Анализ теломерных взаимодействий белка и ДНК с помощью одномолекулярного магнитного пинцета

Резюме

Этот протокол демонстрирует использование одномолекулярного магнитного пинцета для изучения взаимодействий между теломерными ДНК-связывающими белками (фактор повторного связывания теломер 1 [TRF1] и TRF2) и длинными теломерами, извлеченными из клеток человека. В нем описываются подготовительные этапы для теломер и теломерных факторов связывания повторов, проведение экспериментов с одиночными молекулами, а также методы сбора и анализа данных.

Аннотация

Теломеры, защитные структуры на концах хромосом, имеют решающее значение для поддержания клеточного долголетия и стабильности генома. Их правильное функционирование зависит от жестко регулируемых процессов репликации, удлинения и реакции на повреждения. Комплекс шелтерин, особенно фактор связывания повторов теломер 1 (TRF1) и TRF2, играет ключевую роль в защите теломер и стал потенциальной мишенью против рака для разработки лекарств. Эти белки связываются с повторяющимся теломерным мотивом ДНК TTAGGG, способствуя формированию защитных структур и привлечению других теломерных белков. Структурные методы и передовые методы визуализации позволили получить представление о теломерных взаимодействиях белка и ДНК, но для изучения динамических процессов требуются одномолекулярные подходы. Такие инструменты, как магнитный пинцет, оптический пинцет и атомно-силовая микроскопия (АСМ), были использованы для изучения теломерных взаимодействий белка и ДНК, выявив такие важные детали, как TRF2-зависимое искажение ДНК и теломеразный катализ. Тем не менее, получение одномолекулярных конструкций с теломерными повторяющимися мотивами продолжает оставаться сложной задачей, потенциально ограничивающей широту исследований с использованием одномолекулярных механических методов. Чтобы решить эту проблему, мы разработали метод изучения взаимодействий с использованием полноразмерной теломерной ДНК человека с помощью магнитного пинцета. В этом протоколе описывается, как экспрессировать и очищать TRF2, получать теломерную ДНК, проводить одномолекулярные механические анализы и анализировать данные. Это подробное руководство будет полезно исследователям в области биологии теломер и разработки лекарств, нацеленных на теломеры.

Введение

Теломеры являются защитными структурами на концах хромосом ^1,2,3. Эрозия теломер при делении клеток приводит к старению и старению клеток, в то время как аномальное удлинение теломер способствует развитию рака ^4,5. Для правильного функционирования теломер их репликация, удлинение и реакция на повреждение должны строго регулироваться ^6,7,8. Шелтерин, состоящий из шести субъединиц, играет центр....

протокол

1. Общие материалы и методы

1. Обратитесь к файлу «Таблица материалов » для получения информации о солях, химических веществах, антибиотиках, ферментах, антителах и смолах, используемых в этом протоколе.
2. Приготовьте жидкую среду Luria-Bertani (LB), агаровые пластины LB, буфер HEPES, электрофорез в полиакриламидном геле SDS (SDS-PAGE), фосфатно-солевой буфер (PBS), буфер Tris-EDTA (TE) в соответствии с рецептами из протоколов колд-спринг-харбора 45,46,47,48,49,50,51,52,53.

Результаты

На рисунке 1А показаны схематические домены и структуры TRF1 и TRF2, состоящие соответственно из 439 и 542 аминокислот, которые могут экспрессироваться в прокариотических клетках. Получение TRF1 ранее было описано в литературе⁴¹. Здесь мы приводим ?.......

Обсуждение

В этом протоколе используется магнитный пинцет для манипуляций с TRF на уровне одной молекулы 57,58,59. Мы используем магнитные шарики для отделения TRF от фрагментов геномной ДНК. После рестрикционного расщепления TRF связ?.......

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anti-Digoxigenin	Roche	11214667001
BfaI	New England Biolab (NEB)	R0568S
BSA	Sigma-Aldrich	V900933
CMOS camera	Mikrotron	MC1362
CviAII	New England Biolab (NEB)	R0640S
DIG-11-dUTP	Jena Bioscience	NU-803-DIGXL
DNA extraction solution	G-CLONE	EX0108
Dnase I, Rnase-Free, Hc Ea	Thermo Fisher Scientific	EN0523
dNTP mixture	Nanjing Vazyme Biotech Co., Ltd (Vazyme)	P032-02
DTT	Solarbio	D1070
Dynabeads M-270  beads	Thermo Fisher Scientific	65305	Streptavidin beads
Dynabeads MyOne beads	Thermo Fisher Scientific	65001	Streptavidin beads
Ethanol	Tianjin No.6 Chemical Reagent Factory	1083
Glycerol	Beijing Hwrkchemical Co,. Ltd	SMG66258-1
Imidazole	Solarbio	II0070
IPTG	Solarbio	I8070
Isopropanol	Tianjin No.6 Chemical Reagent Factory	A1079
Kanamycin	Thermo Fisher Scientific	EN0523
Klenow fragment (3′-5′ exo-)	New England Biolab (NEB)	M0212S
LabView	National Instruments	https://www.ni.com/en-us/shop/product/labview.html	Graphical programming software
LiCl	Bide Pharmatech Co., Ltd (bidepharm)	BD136449
Lysozyme	Solarbio	L8120-5
MseI	New England Biolab (NEB)	R0525S
NaCl	Shanghai Aladdin	C111533
NanoDrop	Thermo Fisher Scientific		Spectrophotometer
NdeI	New England Biolab (NEB)	R0111S
Ni NTA Beads 6FF	Changzhou Smart-Lifesciences Biotechnology Co.,Ltd	SA005025
Nitrocellulose membrane	ABclonal	RM02801
PMSF	Solarbio	P8340
Proteinase K	Beyotime Biotech Inc (beyotime)	ST535-500mg
rCutSmart Buffer	New England Biolab (NEB)	B6004S
Rnase A	Sigma-Aldrich	R4875
Sodium acetate	SERVA Electrophoresis GmbH	2124902
Sumo protease	Beyotime Biotech Inc (beyotime)	P2312M