載されている。ここでは、TRF2の調製の包括的な説明と代表的な結果を提供します。図1Bは、大腸菌でTRF2を発現するために使用されるプラスミドマッ?.......

ディスカッション

このプロトコルは、単一分子レベルでのTRFの操作に磁気ピンセットを採用しています57,58,59。私たちは、磁気ビーズを利用して、ゲノムDNA断片からTRFを分離します。制限酵素消化後、TRFは磁気ビーズに結合し、ゲノムDNA断片から容易に分離することができます。このアプローチでは、磁気ピンセッ.......

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anti-Digoxigenin	Roche	11214667001
BfaI	New England Biolab (NEB)	R0568S
BSA	Sigma-Aldrich	V900933
CMOS camera	Mikrotron	MC1362
CviAII	New England Biolab (NEB)	R0640S
DIG-11-dUTP	Jena Bioscience	NU-803-DIGXL
DNA extraction solution	G-CLONE	EX0108
Dnase I, Rnase-Free, Hc Ea	Thermo Fisher Scientific	EN0523
dNTP mixture	Nanjing Vazyme Biotech Co., Ltd (Vazyme)	P032-02
DTT	Solarbio	D1070
Dynabeads M-270  beads	Thermo Fisher Scientific	65305	Streptavidin beads
Dynabeads MyOne beads	Thermo Fisher Scientific	65001	Streptavidin beads
Ethanol	Tianjin No.6 Chemical Reagent Factory	1083
Glycerol	Beijing Hwrkchemical Co,. Ltd	SMG66258-1
Imidazole	Solarbio	II0070
IPTG	Solarbio	I8070
Isopropanol	Tianjin No.6 Chemical Reagent Factory	A1079
Kanamycin	Thermo Fisher Scientific	EN0523
Klenow fragment (3′-5′ exo-)	New England Biolab (NEB)	M0212S
LabView	National Instruments	https://www.ni.com/en-us/shop/product/labview.html	Graphical programming software
LiCl	Bide Pharmatech Co., Ltd (bidepharm)	BD136449
Lysozyme	Solarbio	L8120-5
MseI	New England Biolab (NEB)	R0525S
NaCl	Shanghai Aladdin	C111533
NanoDrop	Thermo Fisher Scientific		Spectrophotometer
NdeI	New England Biolab (NEB)	R0111S
Ni NTA Beads 6FF	Changzhou Smart-Lifesciences Biotechnology Co.,Ltd	SA005025
Nitrocellulose membrane	ABclonal	RM02801
PMSF	Solarbio	P8340
Proteinase K	Beyotime Biotech Inc (beyotime)	ST535-500mg
rCutSmart Buffer	New England Biolab (NEB)	B6004S
Rnase A	Sigma-Aldrich	R4875
Sodium acetate	SERVA Electrophoresis GmbH	2124902
Sumo protease	Beyotime Biotech Inc (beyotime)	P2312M