著者
お問い合わせ

サインイン

このコンテンツを視聴するには、JoVE 購読が必要です。 サインイン又は無料トライアルを申し込む。

この記事について

  • 要約
  • 要約
  • 概要
  • プロトコル
  • 結果
  • ディスカッション
  • 開示事項
  • 謝辞
  • 資料
  • 参考文献
  • 転載および許可

要約

このプロトコルは、テロメアDNA結合タンパク質(テロメア反復結合因子1 [TRF1]およびTRF2)とヒト細胞から抽出された長いテロメアとの間の相互作用を研究するために、単一分子磁気ピンセットを使用する方法を示しています。テロメアとテロメア反復結合因子の準備手順、1分子実験の実行、データ収集と分析の方法について説明します。

要約

染色体の末端にある保護構造であるテロメアは、細胞の寿命とゲノムの安定性を維持するために重要です。それらの適切な機能は、複製、伸長、および損傷応答の厳密に制御されたプロセスに依存します。シェルタリン複合体、特にテロメア反復結合因子1(TRF1)とTRF2は、テロメア防御において極めて重要な役割を果たしており、創薬の潜在的な抗がん標的として浮上しています。これらのタンパク質は、反復テロメアDNAモチーフTTAGGGに結合し、保護構造の形成と他のテロメアタンパク質の動員を促進します。構造的手法と高度なイメージング技術により、テロメアタンパク質-DNA相互作用に関する知見が得られてきましたが、その動的プロセスを解明するには、1分子のアプローチが必要です。磁気ピンセット、光ピンセット、原子間力顕微鏡(AFM)などのツールを使用して、テロメアタンパク質-DNA相互作用を研究し、TRF2依存性DNAの歪みやテロメラーゼ触媒などの重要な詳細を明らかにしています。しかし、テロメア反復モチーフを用いた単一分子コンストラクトの調製は依然として困難な課題であり、単一分子の機械的手法を利用する研究の幅が限られる可能性があります。これに対処するために、私たちは磁気ピンセットを備えた完全長ヒトテロメアDNAを使用して相互作用を研究する方法を開発しました。このプロトコルでは、TRF2の発現と精製、テロメアDNAの調製、単一分子メカニカルアッセイの設定、およびデータの分析の方法について説明します。この詳細なガイドは、テロメア生物学およびテロメア標的創薬の研究者に役立ちます。

概要

テロメアは、染色体1,2,3の末端にある保護構造です。細胞分裂中のテロメアの侵食は細胞の老化と老化につながり、テロメアの異常な伸長はがんの一因となります4,5。テロメアが適切に機能するためには、その複製、伸長、および損傷応答を高度に制御する必要があります6,7,8。シェルタリンは6つのサブユニットで構成され、テロメア保護において中心的な役割を果たしています9,10,11。テロメアをより深く理解することで、テロメアの生物学に関する貴重な洞察を得ることができます。

TRF1およびTRF2は、シェルタリンのコアサブユニットであり、テロメア結合タンパク質である12,13。TRF1とTRF2はどちらも、Mybドメイン14を介してテロメアの反復DNAモチーフTTAGGGに結合します。それらは、それらの共有TRFHドメインを通じて二量体を形成し、これにより、テロメア二本鎖DNAを取り囲み、テロメアタンパク質15,16,17,18,19をリクルートすることができる。TRF2は、テロメアDループおよびTループの形成に特に重要である20,21。テロメア保護におけるそれらの重要な役割のために、TRF1およびTRF2は、潜在的な抗がん剤標的として浮上している22,23,24,25。

テロメアでのタンパク質-DNA相互作用の調査には、多大な努力が払われてきました。電気泳動移動度シフトアッセイ(EMSA)や表面プラズモン共鳴(SPR)などの生化学的方法を使用して、結合親和性を調べている20,26。DNAと複合体を形成したテロメア結合タンパク質の多数の構造は、クライオ電子顕微鏡(クライオ電子顕微鏡)、X線結晶構造解析、および核磁気共鳴(NMR)を使用して解明されています27,28,29。確率的光学再構成顕微鏡(STORM)のような超解像イメージング技術により、TRF2依存性Tループ形成が明らかになった21。最近、ナノポアシーケンシングが開発され、テロメア配列4,30,31をプロファイリングしています。これらの構造的知見により、テロメアタンパク質-DNA相互作用の理解が大幅に向上しました。テロメアタンパク質-DNA相互作用のダイナミクスをさらに探求するためには、新しい技術の開発が不可欠です。

単一分子ツールは、テロメア32,33,34でのタンパク質-DNA相互作用を探索するための強力な技術です。磁気ピンセット、光ピンセット、AFMなどの単一分子の機械的方法が、TRF2依存性DNAの歪みを調査し、TRF2を介したヒトテロメアクロマチンの柱状スタッキングを明らかにし、プロセシブテロメラーゼ触媒作用を観察するために採用されてきました35,36,37,38,39,40.これらの方法は、トポロジカルコンフォメーションや、タンパク質-DNAの会合と解離の動力学を調べるのに特に有用です。

しかし、テロメア反復モチーフを用いた単一分子コンストラクトの調製には依然として課題があり、単一分子の機械的手法を用いた研究は限られています。この制限に対処するために、我々は、完全長ヒトテロメア41上の全球的なタンパク質-DNA相互作用を研究するための単一分子の力学的方法を開発しました。この方法は、ヒト細胞からテロメアDNAを直接抽出するため、手間のかかる人工テロメアDNAの調製を回避できます。これにより、数キロベースに及ぶ長い天然テロメアの動力学的過程の研究が容易になります。

このプロトコルでは、一般的な単一分子の機械的ツールである磁気ピンセットを使用してテロメアタンパク質-DNA相互作用をプローブするためのステップの詳細な説明を提供します42,43,44。TRF2を例に、テロメアタンパク質の発現・精製方法や、ヒト細胞からテロメアDNAを作製する方法を示します。さらに、テロメアタンパク質-DNA相互作用を研究するための磁気ピンセットでの単一分子アッセイの設定方法を示し、その後の単一分子実験のデータ解析についても説明します。このプロトコルは、テロメア生物学およびテロメア標的創薬の分野の研究者に利益をもたらします。

プロトコル

1. 一般的な材料と方法

  1. このプロトコールで使用される塩、化学物質、抗生物質、酵素、抗体、および樹脂材料については、 材料ファイルの表 を参照してください。
  2. 冷泉港プロトコル45,46,47,48,49,50,51,52,53のレシピに従って、ルリア・ベルターニ(LB)液体培地、LB寒天培地、HEPES緩衝液、SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS-PAGE)、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)、トリスEDTA(TE)緩衝液を準備します。
  3. pET28aベクター(Addgene)、原核細胞株、および真核細胞株(ATCC)を市販のソースから入手します。その後、実験室で連続的に培養し継代します。
  4. 大量の液体の場合は、120°Cで20分間オートクレーブします。少量の場合は、孔径が0.22μmの滅菌フィルターを使用してください。
  5. 溶液を最終容量にする前に、HClまたはNaOHを使用して溶液のpHを目的のレベルに調整します。
    注:磁気ピンセットはカスタムビルドでLabVIEW 2017の環境で動作しますが、1分子のデータ解析はMATLAB 2017 2,54,55で実行されます。
  6. 安全上の理由から、長袖の白衣、ニトリル手袋(または不浸透性で物質に耐性のある材料で作られた手袋)、安全メガネまたはゴーグル、つま先が閉じた靴を着用してください。

2. テロメアDNA結合タンパク質のタンパク質発現と精製

  1. 細胞培養を行い、タンパク質発現を誘導します。
    1. テロメアDNA結合タンパク質(図1A)(この場合はTRF2)のコード配列を、酵素消化およびライゲーションによりpET28aベクターに挿入し、SUMOを融合タグとして使用します。BamHIとHindIIIの制限部位の間に挿入すると、pET28a-SUMO-TRF2のプラスミドが得られます(図1B)。
    2. BL21(DE3)細胞をpET28a-SUMO-TRF2プラスミドで形質転換します。
      1. コンピテントBL21(DE3)細胞の50μLアリコートを氷上で解凍します。
      2. pET28a-SUMO-TRF2プラスミド(50 ngのDNAを含む)のDNA1 μLをコンピテントセルに添加します。ピペッティングを上下に動かさずに、穏やかに渦を巻いて混ぜます。
        注意: 渦巻きにしないでください。
      3. 混合物を氷上で30分間インキュベートします。
      4. ヒートショックの場合は、セル混合物をウォーターバスで42°Cで正確に45秒間加熱します。すぐに細胞を氷に2分間戻し、形質転換した細胞を安定させます。
      5. 950 μLの室温(RT)LB培地を細胞に加えて、回復を促進します。
      6. 形質転換細胞を37°Cで1時間インキュベートし、220rpmで振とうします。
      7. 形質転換混合物100 μLを、50 μg/mLのカナマイシン(85.8 μM)を含むLB寒天プレートに広げます。
      8. 播種した細胞を37°Cで一晩インキュベートします。 インキュベーション後、スターター培養物の接種に使用する異なるコロニーを選択します。
        注:プレート上のコロニーは、4°Cで最大2週間保存できます。
    3. 形質転換したBL21(DE3)細胞のコロニーをピックアップし、50 μg/mLのカナマイシン(85.8 μM)を添加した5 mLのLB培地で培養します。220 rpmで振とうしながら、37°Cで18時間インキュベートします。
    4. スケールアップするには、2 mLの一晩培養液を、50 μg/mLのカナマイシン(85.8 μM)を含む200 mLのLB培地に移します。600 nm(OD 600)の光学密度が0.6〜0.8に達するまで、220 rpmで振とうしながら37°Cでインキュベートを続けます。
    5. 培養物1 mLを非誘導対照サンプルとして取ります。
    6. 残りの培養物をイソプロピルβ-d-1-チオガラクトピラノシド(IPTG)で最終濃度1 mMまで誘導し、20°Cで17時間インキュベートしてタンパク質発現を促進します。
    7. 5%スタッキングゲルと10%セパレーションゲルを用いてSDS-PAGEを行います。SDS-PAGEローディングバッファーでサンプルをロードし、SDS-PAGEを最初に100 Vで30分間、続いて120 Vで50分間Tris-Glycineバッファーで実行します。クマシーブルーで染色して、タンパク質の発現を視覚化します( 補足表1のレシピを参照)(図1C)。
      注: エクスプレッションが観察されない場合のトラブルシューティングについては、ディスカッションを参照してください。
  2. タンパク質を精製します。
    1. 細胞を4°C、8500 x g で10分間遠心分離して回収します。上清を捨て、ペレットを200mLのPBSで洗います。再度遠心分離し、上清を廃棄し、細胞ペレットを25 mLの溶解バッファー(20 mM HEPES、300 mM NaCl、20 mMイミダゾール、10%グリセロール、0.5 mM DTT、1 mMフェニルメチルスルホニルフッ化物[PMSF])に再懸濁します。
      注意: PMSFは腐食性で有毒であり、火傷を引き起こします。適切な防護服、手袋、目/顔の保護具を着用してください。
      注:すぐに続行しない場合は、-80°Cで凍結します。
    2. 5 μL の 100 mg/mL リゾチーム、5 μL の 1 U/μL DNase I、および 5 μL の 10 mg/mL RNase A を再懸濁細胞に加えます。
    3. 氷上で超音波処理を行い、250Wで1秒のバーストと2秒の一時停止、合計30分間行います。
    4. 38,000 x g、4°Cで40分間(30〜60分が許容されます)遠心分離し、0.22μmシリンジフィルターで上清をろ過します。
    5. 8.76 gのNaCl(最終濃度300 mM)と0.68 gのイミダゾール(最終濃度20 mM)を20 mM HEPES(pH 8.0)に溶解して、500 mLのNiカラム結合バッファーを調製します。0.22 μmフィルターで溶液をろ過します。
      注意:イミダゾールは危険であり、皮膚や目の炎症を引き起こす可能性があります。.また、胎児に害を及ぼす可能性もあります。目、皮膚、衣服との接触を避けてください。摂取したり吸い込んだりしないでください。フェイスプロテクションを含む個人用保護具を着用してください。
    6. 段階的な溶出のためにイミダゾール(100 mM、200 mM、300 mM、500 mM)の濃度を上げたNiカラム溶出バッファー(20 mM HEPES(pH 8.0)、300 mM NaCl)を調製し、すべてのバッファーが適切にろ過されるようにします。
    7. ろ過した上清を、結合バッファー(20 mM HEPES(pH 8.0)、300 mM NaCl、20 mM イミダゾール)中の予め平衡化したNiカラムにロードします。結合バッファーで洗浄し、調製したイミダゾールグラジエントでタンパク質を溶出し、それぞれ1mLの12のフラクションを収集します(図1C)。純度>95%のフラクションを組み合わせます。
    8. 溶出した6xHis-sumo-TRF2融合タンパク質の濃度をA280 で分光光度計で測定します。
    9. 1分子アッセイで使用するタンパク質については、製造元の指示に従って相撲プロテアーゼ(通常、融合タンパク質2 μgあたり0.125 Uのプロテアーゼ)を添加し、4°Cで一晩消化します。
    10. 相撲プロテアーゼ処理後、混合物をNiカラムに再度ロードして、未消化の融合タンパク質とHisタグ付き相撲タンパク質を結合させ、タグフリーのTRF2タンパク質を流します。フロースルーを収集します。
  3. タンパク質の濃度を測定し、タンパク質を保存します。
    1. 精製したTRF2タンパク質を30 kDaカットオフ遠心フィルターユニットで濃縮し、20 mM HEPES(pH 8.0)、150 mM NaCl、0.5 mM DTTを含む保存バッファーに交換して、イミダゾール濃度を150 mM未満に下げます。
    2. 容量が1mL未満になるまで、濃縮プロセスを繰り返します。
    3. SDS-PAGEによる各精製ステップのサンプルの分析により、タンパク質の純度と完全性を評価します(図1C)。
      注:アフィニティークロマトグラフィーは、タンパク質の精製、溶出サンプルの収集と洗浄、およびタンパク質の完全性の評価と品質管理を確保するためのSDS-PAGEの実施に使用されます。アフィニティークロマトグラフィーだけでは純度の要件を満たしていない場合は、サイズ排除クロマトグラフィーを使用してタンパク質の純度をさらに高めます。UV吸光度曲線は溶出画分の評価に役立ち、SDS-PAGEはタンパク質の完全性を検証し、プロセス全体で厳格な品質管理を保証します。
    4. グリセロールを最終濃度50%まで濃縮し、バッファー交換したタンパク質に添加して保存します。
    5. タンパク質を-80°Cで保存します。

3. ヒトテロメア制限フラグメントの調製

  1. ゲノムDNAを抽出します。
    1. フローチャート(図2A)に従って、1 x 107 細胞を1000 x g で3分間遠心分離し、上清を廃棄します。洗浄は、細胞を200 μLのPBSに再懸濁し、再度1000 x g で3分間遠心分離し、上清を捨てます。
    2. 50 mM Tris-HCl (pH 8.0)、100 mM NaCl、100 mM EDTA、および 1% SDS を含むバッファー 760 μL を 1 x 107 細胞を含むチューブに加え、気泡を避けるためにピペッティングで穏やかに再懸濁します。
      注意: 渦巻きにしないでください。
    3. タンパク質を消化し、サンプル中のDNaseおよびRNaseを除去するには、プロテイナーゼKを最終濃度0.5 mg/mL(10 mg/mLのストック溶液40 μLに相当)まで添加します。チューブの底を軽くたたいて混ぜます(ボルテックスしないでください)。
    4. 37°Cで一晩インキュベートします。
    5. 265 μLの5.4 M NaClを添加します。チューブを毎分5回反転させて5分間混合し、次に氷の上に20分間置きます。
    6. 最高速度(例:16,900 x g)でRTで10分間遠心分離します。
    7. 上清を遠心チューブに移し、浮遊する脂質や沈殿物を避けて、等量のイソプロパノール(約750μL)を加えます。DNAは上清中にあります。
    8. チューブを5回反転させて混ぜます。遠心分離管内に沈殿するDNAのペレットの存在を視覚的に確認します。
    9. RTで最高速度で10分間遠心分離します。
    10. 上清を捨てます。遠心分離管を5回反転させて、DNAペレットを500μLの70%エタノールで洗浄します。
      注:ペレットはDNAです。
    11. 室温で最高速度(例:16,900 x g)で10分間遠心分離します。
    12. DNAペレットを残して、すべての上清を慎重に取り除きます。ペレットをRTで5分間自然乾燥させます。
      注:ゲノムDNAは溶解しにくくなる可能性があるため、過度に乾燥しないでください。
    13. DNAペレットを475 μLのTEバッファー(10 mM Tris-HCl [pH 8.0]、1 mM EDTA)に再懸濁します。チューブの底を軽くたたいてやさしく混ぜます。DNA調製時のRNAの消化には、10 mg/mL RNase A(最終濃度0.5 mg/mL)を25 μL加え、DNAペレットが完全に溶解するまで軽くたたいて混合します。
      注:DNAのせん断を防ぐために、ボルテックスは避けてください。
    14. DNAサンプルを4°Cで一晩インキュベートします。
    15. 等量のトリス飽和フェノール抽出を行う:500 μLのフェノールを遠心分離チューブに加え、ピペットで穏やかに混合し、最高速度で4°Cで10分間遠心分離します。
      注意: フェノールにさらされると、皮膚、目、鼻、喉、神経系に刺激を与える可能性があります。目、皮膚、衣服との接触を避けてください。摂取したり吸い込んだりしないでください。フェイスプロテクションを含む個人用保護具を着用してください。
      注:DNAは上部水相にあり、タンパク質は間相にあり、有機相は下部にあります。
    16. 3回繰り返します。DNAの上清(約280μL)を採取します。
    17. DNAサンプルの容量に応じて、3 M酢酸ナトリウム(最終濃度0.3 M、pH 5.2)の1/10容量(28 μL)と冷100%エタノールの2容量(616 μL)を加えます。遠心分離管を-80°Cに2〜3時間置きます。
    18. 最高速度(例:16,900 x g)で4°Cで10分間遠心分離します。 遠心分離前に凍結した場合は、溶液を氷上で解凍します。
    19. 上清を捨て、遠心分離管を反転させて70%エタノールで3〜4回洗浄します。4°Cで5分間最高速度で遠心分離します。
    20. エタノールを取り出し、ペレットをRTで5分間風乾させます。
    21. 100 μL の TE バッファーを加え、チューブを軽くたたいて混合し、4 °C で 2 時間放置して完全に溶解します。
      注:1%アガロースゲル上のゲノムDNAの完全性を調べます(図2B)。
    22. DNAを-20°Cで冷凍庫に保管します。少なくとも1年間は安定しています。
  2. ゲノムDNAの消化と修飾を行います。
    1. 4 μgのゲノムDNAを取り、1 μLのCviAII(10 U)、2 μLの10倍消化バッファー(レシピについては 補足表1 を参照)と組み合わせ、水を加えて総容量20 μLにします。
      注:FatIは、NEBによって廃止されたCviAIIを置き換えることができます。
    2. 前の混合物(20 μL)を入れた同じチューブに、1 μLのNdeI(20 U)、1 μLのMseI(10 U)、および1 μLのBfaI(10 U)を加えます。また、2 μLの10倍消化バッファーと15 μLの水を加えて、総容量を40 μLにします。37°Cで12時間インキュベートした後、すべての酵素を80°Cで20分間熱不活性化します。
      注:ゲノムDNAの消化は、Terminal Restriction Fragment(TRF)法を使用して調べることができます(図2C)。4つの制限酵素(CviAII、NdeI、MseI、BfaI)の組み合わせにより、ゲノムDNAが約800 bpの断片に消化され、テロメア下DNAの汚染が最小限に抑えられたTRFが得られます。
    3. ジゴキシゲニン修飾には、消化したゲノムDNAを40 μL取り、1 mM dATP(最終濃度0.08 mM)を4 μL、1 mMジゴキシゲニン-11-dUTP(最終濃度0.08 mM)を4 μL、Klenow Fragment(5 U)1 μL、100 mM DTT(最終濃度1 mM)0.5 μL、および10x消化バッファー1 μLを添加します。37°Cで12時間インキュベートした後、75°Cで20分間加熱してKlenowフラグメントを不活性化します。
    4. ビオチン標識には、ジゴキシゲニン修飾ゲノムDNA 12.5 μL(1 μg)を添加し、テロメア一本鎖オーバーハングに相補的な1 μMビオチン化テロメアプローブ(1 pmol)を1 μL追加します。611.5 μL の TE Li バッファー (10 mM Tris-HCl (pH 8.0)、1 mM EDTA、50 mM LiCl) を加えて 50 mM K イオンを 1 mM に希釈すると、総容量は 625 μL になり、それぞれ 39 μL のチューブを 16 本に分けることができます。
    5. サーマルサイクラーで75°Cで3分間加熱し、その後、25°Cに達するまで30秒ごとに温度を0.1°C下げます。
    6. DNAサンプルは-20°Cで少なくとも1年間保存します。

4. 磁気ピンセットでのテロメアDNAサンプル用フローセルのセットアップ

  1. 1分子アッセイ用のフローセルを作製します。
    1. 電動グラインダーを使用して、上部カバースリップ(厚さ2 mmの#0.2カバーガラス)の入口と出口として穴を開けます。
    2. カバースリップを洗剤で30分間超音波処理して清掃します。
    3. カバースリップを超純水で3回洗います。
    4. カバースリップをイソプロパノールで30分間超音波処理して清掃します。
    5. カバースリップを超純水で3回洗います。
    6. 15〜30分間の超音波処理により、超高純度でカバースリップを清掃します。
    7. カバースリップを窒素で乾かします。
      注:プロトコルはここで停止でき、洗浄されたカバースリップは後で使用するために保管できます。
    8. 底面のカバースリップ(穴なし)に20 μLの0.1%ニトロセルロースをコーティングし、リファレンスビーズ(20倍希釈、直径3 μm)を加えます。100°Cで4分間焼きます。
    9. メスを使用して、金属金型に従って2層のパラフィルムスペーサーをカットします。モールドは、カバーガラスと同じ寸法の長方形のアルミニウム合金ピースで、チャネルの切断を容易にするために中央がくり抜かれています。
    10. フローセルサンドイッチを組み立てます(図3A)。85°Cに加熱し、パラフィルムがチャネルを密閉するまで、2本の綿棒を使用してマッサージします。
    11. フローセルを抗体でコーティングします。70 μL の抗ジゴキシゲニン抗体 (0.1 mg/mL) をフローセルに直接注入します。RTで1時間放置します。
    12. フローセルを不動態化します。70 μLの10 mg/mL BSAを注入して、抗ジゴキシゲニン抗体を置換します。RTで12時間放置します。未結合の抗ジゴキシゲニン抗体は、厳密なフラッシングにより次のステップで洗い流されます。
      注:フローセルを4°Cで1〜2週間保存します。
    13. DNAを含まない5 μLの洗浄済みMyOne (10 mg/mL)(または5 μLの洗浄済みM270 (10 mg/mL))ビーズをフローセルにフラッシングし、非特異的結合を試験します。10分間放置した後、ワーキングバッファー(20 mM HEPES(pH 7.5)、100 mM NaCl、1 mM EDTA)を使用してビーズを洗い流します。1つの視野で表面に付着したビーズの数を数えます。適切に処理された表面には、ビーズがゼロまたは数個しか表示されません。
  2. テロメアDNAテザーをフローセル内で単離し、固定化します。
    1. M270ビーズ10 μL(10 mg/mL)または10 mg/mL MyOneを5 μL取り、50 μLのワーキングバッファー(20 mM HEPES [pH 7.5]、100 mM NaCl、1 mM EDTA)で磁石を使用して5回洗浄します。
    2. 消化したゲノムDNA500 ngを取り出し、1.5 mLの遠心チューブに入れます。DNAサンプルの上にすべてのビーズ(50 μL)を加えます。
    3. ピペッティングせずに、遠心分離チューブを数回静かにフリックして、ビーズとDNAサンプルを混合します。混合物を氷の上に1時間放置します。500 μLのワーキングバッファーで、磁石を使用してビーズを引き下げ、10分間隔で洗浄します。
    4. 30 μLのワーキングバッファーを使用してサンプルを再懸濁し、混合物をフローセルにロードします。30分間放置します。結合されていない磁気ビーズを洗い流します。
      注:テロメアDNAは、ジゴキシゲニン抗体とビオチンストレプトアビジンによって媒介されるアフィニティー相互作用を通じて、ボトムカバースリップと磁気ビーズの間につながれています(図3B)。
  3. 磁気ピンセットにフローセルを設置
    1. フローセルを70%エタノールで洗浄し、レンズティッシュを使用して表面を乾燥させます。洗浄したフローセルを下部サンプルホルダーに置き、ドライバーを使用して上部サンプルラックを静かに組み立てます。
    2. レンズオイルをフローセルの底面に一滴垂らし、対物レンズと整列させます。次に、サンプルホルダーを対物レンズの上に置き、ドライバーで固定します。
    3. 垂直に配置された5mm立方磁石のペアを選択します。マグネットホルダーを磁気ピンセットの光路のX軸に合わせ、イメージングします。
      注: これは重要なステップです。磁場の方向は整列しているため、マグネットホルダーの向きによって決まります。
    4. グラフィカルプログラミングソフトウェアを起動し、磁気ピンセットのコントローラーを接続します。視野を調整して、フローセルの下部にある参照ビードを配置し、対物レンズをわずかに調整して、参照ビードが明確な回折リングを示すようにします。
    5. 磁石をフローセルの上部まで下に移動します。
      注: これは重要なステップです。ビーズの回折パターンの急激な変化は、磁石がフローセルの表面に触れたばかりであることを示しています。この位置は、測定ゼロ点のオフセットと見なされます。
      注意: 磁石を慎重に下げ、大きなステップから始めて徐々に小さなステップに移します。フローセルに近づくときにフローセルが損傷しないように、0.1mm刻みで移動します。
    6. 磁石を最も高い位置まで持ち上げ、マグネットホルダーを取り外します。
    7. 廃液ボトルに接続されている蠕動ポンプをオンにし、液体を捨てます。100 μLの作業バッファーをインレットに加え、ペリスタルティックポンプの流量を100 μL/minに設定して、フローセルにバッファーを充填します。

5. 1分子磁気ピンセットを用いたテロメアの測定

  1. カメラをセットアップします。
    1. 輝度調整を行うCMOS (Complementary Metal-Oxide Semiconductor) カメラのグレースケールを 150 レベルに設定します。
    2. 関心領域 (ROI) のサイズを定義します。
    3. フレームレートを200Hzに設定し、露光時間を5000μsにします。
      注: これは重要なステップです。シャッターのデッドタイムがゼロに設定されていることを確認します。
    4. 磁石の位置を3cm(約8 pN)に移動し、ビーズへの対物レンズの焦点を調整します。
  2. ルックアップ テーブル (LUT) を確立します。
    1. 磁石を8pNに対応する位置に移動して、DNAにつながれた磁気ビーズをしっかりと伸ばします。
    2. LUTを200ステップ、ステップサイズを0.05μmに設定します。
    3. CMOSカメラを使用して、さまざまな位置で磁気ビーズのプロファイルをキャプチャし、LUTを確立します。
      注: これは重要なステップです。フローセルに固定されたポリスチレンビーズは、目的のビーズのドリフトを排除するための参照ビーズとして機能します。
  3. 1分子の機械実験を設計します。
    1. MATLAB でスクリプトを記述して、フォース ランプまたはフォース ジャンプ アッセイの運動運動を制御します。
      注: これは重要なステップです。このスクリプトは、マグネットの動きのコマンドをエンコードします。フォースローディングレートは、フォースランプアッセイのこのステップで設定されます。フォースジャンプアッセイのレベルと期間もここで決定されます(図4、補足ファイル1、補足ファイル2、および補足ファイル3)。
    2. スクリプトをグラフィカルプログラミングソフトウェアにインポートして、単一分子実験をテストします。
    3. 1分子実験の実行に必要な合計フレーム数を確認し、使用可能なメモリがこの要件を超えていることを確認します。
      注: データの保存には時間がかかるため、割り当てられたメモリが必要より少ない場合、データは失われます。
    4. 最大イメージング速度を確認して、同時に監視できるビーズの最大数を決定します。
      注:イメージング速度の制限を超えた場合、実験は終了します。
    5. フォースジャンプアッセイを例に、単一分子の機械実験を実行します。磁気ビーズに力が突然加えられ、磁気ビーズはこれらの力をDNA分子に伝達し、すぐにDNA分子を上に伸ばします。

6. 磁気ピンセットを用いたテロメア上のTRF1/2の測定

  1. フォースランプアッセイ
    1. TRF1を例にとると、10 nM TRF1 のうち 200 μL を低速流速 (30 μL/分など) でフローセルにロードします。TRF1がテロメアDNAに結合するまで30分間待ちます。
    2. フォース ロード レートが ±1 pN/s のフォース ランプ実験のスクリプトを選択します。
    3. データ ファイルに適切な名前を付けて、実験を実行します。データは、分析のために指定された宛先に保存されます(図5)。
      注:この実験中、力は0pNから17pNの間で直線的に増加および減少し、テロメアDNAを伸縮させ、TRF1/2によって媒介されるDNAループを切断します。
  2. フォースジャンプアッセイ
    1. フォースジャンプアッセイを実行するスクリプトを選択します。
      注:テロメアDNAを伸ばすために、たとえば、0 pNで40秒間の「Rest force」(Frest)、60秒間で2〜8 pNの範囲の「Test force」(Ftest)、10 pNで30秒間の「High force」(Fhigh)、20 pNで30秒間の「最大力」(Fmax)など、さまざまな力が加えられます。
    2. データ ファイルに適切な名前を付けて、実験を実行します。データは、分析のために指定された宛先に保存されます(図5)。

結果

図1Aは、原核細胞で発現可能な439アミノ酸と542アミノ酸からなるTRF1とTRF2の概略的なドメインと構造を示しています。TRF1の調製は、文献41に以前に記載されている。ここでは、TRF2の調製の包括的な説明と代表的な結果を提供します。図1Bは、大腸菌でTRF2を発現するために使用されるプラスミドマッ?...

ディスカッション

このプロトコルは、単一分子レベルでのTRFの操作に磁気ピンセットを採用しています57,58,59。私たちは、磁気ビーズを利用して、ゲノムDNA断片からTRFを分離します。制限酵素消化後、TRFは磁気ビーズに結合し、ゲノムDNA断片から容易に分離することができます。このアプローチでは、磁気ピンセッ...

開示事項

著者は、競合する金銭的利益またはその他の利益相反を宣言しません。

謝辞

本研究は、中国国家自然科学基金会 [Grant 32071227 to Z.Y.]、Tianjin Municipal Natural Science Foundation of China (22JCYBJC01070 to Z.Y.)、State Key Laboratory of Precision Measuring Technology and Instruments (Tianjin University) [Grant pilab2210 to Z.Y.]の支援を受けました。

資料

NameCompanyCatalog NumberComments
Anti-DigoxigeninRoche11214667001
BfaINew England Biolab (NEB)R0568S
BSASigma-AldrichV900933
CMOS camera MikrotronMC1362
CviAIINew England Biolab (NEB)R0640S
DIG-11-dUTPJena BioscienceNU-803-DIGXL
DNA extraction solutionG-CLONEEX0108
Dnase I, Rnase-Free, Hc EaThermo Fisher ScientificEN0523
dNTP mixtureNanjing Vazyme Biotech Co., Ltd (Vazyme)P032-02
DTTSolarbioD1070
Dynabeads M-270  beadsThermo Fisher Scientific65305Streptavidin beads
Dynabeads MyOne beadsThermo Fisher Scientific65001Streptavidin beads
EthanolTianjin No.6 Chemical Reagent Factory1083
GlycerolBeijing Hwrkchemical Co,. LtdSMG66258-1
ImidazoleSolarbioII0070
IPTGSolarbioI8070
IsopropanolTianjin No.6 Chemical Reagent FactoryA1079
KanamycinThermo Fisher ScientificEN0523
Klenow fragment (3′-5′ exo-)New England Biolab (NEB)M0212S
LabViewNational Instrumentshttps://www.ni.com/en-us/shop/product/labview.htmlGraphical programming software 
LiClBide Pharmatech Co., Ltd (bidepharm)BD136449
LysozymeSolarbioL8120-5
MseINew England Biolab (NEB)R0525S
NaClShanghai AladdinC111533
NanoDropThermo Fisher ScientificSpectrophotometer
NdeINew England Biolab (NEB)R0111S
Ni NTA Beads 6FFChangzhou Smart-Lifesciences Biotechnology Co.,LtdSA005025
Nitrocellulose membraneABclonalRM02801
PMSFSolarbioP8340
Proteinase KBeyotime Biotech Inc (beyotime)ST535-500mg
rCutSmart BufferNew England Biolab (NEB)B6004S
Rnase ASigma-AldrichR4875
Sodium acetateSERVA Electrophoresis GmbH2124902
Sumo proteaseBeyotime Biotech Inc (beyotime)P2312M

参考文献

  1. Blackburn, E. H., Epel, E. S., Lin, J. Human telomere biology: A contributory and interactive factor in aging, disease risks, and protection. Science. 350 (6265), 1193-1198 (2015).
  2. Li, N., et al. The dynamics of forming a triplex in an artificial telomere inferred by DNA mechanics. Nucleic Acids Res. 47 (15), e86 (2019).
  3. Yu, Z., et al. Click chemistry assisted single-molecule fingerprinting reveals a 3d biomolecular folding funnel. J Am Chem Soc. 134 (30), 12338-12341 (2012).
  4. Karimian, K., et al. Human telomere length is chromosome end-specific and conserved across individuals. Science. 384 (6695), 533-539 (2024).
  5. Maciejowski, J., De Lange, T. Telomeres in cancer: Tumour suppression and genome instability. Nat Rev Mol Cell Biol. 18 (3), 175-186 (2017).
  6. Kinzig, C. G., Zakusilo, G., Takai, K. K., Myler, L. R., De Lange, T. Atr blocks telomerase from converting DNA breaks into telomeres. Science. 383 (6684), 763-770 (2024).
  7. Takai, H., Aria, V., Borges, P., Yeeles, J. T. P., De Lange, T. Cst-polymerase α-primase solves a second telomere end-replication problem. Nature. 627 (8004), 664-670 (2024).
  8. De Lange, T. How telomeres solve the end-protection problem. Science. 326 (5955), 948-952 (2009).
  9. De Lange, T. Shelterin-mediated telomere protection. Annual Review of Genetics. 52 (1), 223-247 (2018).
  10. Liu, B., et al. Structure of active human telomerase with telomere shelterin protein TPP1. Nature. 604 (7906), 578-583 (2022).
  11. Sfeir, A., De Lange, T. Removal of shelterin reveals the telomere end-protection problem. Science. 336 (6081), 593-597 (2012).
  12. Sarek, G., et al. Cdk phosphorylation of trf2 controls t-loop dynamics during the cell cycle. Nature. 575 (7783), 523-527 (2019).
  13. Myler, L. R., et al. DNA-PK and the TRF2 IDDR inhibit MRN-initiated resection at leading-end telomeres. Nat Struct Mol Biol. 30 (9), 1346-1356 (2023).
  14. Hanaoka, S., Nagadoi, A., Nishimura, Y. Comparison between TRF2 and TRF1 of their telomeric DNA-bound structures and DNA-binding activities. Protein Sci. 14 (1), 119-130 (2005).
  15. Chen, Y., et al. A shared docking motif in TRF1 and TRF2 used for differential recruitment of telomeric proteins. Science. 319 (5866), 1092-1096 (2008).
  16. Wan, B., et al. SLX4 assembles a telomere maintenance toolkit by bridging multiple endonucleases with telomeres. Cell Reports. 4 (5), 861-869 (2013).
  17. Rai, R., et al. NBS1 phosphorylation status dictates repair choice of dysfunctional telomeres. Molecular Cell. 65 (5), 801-817.e4 (2017).
  18. Benarroch-Popivker, D., et al. Trf2-mediated control of telomere DNA topology as a mechanism for chromosome-end protection. Mol Cell. 61 (2), 274-286 (2016).
  19. Poulet, A., et al. The n-terminal domains of TRF1 and TRF2 regulate their ability to condense telomeric DNA. Nucleic Acids Res. 40 (6), 2566-2576 (2012).
  20. Schmutz, I., Timashev, L., Xie, W., Patel, D. J., De Lange, T. TRF2 binds branched DNA to safeguard telomere integrity. Nat Struct Mol Biol. 24 (9), 734-742 (2017).
  21. Doksani, Y., Wu, J. Y., De Lange, T., Zhuang, X. Super-resolution fluorescence imaging of telomeres reveals TRF2-dependent t-loop formation. Cell. 155 (2), 345-356 (2013).
  22. Di Maro, S., et al. Shading the TRF2 recruiting function: A new horizon in drug development. J Am Chem Soc. 136 (48), 16708-16711 (2014).
  23. Gao, J., Pickett, H. A. Targeting telomeres: Advances in telomere maintenance mechanism-specific cancer therapies. Nat Rev Cancer. 22 (9), 515-532 (2022).
  24. Bejarano, L., et al. Inhibition of TRF1 telomere protein impairs tumor initiation and progression in glioblastoma mouse models and patient-derived xenografts. Cancer Cell. 32 (5), 590-607.e4 (2017).
  25. Chen, X., et al. Cyclic peptidic mimetics of apollo peptides targeting telomeric repeat binding factor 2 (TRF2) and apollo interaction. ACS Med Chem Lett. 9 (5), 507-511 (2018).
  26. Erdel, F., et al. Telomere recognition and assembly mechanism of mammalian shelterin. Cell Rep. 18 (1), 41-53 (2017).
  27. Pendlebury, D. F., et al. Dissecting the telomere-inner nuclear membrane interface formed in meiosis. Nat Struct Mol Biol. 24 (12), 1064-1072 (2017).
  28. Court, R., Chapman, L., Fairall, L., Rhodes, D. How the human telomeric proteins trf1 and trf2 recognize telomeric DNA: A view from high-resolution crystal structures. EMBO Rep. 6 (1), 39-45 (2005).
  29. Hu, H., et al. Structural basis of telomeric nucleosome recognition by shelterin factor trf1. Sci Adv. 9 (34), eadi4148 (2023).
  30. Nurk, S., et al. The complete sequence of a human genome. Science. 376 (6588), 44-53 (2022).
  31. Rhie, A., et al. The complete sequence of a human y chromosome. Nature. 621 (7978), 344-354 (2023).
  32. Chang, T. R., Long, X., Shastry, S., Parks, J. W., Stone, M. D. Single-molecule mechanical analysis of strand invasion in human telomere DNA. Biochemistry. 61 (15), 1554-1560 (2022).
  33. Kaur, P., et al. TIN2 is an architectural protein that facilitates TRF2-mediated trans- and cis-interactions on telomeric DNA. Nucleic Acids Res. 49 (22), 13000-13018 (2021).
  34. Parks, J. W., Stone, M. D. Single-molecule studies of telomeres and telomerase. Annu Rev Biophys. 46, 357-377 (2017).
  35. Zhao, X., et al. Exploring TRF2-dependent DNA distortion through single-DNA manipulation studies. Commun Biol. 7 (1), 148 (2024).
  36. Patrick, E. M., Slivka, J. D., Payne, B., Comstock, M. J., Schmidt, J. C. Observation of processive telomerase catalysis using high-resolution optical tweezers. Nat Chem Biol. 16 (7), 801-809 (2020).
  37. Soman, A., et al. Columnar structure of human telomeric chromatin. Nature. 609 (7929), 1048-1055 (2022).
  38. Jansson, L. I., et al. Telomere DNA G-quadruplex folding within actively extending human telomerase. Proc Natl Acad Sci U S A. 116 (19), 9350-9359 (2019).
  39. Soranno, A., et al. Shelterin components modulate nucleic acids condensation and phase separation in the context of telomeric DNA. J Mol Biol. 434 (16), 167685 (2022).
  40. Wong, S. Y., et al. The shelterin component TRF2 mediates columnar stacking of human telomeric chromatin. EMBO J. 43 (1), 87-111 (2024).
  41. Li, X., et al. Dynamics of TRF1 organizing a single human telomere. Nucleic Acids Res. 49 (2), 760-775 (2021).
  42. You, H., Le, S., Chen, H., Qin, L., Yan, J. Single-molecule manipulation of g-quadruplexes by magnetic tweezers. J Vis Exp. (127), e56328 (2017).
  43. Lipfert, J., Lee, M., Ordu, O., Kerssemakers, J. W., Dekker, N. H. Magnetic tweezers for the measurement of twist and torque. J Vis Exp. (87), e51503 (2014).
  44. Ma, K., et al. A DNA force circuit for exploring protein-protein interactions at the single-molecule level. Chinese Journal of Chemistry. 42 (13), 1456-1464 (2024).
  45. . LB liquid medium. Cold Spring Harb Protoc. 2016 (9), (2016).
  46. . LB agar plates. Cold Spring Harb Protoc. 2024 (4), (2024).
  47. . HEPES buffer. Cold Spring Harb Protoc. 2010 (7), (2010).
  48. . SDS-PAGE gel. Cold Spring Harb Protoc. 2015 (7), (2015).
  49. . 10x PBS. Cold Spring Harb Protoc. 2007 (4), (2007).
  50. . TE buffer (1x). Cold Spring Harb Protoc. 2016 (5), (2016).
  51. Green, M. R., Sambrook, J. Buffers. Cold Spring Harb Protoc. 2018 (2), (2018).
  52. . Tris buffer (1 M, pH 7.5). Cold Spring Harbor Protocols. 2011 (2), (2011).
  53. . EDTA. Cold Spring Harbor Protocols. 2006 (1), (2006).
  54. Yu, Z., et al. A force calibration standard for magnetic tweezers. Rev Sci Instrum. 85 (12), 123114 (2014).
  55. Wang, Z., et al. Reading time and DNA sequence preference of TET3 CXXC domain revealed by single-molecule profiling. Chinese J Chem. 41 (10), 1177-1184 (2023).
  56. Kimura, M., et al. Measurement of telomere length by the southern blot analysis of terminal restriction fragment lengths. Nat Protoc. 5 (9), 1596-1607 (2010).
  57. Dulin, D., et al. High spatiotemporal-resolution magnetic tweezers: Calibration and applications for DNA dynamics. Biophys J. 109 (10), 2113-2125 (2015).
  58. Lipfert, J., Hao, X., Dekker, N. H. Quantitative modeling and optimization of magnetic tweezers. Biophys J. 96 (12), 5040-5049 (2009).
  59. Te Velthuis, A. J., Kerssemakers, J. W., Lipfert, J., Dekker, N. H. Quantitative guidelines for force calibration through spectral analysis of magnetic tweezers data. Biophys J. 99 (4), 1292-1302 (2010).
  60. Cnossen, J. P., Dulin, D., Dekker, N. H. An optimized software framework for real-time, high-throughput tracking of spherical beads. Rev Sci Instrum. 85 (10), 103712 (2014).
  61. Green, M. R., Sambrook, J. Cloning and transformation with plasmid vectors. Cold Spring Harb Protoc. 2021 (11), (2021).
  62. Haneskog, L. Purification of histidine-tagged proteins using stepwise elution with imidazole. Cold Spring Harb Protoc. 2006 (1), (2006).

転載および許可

このJoVE論文のテキスト又は図を再利用するための許可を申請します

許可を申請

さらに記事を探す

210

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

個人情報保護方針

利用規約

一般データ保護規則

お問い合わせ

図書館への推薦

JoVE ニュースレター

研究

教育

著者

図書館員

JoVEについて

Copyright © 2023 MyJoVE Corporation. All rights reserved