АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Этот протокол демонстрирует использование одномолекулярного магнитного пинцета для изучения взаимодействий между теломерными ДНК-связывающими белками (фактор повторного связывания теломер 1 [TRF1] и TRF2) и длинными теломерами, извлеченными из клеток человека. В нем описываются подготовительные этапы для теломер и теломерных факторов связывания повторов, проведение экспериментов с одиночными молекулами, а также методы сбора и анализа данных.

Аннотация

Теломеры, защитные структуры на концах хромосом, имеют решающее значение для поддержания клеточного долголетия и стабильности генома. Их правильное функционирование зависит от жестко регулируемых процессов репликации, удлинения и реакции на повреждения. Комплекс шелтерин, особенно фактор связывания повторов теломер 1 (TRF1) и TRF2, играет ключевую роль в защите теломер и стал потенциальной мишенью против рака для разработки лекарств. Эти белки связываются с повторяющимся теломерным мотивом ДНК TTAGGG, способствуя формированию защитных структур и привлечению других теломерных белков. Структурные методы и передовые методы визуализации позволили получить представление о теломерных взаимодействиях белка и ДНК, но для изучения динамических процессов требуются одномолекулярные подходы. Такие инструменты, как магнитный пинцет, оптический пинцет и атомно-силовая микроскопия (АСМ), были использованы для изучения теломерных взаимодействий белка и ДНК, выявив такие важные детали, как TRF2-зависимое искажение ДНК и теломеразный катализ. Тем не менее, получение одномолекулярных конструкций с теломерными повторяющимися мотивами продолжает оставаться сложной задачей, потенциально ограничивающей широту исследований с использованием одномолекулярных механических методов. Чтобы решить эту проблему, мы разработали метод изучения взаимодействий с использованием полноразмерной теломерной ДНК человека с помощью магнитного пинцета. В этом протоколе описывается, как экспрессировать и очищать TRF2, получать теломерную ДНК, проводить одномолекулярные механические анализы и анализировать данные. Это подробное руководство будет полезно исследователям в области биологии теломер и разработки лекарств, нацеленных на теломеры.

Введение

Теломеры являются защитными структурами на концах хромосом 1,2,3. Эрозия теломер при делении клеток приводит к старению и старению клеток, в то время как аномальное удлинение теломер способствует развитию рака 4,5. Для правильного функционирования теломер их репликация, удлинение и реакция на повреждение должны строго регулироваться 6,7,8. Шелтерин, состоящий из шести субъединиц, играет центральную роль в защите теломер 9,10,11. Более глубокое понимание теломер даст ценную информацию о биологии теломер.

TRF1 и TRF2, основные субъединицы шелтерина, представляют собой теломерные связывающие белки 12,13. Как TRF1, так и TRF2 связываются с повторяющимся мотивом ДНК TTAGGG в теломерах через свои Myb-домены14. Они образуют димеры через свои общие домены TRFH, которые позволяют им окружать теломерную двухцепочечную ДНК и рекрутировать теломерные белки 15,16,17,18,19. TRF2 особенно важен для формирования теломерных D-петель и Т-петель20,21. Из-за их решающей роли в защите теломер, TRF1 и TRF2 стали потенциальными мишенями для противораковых препаратов 22,23,24,25.

Значительные усилия были предприняты для исследования белок-ДНК-взаимодействий в теломерах. Биохимические методы, такие как электрофоретический анализ сдвига подвижности (EMSA) и поверхностный плазмонный резонанс (SPR), были использованы для изучения сродства связывания20,26. С помощью криоэлектронной микроскопии (крио-ЭМ), рентгеновской кристаллографии и ядерного магнитного резонанса (ЯМР) были выяснены многочисленные структуры теломерных связывающих белков, интегрированных с ДНК27,28,29. Методы визуализации со сверхвысоким разрешением, такие как стохастическая оптическая реконструкционная микроскопия (STORM), выявили TRF2-зависимое образование Т-петли21. В последнее время было разработано нанопоровое секвенирование для профилирования теломерных последовательностей 4,30,31. Эти структурные открытия значительно улучшили наше понимание теломерных взаимодействий белка и ДНК. Для дальнейшего изучения динамики теломерных белково-ДНК-взаимодействий необходима разработка новых технологий.

Инструменты с использованием одной молекулы являются мощными методами для изучения взаимодействий белка и ДНК в теломерах 32,33,34. Одномолекулярные механические методы, такие как магнитный пинцет, оптический пинцет и АСМ, были использованы для исследования TRF2-зависимого искажения ДНК, выявления TRF2-опосредованного столбчатого стекирования теломерного хроматина человека и наблюдения за процессным теломеразным катализом, среди других применений 35,36,37,38,39,40. Эти методы особенно полезны для исследования топологических конформаций и кинетики ассоциации и диссоциации белок-ДНК.

Тем не менее, получение одномолекулярных конструкций с теломерными повторяющимися мотивами по-прежнему сопряжено с трудностями, что ограничивает исследования с использованием одномолекулярных механических методов. Чтобы устранить это ограничение, мы разработали одномолекулярный механический метод для изучения глобальных взаимодействий белка и ДНК на полноразмерных теломерах человека41. Этот метод напрямую извлекает теломерную ДНК из клеток человека, минуя трудоемкую подготовку искусственной теломерной ДНК. Это облегчает исследование кинетических процессов на длинных нативных теломерах, охватывающих несколько килооснований.

В этом протоколе мы подробно описываем этапы исследования теломерных взаимодействий белка и ДНК с помощью магнитного пинцета, популярного одномолекулярного механического инструмента 42,43,44. Мы демонстрируем, как экспрессировать и очищать теломерные белки на примере TRF2 и как получать теломерную ДНК из клеток человека. Кроме того, мы покажем, как настроить анализ одной молекулы на магнитном пинцете для изучения теломерных взаимодействий белка и ДНК, и рассмотрим последующий анализ данных экспериментов с одной молекулой. Этот протокол принесет пользу исследователям в области биологии теломер и разработки лекарств, нацеленных на теломеры.

протокол

1. Общие материалы и методы

  1. Обратитесь к файлу «Таблица материалов » для получения информации о солях, химических веществах, антибиотиках, ферментах, антителах и смолах, используемых в этом протоколе.
  2. Приготовьте жидкую среду Luria-Bertani (LB), агаровые пластины LB, буфер HEPES, электрофорез в полиакриламидном геле SDS (SDS-PAGE), фосфатно-солевой буфер (PBS), буфер Tris-EDTA (TE) в соответствии с рецептами из протоколов колд-спринг-харбора 45,46,47,48,49,50,51,52,53.
  3. Приобретайте вектор pET28a (Addgene), прокариотические и эукариотические клеточные линии (ATCC) из коммерческих источников. Затем непрерывно культивируют и проходят их в лаборатории.
  4. Для больших объемов жидкости автоклав при 120 °C в течение 20 минут. Для небольших объемов используйте стерильный фильтр с размером пор 0,22 мкм.
  5. Отрегулируйте pH растворов до желаемого уровня с помощью HCl или NaOH перед доведением их до конечных объемов.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Магнитные пинцеты изготавливаются по индивидуальному заказу и работают в среде LabVIEW 2017, в то время как анализ данных об отдельных молекулах выполняется в MATLAB 2017 2,54,55.
  6. В целях безопасности надевайте лабораторные халаты с длинными рукавами, нитриловые перчатки (или перчатки из материала, который является непроницаемым и устойчивым к этому веществу), защитные очки или защитные очки, а также обувь с закрытым носком.

2. Экспрессия белков и очистка теломерных ДНК-связывающих белков

  1. Выполнение культивирования клеток и индуцирование экспрессии белка.
    1. Вставьте кодирующую последовательность для теломерных ДНК-связывающих белков (рис. 1A), в данном случае TRF2 в качестве примера, в вектор pET28a путем ферментного расщепления и лигирования, используя SUMO в качестве фьюжн-метки. Вставьте между сайтами рестрикции BamHI и HindIII, получив плазмиду pET28a-SUMO-TRF2 (рис. 1B).
    2. Трансформируйте клетки BL21(DE3) с помощью плазмиды pET28a-SUMO-TRF2.
      1. Разморозьте на льду 50 мкл аликвоты компетентных клеток BL21(DE3).
      2. Добавьте 1 мкл ДНК плазмиды pET28a-SUMO-TRF2 (содержащей 50 нг ДНК) к компетентным клеткам. Аккуратно перемешайте, не делая пипетирования вверх и вниз.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Не делайте вихрей.
      3. Выдержать смесь на льду в течение 30 минут.
      4. В случае теплового шока смесь элементов нагревается при температуре 42 °C ровно 45 с на водяной бане. Немедленно верните клетки на лед на 2 минуты, чтобы стабилизировать трансформированные клетки.
      5. Добавьте в клетки 950 мкл среды LB комнатной температуры (RT) для ускорения восстановления.
      6. Трансформированные клетки инкубировать при 37 °C в течение 1 ч, встряхивая при 220 об/мин.
      7. Распределите 100 мкл смеси для трансформации на агаровой пластине LB, содержащей 50 мкг/мл канамицина (85,8 мкМ).
      8. Инкубируйте пластинчатые клетки в течение ночи при температуре 37 °C. После инкубации выберите отдельные колонии для использования в инокуляции заквасок.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Колонии на планшетах могут храниться при температуре 4 °C до 2 недель.
    3. Выберите колонию трансформированных клеток BL21(DE3) и культивируйте ее в 5 мл среды LB с добавлением 50 мкг/мл канамицина (85,8 мкМ). Выдерживать в течение 18 ч при 37 °C с встряхиванием при 220 об/мин.
    4. Для масштабирования перенесите 2 мл ночной культуры в 200 мл LB среды, содержащей 50 мкг/мл канамицина (85,8 мкМ). Продолжайте инкубацию при 37 °C с встряхиванием при 220 об/мин до тех пор, пока оптическая плотность на длине волны 600 нм (наружный диаметр 600) не достигнет 0,6-0,8.
    5. Возьмите 1 мл культуры в качестве неиндуцированного контрольного образца.
    6. Индуцировать оставшуюся культуру изопропил-β-d-1-тиогалактопиранизидом (IPTG) до конечной концентрации 1 мМ и инкубировать при 20 °C в течение 17 ч для стимуляции экспрессии белка.
    7. Выполните SDS-PAGE с использованием 5% стекирующего геля и 10% разделительного геля. Загрузите образцы в загрузочный буфер SDS-PAGE и запустите SDS-PAGE сначала при напряжении 100 В в течение 30 минут, а затем при напряжении 120 В в течение 50 минут в буфере с трисглицином. Окрасьте синим цветом Кумасси для визуализации экспрессии белка (см. рецепты в дополнительной таблице 1) (рисунок 1C).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Смотрите Обсуждение для устранения неполадок, если выражение лица не наблюдается.
  2. Очистите белок.
    1. Соберите клетки центрифугированием при 4 °C, 8500 x g в течение 10 минут. Выбросьте надосадочную жидкость и промойте гранулу в 200 мл PBS. Снова центрифугируйте, выбросьте надосадочную жидкость и повторно суспендируйте клеточную гранулу в 25 мл буфера для лизиса (20 мМ HEPES, 300 мМ NaCl, 20 мМ имидазола, 10% глицерина, 0,5 мМ DTT, 1 мМ фенилметилсульфонилфторида [PMSF]).
      ВНИМАНИЕ: PMSF является коррозионным и токсичным веществом, вызывает ожоги. Наденьте подходящую защитную одежду, перчатки и средства защиты глаз/лица.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Заморозьте до -80 °C, если не продолжите немедленно.
    2. Добавьте 5 мкл 100 мг/мл лизоцима, 5 мкл 1 ЕД/мкл ДНКазы I и 5 мкл 10 мг/мл РНКазы А к ресуспензионным клеткам.
    3. Выполните ультразвуковую обработку на льду с 1 с всплесками при 250 Вт, за которыми следует пауза 2 с, в общей сложности 30 минут.
    4. Центрифугируйте при 38 000 x g, 4 °C в течение 40 мин (допустимо 30-60 мин) и отфильтруйте надосадочную жидкость через шприцевой фильтр 0,22 мкм.
    5. Приготовьте 500 мл буфера, связывающего Ni-колонку, растворив 8,76 г NaCl (конечная концентрация 300 мМ) и 0,68 г имидазола (конечная концентрация 20 мМ) в 20 мМ HEPES (pH 8,0). Отфильтруйте раствор через фильтр 0,22 мкм.
      ВНИМАНИЕ: Имидазол опасен и может вызвать раздражение кожи и глаз. Это также может нанести вред будущему ребенку. Избегайте попадания в глаза, на кожу и в одежду. Не принимайте внутрь и не вдыхайте. Носите средства индивидуальной защиты, в том числе средства защиты лица.
    6. Приготовьте буферы для элюирования никелевой колонки (20 мМ HEPES (pH 8,0), 300 мМ NaCl) с возрастающими концентрациями имидазола (100 мМ, 200 мМ, 300 мМ и 500 мМ) для ступенчатого элюирования, обеспечивая надлежащую фильтрацию всех буферов.
    7. Загрузите отфильтрованную надосадочную жидкость в предварительно уравновешенную Ni-колонку в связывающем буфере (20 мМ HEPES (pH 8,0), 300 мМ NaCl, 20 мМ имидазол). Промойте связывающим буфером и разбавьте белок приготовленным имидазолом градиентом, собрав 12 фракций, каждая по 1 мл (рисунок 1С). Соедините фракции с чистотой >95%.
    8. Измерьте концентрацию элюированного гибридного белка 6xHis-сумо-TRF2 с помощью A280 с помощью спектрофотометра.
    9. Для белка, используемого в одномолекулярных анализах, добавьте протеазу сумо в соответствии с инструкциями производителя (обычно 0,125 ЕД протеазы на 2 мкг белка-сплава) и дайте перевариться в течение ночи при 4 °C.
    10. После обработки протеазой сумо загрузите смесь обратно в колонку Ni, чтобы связать любой непереваренный гибридный белок и сумо, помеченный His, позволяя белку TRF2 протекать через него. Соберите протекание.
  3. Определите концентрацию белка и сохраните белок.
    1. Сконцентрируйте очищенный белок TRF2 с помощью центробежного фильтра с температурой 30 кДа и замените его в буфер для хранения, содержащий 20 мМ HEPES (pH 8,0), 150 мМ NaCl, 0,5 мМ DTT, чтобы снизить концентрацию имидазола ниже 150 мМ.
    2. Повторяйте процесс концентрирования до тех пор, пока объем не уменьшится до менее чем 1 мл.
    3. Проанализируйте образцы с каждого этапа очистки с помощью SDS-PAGE, чтобы оценить чистоту и целостность белка (Рисунок 1C).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Аффинная хроматография используется для очистки белков, сбора и промывки элюированных образцов, а также проведения SDS-PAGE для оценки целостности белка и обеспечения контроля качества. Когда аффинная хроматография сама по себе не отвечает требованиям чистоты, для дальнейшего повышения чистоты белка используется эксклюзионная хроматография. Кривые поглощения УФ-излучения помогают оценить фракции элюирования, а SDS-PAGE проверяет целостность белка, обеспечивая строгий контроль качества на протяжении всего процесса.
    4. Добавьте глицерин до конечной концентрации 50% к концентрированному и буферному белку для хранения.
    5. Храните белок при температуре -80 °C.

3. Получение теломерных рестрикционных фрагментов человека

  1. Извлечение геномной ДНК.
    1. Следуя схеме (рис. 2А), центрифугируйте 1 x 107 клеток при давлении 1000 x g в течение 3 мин и выбросьте надосадочную жидкость. Для промывки повторно суспендируйте клетки в 200 мкл PBS, снова центрифугируйте при 1000 x g в течение 3 минут и выбросьте надосадочную жидкость.
    2. Добавьте 760 мкл буфера, содержащего 50 мМ Tris-HCl (pH 8,0), 100 мМ NaCl, 100 мМ ЭДТА и 1% SDS, в пробирку, содержащую 1 x 107 клеток, и осторожно ресуспендируйте пипетированием, чтобы избежать образования пузырьков воздуха.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Не делайте вихрей.
    3. Для расщепления белков и элиминации ДНКаз и РНКаз в образце добавляют протеиназу К до конечной концентрации 0,5 мг/мл, что соответствует 40 мкл исходного раствора с концентрацией 10 мг/мл. Постучите по дну пробирки для перемешивания (не завивайте).
    4. Инкубировать в течение ночи при 37 °C.
    5. Добавьте 265 мкл 5,4 М NaCl. Перемешивайте в течение 5 минут, переворачивая трубку пять раз в минуту, затем положите на лед на 20 минут.
    6. Центрифугируйте на максимальной скорости (например, 16 900 x g) в течение 10 минут при RT.
    7. Перенесите надосадочную жидкость в центрифужную пробирку и добавьте равный объем изопропанола (примерно 750 мкл), избегая плавающих липидов или осадка. ДНК находится в надосадочной жидкости.
    8. Переверните трубку пять раз, чтобы перемешать. Визуально подтвердить наличие гранулы ДНК в центрифужной пробирке.
    9. Центрифуга на RT на максимальной скорости в течение 10 мин.
    10. Выбросьте надосадочную жидкость. Промойте гранулу ДНК 500 μл 70% этанола, перевернув центрифужную трубку пять раз.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Гранула является ДНК.
    11. Центрифугируйте при RT на максимальной скорости (например, 16 900 x g) в течение 10 мин.
    12. Аккуратно удалите всю надосадочную жидкость, оставив гранулу ДНК. Дайте гранулам высохнуть на воздухе при температуре RT в течение 5 минут.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Избегайте пересушивания, так как геномную ДНК может быть трудно растворить.
    13. Ресуспендируйте гранулу ДНК в 475 мкл TE буфера (10 мМ Tris-HCl [pH 8,0], 1 мМ ЭДТА). Аккуратно перемешайте, постукивая по дну трубки. Для расщепления РНК во время подготовки ДНК добавьте 25 мкл 10 мг/мл РНКазы А (конечная концентрация 0,5 мг/мл) и перемешайте, осторожно постукивая до полного растворения гранулы ДНК.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Избегайте завихрения, чтобы предотвратить сдвиг ДНК.
    14. Инкубируйте образец ДНК при температуре 4 °C в течение ночи.
    15. Проведите равномерную по объему экстракцию трис-насыщенным фенолом: добавьте 500 μл фенола в центрифужную пробирку, аккуратно перемешайте пипеткой и центрифугируйте на максимальной скорости в течение 10 минут при 4 °C.
      ВНИМАНИЕ: Воздействие фенола может вызвать раздражение кожи, глаз, носа, горла и нервной системы. Избегайте попадания в глаза, на кожу и в одежду. Не принимайте внутрь и не вдыхайте. Носите средства индивидуальной защиты, в том числе средства защиты лица.
      ПРИМЕЧАНИЕ: ДНК находится в верхней водной фазе, белки — в межфазной, а органическая фаза — в нижней.
    16. Повторите три раза. Возьмем надосадочную жидкость ДНК (примерно 280 мкл).
    17. В зависимости от объема образца ДНК добавьте 1/10 объема (28 μл) 3 М ацетата натрия (конечная концентрация 0,3 М, pH 5,2) и 2 объема (616 μл) холодного 100% этанола. Поместите центрифужную пробирку при температуре -80 °C на 2-3 часа.
    18. Центрифуга на максимальной скорости (например, 16 900 x g) в течение 10 мин при 4 °C. Разморозьте раствор на льду, если он замерз, перед центрифугированием.
    19. Выбросьте надосадочную жидкость и промойте 3-4 раза с 70% этанолом, перевернув пробирку центрифуги. Центрифуга на максимальной скорости в течение 5 мин при 4 °C.
    20. Удалите этанол и дайте гранулам высохнуть на воздухе при RT в течение 5 минут.
    21. Добавьте 100 μL TE-буфера, постучите по пробирке для смешивания и дайте ему постоять при температуре 4 °C в течение 2 часов для полного растворения.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Исследуйте целостность геномной ДНК на 1% агарозном геле (Рисунок 2B).
    22. Храните ДНК при температуре -20 °C в морозильной камере. Он будет оставаться стабильным не менее 1 года.
  2. Выполнение геномного расщепления и модификации ДНК.
    1. Возьмите 4 г геномной ДНК и соедините его с 1 μL CviAII (10 U), 2 μL 10-кратного буфера для сбраживания (рецепты см. в Дополнительной таблице 1 ) и добавьте воды до достижения общего объема 20 μL. Инкубируйте смесь при 25 °C в течение 12 часов.
      ПРИМЕЧАНИЕ: FatI может заменить CviAII, который в настоящее время снят с производства NEB.
    2. Добавьте 1 μL NdeI (20 U), 1 μL MseI (10 U) и 1 μL BfaI (10 U) в ту же пробирку, содержащую предыдущую смесь (20 μL). Кроме того, добавьте 2 мкл 10-кратного буфера для сбраживания и 15 мкл воды, чтобы получить общий объем 40 мкл. Инкубируйте при 37 °C в течение 12 ч, затем нагрейте все ферменты при 80 °C в течение 20 мин.
      Примечание: Расщепление геномной ДНК может быть изучено с помощью метода терминального рестрикционного фрагмента (TRF) (Рисунок 2C). Комбинация четырех ферментов рестрикции (CviAII, NdeI, MseI и BfaI) расщепляет геномную ДНК на фрагменты размером около 800.о. и дает TRF с минимальным субтеломерным загрязнением ДНК.
    3. Для модификации дигоксигенина берут 40 мкл расщепленной геномной ДНК и добавляют 4 мкл 1 мМ dATP (конечная концентрация 0,08 мМ), 4 мкл 1 мМ дигоксигенина-11-dUTP (конечная концентрация 0,08 мМ), 1 мкл фрагмента Кленова (5 ед.), 0,5 мкл 100 мМ DTT (конечная концентрация 1 мМ) и 1 мкл 10-кратного буфера для разложения. Инкубировать при 37 °C в течение 12 часов, а затем нагревать до 75 °C в течение 20 минут для инактивации фрагмента Кленова.
    4. Для мечения биотина берут 12,5 мкл модифицированной дигоксигенином геномной ДНК (1 мкг) и добавляют 1 мкл 1 мкМ биотинилированного теломерного зонда (т.е. 1 пмоль), которые комплементарны теломерному одноцепочечному выступу. Добавьте 611,5 мкл буфера TE Li (10 мМ Tris-HCl (pH 8,0), 1 мМ ЭДТА, 50 мМ LiCl), чтобы разбавить 50 мМ ионов K до 1 мМ, получив общий объем 625 мкл, который можно разделить на 16 пробирок по 39 мкл каждая.
    5. Нагревайте до 75 °C в течение 3 минут в термоамплификаторе, затем снижайте температуру на 0,1 °C каждые 30 с до достижения 25 °C.
    6. Храните образцы ДНК при температуре -20 °C не менее года.

4. Настройка проточной ячейки для теломерного образца ДНК на магнитном пинцете

  1. Создание проточной ячейки для анализа на одну молекулу.
    1. С помощью электрошлифовальной машины просверлите отверстия в качестве входного и выходного отверстия на верхних покровных стеклах (покровное стекло #2 толщиной 0,2 мм).
    2. Очистите покровные стекла в моющем средстве на ультразвуке в течение 30 минут.
    3. Промойте чехлы сверхчистой водой 3 раза.
    4. Очистите покровные стекла в изопропаноле ультразвуком в течение 30 минут.
    5. Промойте покровные стекла ультрачистой водой 3 раза.
    6. Очистите покровные стекла в ультрачистом состоянии с помощью ультразвука в течение 15-30 минут.
    7. Просушите покровные стекла азотом.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Здесь протокол может быть остановлен, а очищенные защитные колпачки можно сохранить для последующего использования.
    8. Покройте нижние покровные стекла (без отверстий) 20 мкл 0,1% нитроцеллюлозы и добавьте эталонные шарики (20-кратное разведение, диаметр 3 мкм). Выпекать при 100 °C в течение 4 минут.
    9. С помощью скальпеля вырежьте двухслойные парапленочные распорки по металлической форме. Форма представляет собой прямоугольную деталь из алюминиевого сплава с теми же размерами, что и покровное стекло, с выдолбленным центром для облегчения резки канала.
    10. Соберите сэндвич с проточной ячейкой (Рисунок 3A). Нагрейте до 85 °C и массирующими движениями двумя тампонами до тех пор, пока парапленка не запечатает канал.
    11. Покройте проточную ячейку антителом. Введите 70 мкл антитела к дигоксигенину (0,1 мг/мл) непосредственно в проточную ячейку. Оставьте на RT на 1 час.
    12. Пассивируйте проточную ячейку. Введите 70 мкл 10 мг/мл BSA для вытеснения антитела к дигоксигенину. Оставьте на RT на 12 ч. Несвязанные антитела к дигоксигенину будут вымыты на следующих этапах с помощью тщательного промывки.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Храните проточную ячейку при температуре 4 °C в течение 1-2 недель.
    13. Тест на неспецифическое связывание путем промывки 5 мкл промытых гранул MyOne (10 мг/мл) (или 5 мкл промытых M270 (10 мг/мл)) гранул без ДНК в проточную ячейку. Оставьте на 10 минут, затем смойте шарики с помощью рабочего буфера (20 мМ HEPES (pH 7,5), 100 mM NaCl, 1 mM EDTA). Посчитайте количество бусин, прилипших к поверхности в одном поле зрения. На хорошо обработанной поверхности должно быть ноль или всего несколько бусин.
  2. Изолируйте и иммобилизуйте теломерные тросы ДНК в проточной ячейке.
    1. Возьмите 10 мкл гранул M270 (10 мг/мл) или 5 мкл 10 мг/мл MyOne и промойте их пять раз 50 мкл рабочего буфера (20 мМ HEPES [pH 7,5], 100 мМ NaCl, 1 мМ ЭДТА) с помощью магнита.
    2. Возьмите 500 нг переваренной геномной ДНК и поместите ее в центрифужную пробирку объемом 1,5 мл. Добавьте все шарики (50 μл) поверх образца ДНК.
    3. Не пипетируя, осторожно переверните пробирку центрифуги несколько раз, чтобы смешать шарики и образец ДНК. Оставьте смесь на льду на 1 час. Трижды промыть 500 мкл рабочего буфера с помощью магнита, чтобы потянуть шарики вниз, с интервалом 10 минут между стирками.
    4. Повторно суспендируйте образец с помощью 30 мкл рабочего буфера и загрузите смесь в проточную ячейку. Оставить на 30 минут. Смойте несвязанные магнитные шарики.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Теломерная ДНК связана между нижним покровным скольжением и магнитной бусиной посредством аффинных взаимодействий, опосредованных дигоксигенин-антителом и биотин-стрептавидином (рис. 3B).
  3. Настройка проточной ячейки на магнитном пинцете
    1. Очистите проточную ячейку 70% этанолом и высушите поверхность салфеткой для хрусталика. Поместите очищенную проточную ячейку на нижний держатель образцов и аккуратно соберите верхний штатив для образцов с помощью отвертки.
    2. Нанесите каплю масла для линз на нижнюю поверхность проточной ячейки, где она совпадает с линзой объектива. Затем поместите держатель образца на верхнюю часть объектива и закрепите его с помощью отвертки.
    3. Выберите пару кубических магнитов 5 мм, расположенных в вертикальной конфигурации. Совместите держатель магнита с осью X пути света магнитного пинцета для визуализации.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Это критически важный шаг. Направление магнитного поля выравнивается и, таким образом, определяется ориентацией магнитодержателя.
    4. Запустите программное обеспечение для графического программирования и подключите контроллеры для магнитного пинцета. Отрегулируйте поле зрения, чтобы найти эталонную бусину в нижней части проточной ячейки, и слегка отрегулируйте линзу объектива так, чтобы на эталонной бусине были видны четкие дифракционные кольца.
    5. Переместите магниты вниз к верхней части проточной ячейки.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Это критически важный шаг. Резкие изменения дифракционной картины шариков указывают на то, что магниты только что коснулись поверхности проточной ячейки. Это положение считается смещением для нулевой точки измерения.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Опускайте магниты осторожно, начиная с больших ступеней и постепенно переходя к более мелким ступеням. Двигайтесь с шагом 0,1 мм, чтобы не повредить проточную ячейку при приближении к проточной ячейке.
    6. Поднимите магниты в самое верхнее положение и снимите держатель магнита.
    7. Включите перистальтический насос, подключенный к бутылке для отходов, и слейте жидкость. Добавьте 100 μL рабочего буфера на вход и установите расход перистальтического насоса на 100 μL/мин, чтобы заполнить проточную ячейку буфером.

5. Измерение теломеры с помощью одномолекулярного магнитного пинцета

  1. Настройте камеру.
    1. Установите оттенки серого камеры на основе комплементарного металл-оксидного полупроводника (КМОП) с регулировкой яркости на 150 уровней.
    2. Определите размер области интереса (ROI).
    3. Установите частоту кадров на 200 Гц с временем экспозиции 5000 μс.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Это критически важный шаг. Убедитесь, что мертвое время затвора установлено на ноль.
    4. Переместите положение магнита на 3 см (примерно 8 пН) и отрегулируйте фокусировку объектива на бусинах.
  2. Установите таблицу подстановки (LUT).
    1. Переместите магниты в положение, соответствующее 8 пН, чтобы плотно растянуть магнитную бусину, привязанную к ДНК.
    2. Установите LUT на 200 шагов с шагом 0,05 μм.
    3. Используйте CMOS-камеру для захвата профилей магнитных шариков в разных положениях, чтобы установить таблицу LUT.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Это критически важный шаг. Полистирольные шарики, закрепленные в проточной ячейке, служат эталонными валиками для устранения смещения интересующих валиков.
  3. Спланируйте одномолекулярный механический эксперимент.
    1. Напишите скрипт в MATLAB для управления моторными движениями для анализа силового рампа или форсового прыжка.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Это критически важный шаг. Этот скрипт кодирует команды для движений магнита. Скорость нагружения задается на этом шаге для анализа нарастания силы. Здесь также определяются уровни и продолжительность анализов скачка силы (Рисунок 4, Дополнительный файл 1, Дополнительный файл 2 и Дополнительный файл 3).
    2. Импортируйте сценарий в графическое программное обеспечение для тестирования экспериментов с одной молекулой.
    3. Проверьте общее количество кадров, необходимых для проведения эксперимента с одной молекулой, и убедитесь, что доступная память превышает это требование.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Данные будут потеряны, если выделенная память будет меньше, чем требуется, потому что сохранение данных требует времени.
    4. Проверьте максимальную скорость визуализации, чтобы определить максимальное количество валиков, которые можно контролировать одновременно.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Эксперимент будет прекращен в случае превышения ограничения скорости визуализации.
    5. Используя в качестве примера анализ скачка силы, проведите механический эксперимент с одной молекулой. Силы резко прикладываются к магнитному шарику, который передает эти силы молекуле ДНК, немедленно растягивая ее вверх.

6. Измерения TRF1/2 на теломере с помощью магнитного пинцета

  1. Силовой рамповый анализ
    1. Используя TRF1 в качестве примера, загрузите 200 мкл 10 нМ TRF1 в проточную ячейку с низкой скоростью потока (например, 30 мкл/мин). Подождите 30 минут, чтобы TRF1 связался с теломерной ДНК.
    2. Выберите сценарий для эксперимента с нарастанием силы со скоростью нагружения ±1 пН/с.
    3. Присвойте файлам данных соответствующие имена и запустите эксперимент. Данные будут сохранены в указанном месте назначения для анализа (рисунок 5).
      Примечание: Во время этого эксперимента сила линейно увеличивается и уменьшается в диапазоне от 0 до 17 пН, что растягивает и расслабляет теломерную ДНК и разрывает петли ДНК, опосредованные TRF1/2.
  2. Проба Force Jump
    1. Выберите сценарий для запуска анализа прыжка с усилием.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для растяжения теломерной ДНК прикладываются различные силы, например, "Сила покоя" (Frest) при 0 пН в течение 40 с, "Испытательная сила" (Ftest) в диапазоне от 2-8 пН в течение 60 с, "Высокая сила" (Fhigh) при 10 пН в течение 30 с и "Максимальная сила" (Fmax) при 20 пН в течение 30 с.
    2. Присвойте файлам данных соответствующие имена и запустите эксперимент. Данные будут сохранены в указанном месте назначения для анализа (рисунок 5).

Результаты

На рисунке 1А показаны схематические домены и структуры TRF1 и TRF2, состоящие соответственно из 439 и 542 аминокислот, которые могут экспрессироваться в прокариотических клетках. Получение TRF1 ранее было описано в литературе41. Здесь мы приводим ?...

Обсуждение

В этом протоколе используется магнитный пинцет для манипуляций с TRF на уровне одной молекулы 57,58,59. Мы используем магнитные шарики для отделения TRF от фрагментов геномной ДНК. После рестрикционного расщепления TRF связ?...

Раскрытие информации

Авторы заявляют об отсутствии конкурирующих финансовых интересов или других конфликтов интересов.

Благодарности

Эта работа была поддержана Национальным фондом естественных наук Китая [грант 32071227 Z.Y.], Тяньцзиньским муниципальным фондом естественных наук Китая (22JCYBJC01070 to Z.Y.) и Государственной ключевой лабораторией точных измерительных технологий и инструментов (Тяньцзиньский университет) [Грант pilab2210 для Z.Y.].

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
Anti-DigoxigeninRoche11214667001
BfaINew England Biolab (NEB)R0568S
BSASigma-AldrichV900933
CMOS camera MikrotronMC1362
CviAIINew England Biolab (NEB)R0640S
DIG-11-dUTPJena BioscienceNU-803-DIGXL
DNA extraction solutionG-CLONEEX0108
Dnase I, Rnase-Free, Hc EaThermo Fisher ScientificEN0523
dNTP mixtureNanjing Vazyme Biotech Co., Ltd (Vazyme)P032-02
DTTSolarbioD1070
Dynabeads M-270  beadsThermo Fisher Scientific65305Streptavidin beads
Dynabeads MyOne beadsThermo Fisher Scientific65001Streptavidin beads
EthanolTianjin No.6 Chemical Reagent Factory1083
GlycerolBeijing Hwrkchemical Co,. LtdSMG66258-1
ImidazoleSolarbioII0070
IPTGSolarbioI8070
IsopropanolTianjin No.6 Chemical Reagent FactoryA1079
KanamycinThermo Fisher ScientificEN0523
Klenow fragment (3′-5′ exo-)New England Biolab (NEB)M0212S
LabViewNational Instrumentshttps://www.ni.com/en-us/shop/product/labview.htmlGraphical programming software 
LiClBide Pharmatech Co., Ltd (bidepharm)BD136449
LysozymeSolarbioL8120-5
MseINew England Biolab (NEB)R0525S
NaClShanghai AladdinC111533
NanoDropThermo Fisher ScientificSpectrophotometer
NdeINew England Biolab (NEB)R0111S
Ni NTA Beads 6FFChangzhou Smart-Lifesciences Biotechnology Co.,LtdSA005025
Nitrocellulose membraneABclonalRM02801
PMSFSolarbioP8340
Proteinase KBeyotime Biotech Inc (beyotime)ST535-500mg
rCutSmart BufferNew England Biolab (NEB)B6004S
Rnase ASigma-AldrichR4875
Sodium acetateSERVA Electrophoresis GmbH2124902
Sumo proteaseBeyotime Biotech Inc (beyotime)P2312M

Ссылки

  1. Blackburn, E. H., Epel, E. S., Lin, J. Human telomere biology: A contributory and interactive factor in aging, disease risks, and protection. Science. 350 (6265), 1193-1198 (2015).
  2. Li, N., et al. The dynamics of forming a triplex in an artificial telomere inferred by DNA mechanics. Nucleic Acids Res. 47 (15), e86 (2019).
  3. Yu, Z., et al. Click chemistry assisted single-molecule fingerprinting reveals a 3d biomolecular folding funnel. J Am Chem Soc. 134 (30), 12338-12341 (2012).
  4. Karimian, K., et al. Human telomere length is chromosome end-specific and conserved across individuals. Science. 384 (6695), 533-539 (2024).
  5. Maciejowski, J., De Lange, T. Telomeres in cancer: Tumour suppression and genome instability. Nat Rev Mol Cell Biol. 18 (3), 175-186 (2017).
  6. Kinzig, C. G., Zakusilo, G., Takai, K. K., Myler, L. R., De Lange, T. Atr blocks telomerase from converting DNA breaks into telomeres. Science. 383 (6684), 763-770 (2024).
  7. Takai, H., Aria, V., Borges, P., Yeeles, J. T. P., De Lange, T. Cst-polymerase α-primase solves a second telomere end-replication problem. Nature. 627 (8004), 664-670 (2024).
  8. De Lange, T. How telomeres solve the end-protection problem. Science. 326 (5955), 948-952 (2009).
  9. De Lange, T. Shelterin-mediated telomere protection. Annual Review of Genetics. 52 (1), 223-247 (2018).
  10. Liu, B., et al. Structure of active human telomerase with telomere shelterin protein TPP1. Nature. 604 (7906), 578-583 (2022).
  11. Sfeir, A., De Lange, T. Removal of shelterin reveals the telomere end-protection problem. Science. 336 (6081), 593-597 (2012).
  12. Sarek, G., et al. Cdk phosphorylation of trf2 controls t-loop dynamics during the cell cycle. Nature. 575 (7783), 523-527 (2019).
  13. Myler, L. R., et al. DNA-PK and the TRF2 IDDR inhibit MRN-initiated resection at leading-end telomeres. Nat Struct Mol Biol. 30 (9), 1346-1356 (2023).
  14. Hanaoka, S., Nagadoi, A., Nishimura, Y. Comparison between TRF2 and TRF1 of their telomeric DNA-bound structures and DNA-binding activities. Protein Sci. 14 (1), 119-130 (2005).
  15. Chen, Y., et al. A shared docking motif in TRF1 and TRF2 used for differential recruitment of telomeric proteins. Science. 319 (5866), 1092-1096 (2008).
  16. Wan, B., et al. SLX4 assembles a telomere maintenance toolkit by bridging multiple endonucleases with telomeres. Cell Reports. 4 (5), 861-869 (2013).
  17. Rai, R., et al. NBS1 phosphorylation status dictates repair choice of dysfunctional telomeres. Molecular Cell. 65 (5), 801-817.e4 (2017).
  18. Benarroch-Popivker, D., et al. Trf2-mediated control of telomere DNA topology as a mechanism for chromosome-end protection. Mol Cell. 61 (2), 274-286 (2016).
  19. Poulet, A., et al. The n-terminal domains of TRF1 and TRF2 regulate their ability to condense telomeric DNA. Nucleic Acids Res. 40 (6), 2566-2576 (2012).
  20. Schmutz, I., Timashev, L., Xie, W., Patel, D. J., De Lange, T. TRF2 binds branched DNA to safeguard telomere integrity. Nat Struct Mol Biol. 24 (9), 734-742 (2017).
  21. Doksani, Y., Wu, J. Y., De Lange, T., Zhuang, X. Super-resolution fluorescence imaging of telomeres reveals TRF2-dependent t-loop formation. Cell. 155 (2), 345-356 (2013).
  22. Di Maro, S., et al. Shading the TRF2 recruiting function: A new horizon in drug development. J Am Chem Soc. 136 (48), 16708-16711 (2014).
  23. Gao, J., Pickett, H. A. Targeting telomeres: Advances in telomere maintenance mechanism-specific cancer therapies. Nat Rev Cancer. 22 (9), 515-532 (2022).
  24. Bejarano, L., et al. Inhibition of TRF1 telomere protein impairs tumor initiation and progression in glioblastoma mouse models and patient-derived xenografts. Cancer Cell. 32 (5), 590-607.e4 (2017).
  25. Chen, X., et al. Cyclic peptidic mimetics of apollo peptides targeting telomeric repeat binding factor 2 (TRF2) and apollo interaction. ACS Med Chem Lett. 9 (5), 507-511 (2018).
  26. Erdel, F., et al. Telomere recognition and assembly mechanism of mammalian shelterin. Cell Rep. 18 (1), 41-53 (2017).
  27. Pendlebury, D. F., et al. Dissecting the telomere-inner nuclear membrane interface formed in meiosis. Nat Struct Mol Biol. 24 (12), 1064-1072 (2017).
  28. Court, R., Chapman, L., Fairall, L., Rhodes, D. How the human telomeric proteins trf1 and trf2 recognize telomeric DNA: A view from high-resolution crystal structures. EMBO Rep. 6 (1), 39-45 (2005).
  29. Hu, H., et al. Structural basis of telomeric nucleosome recognition by shelterin factor trf1. Sci Adv. 9 (34), eadi4148 (2023).
  30. Nurk, S., et al. The complete sequence of a human genome. Science. 376 (6588), 44-53 (2022).
  31. Rhie, A., et al. The complete sequence of a human y chromosome. Nature. 621 (7978), 344-354 (2023).
  32. Chang, T. R., Long, X., Shastry, S., Parks, J. W., Stone, M. D. Single-molecule mechanical analysis of strand invasion in human telomere DNA. Biochemistry. 61 (15), 1554-1560 (2022).
  33. Kaur, P., et al. TIN2 is an architectural protein that facilitates TRF2-mediated trans- and cis-interactions on telomeric DNA. Nucleic Acids Res. 49 (22), 13000-13018 (2021).
  34. Parks, J. W., Stone, M. D. Single-molecule studies of telomeres and telomerase. Annu Rev Biophys. 46, 357-377 (2017).
  35. Zhao, X., et al. Exploring TRF2-dependent DNA distortion through single-DNA manipulation studies. Commun Biol. 7 (1), 148 (2024).
  36. Patrick, E. M., Slivka, J. D., Payne, B., Comstock, M. J., Schmidt, J. C. Observation of processive telomerase catalysis using high-resolution optical tweezers. Nat Chem Biol. 16 (7), 801-809 (2020).
  37. Soman, A., et al. Columnar structure of human telomeric chromatin. Nature. 609 (7929), 1048-1055 (2022).
  38. Jansson, L. I., et al. Telomere DNA G-quadruplex folding within actively extending human telomerase. Proc Natl Acad Sci U S A. 116 (19), 9350-9359 (2019).
  39. Soranno, A., et al. Shelterin components modulate nucleic acids condensation and phase separation in the context of telomeric DNA. J Mol Biol. 434 (16), 167685 (2022).
  40. Wong, S. Y., et al. The shelterin component TRF2 mediates columnar stacking of human telomeric chromatin. EMBO J. 43 (1), 87-111 (2024).
  41. Li, X., et al. Dynamics of TRF1 organizing a single human telomere. Nucleic Acids Res. 49 (2), 760-775 (2021).
  42. You, H., Le, S., Chen, H., Qin, L., Yan, J. Single-molecule manipulation of g-quadruplexes by magnetic tweezers. J Vis Exp. (127), e56328 (2017).
  43. Lipfert, J., Lee, M., Ordu, O., Kerssemakers, J. W., Dekker, N. H. Magnetic tweezers for the measurement of twist and torque. J Vis Exp. (87), e51503 (2014).
  44. Ma, K., et al. A DNA force circuit for exploring protein-protein interactions at the single-molecule level. Chinese Journal of Chemistry. 42 (13), 1456-1464 (2024).
  45. . LB liquid medium. Cold Spring Harb Protoc. 2016 (9), (2016).
  46. . LB agar plates. Cold Spring Harb Protoc. 2024 (4), (2024).
  47. . HEPES buffer. Cold Spring Harb Protoc. 2010 (7), (2010).
  48. . SDS-PAGE gel. Cold Spring Harb Protoc. 2015 (7), (2015).
  49. . 10x PBS. Cold Spring Harb Protoc. 2007 (4), (2007).
  50. . TE buffer (1x). Cold Spring Harb Protoc. 2016 (5), (2016).
  51. Green, M. R., Sambrook, J. Buffers. Cold Spring Harb Protoc. 2018 (2), (2018).
  52. . Tris buffer (1 M, pH 7.5). Cold Spring Harbor Protocols. 2011 (2), (2011).
  53. . EDTA. Cold Spring Harbor Protocols. 2006 (1), (2006).
  54. Yu, Z., et al. A force calibration standard for magnetic tweezers. Rev Sci Instrum. 85 (12), 123114 (2014).
  55. Wang, Z., et al. Reading time and DNA sequence preference of TET3 CXXC domain revealed by single-molecule profiling. Chinese J Chem. 41 (10), 1177-1184 (2023).
  56. Kimura, M., et al. Measurement of telomere length by the southern blot analysis of terminal restriction fragment lengths. Nat Protoc. 5 (9), 1596-1607 (2010).
  57. Dulin, D., et al. High spatiotemporal-resolution magnetic tweezers: Calibration and applications for DNA dynamics. Biophys J. 109 (10), 2113-2125 (2015).
  58. Lipfert, J., Hao, X., Dekker, N. H. Quantitative modeling and optimization of magnetic tweezers. Biophys J. 96 (12), 5040-5049 (2009).
  59. Te Velthuis, A. J., Kerssemakers, J. W., Lipfert, J., Dekker, N. H. Quantitative guidelines for force calibration through spectral analysis of magnetic tweezers data. Biophys J. 99 (4), 1292-1302 (2010).
  60. Cnossen, J. P., Dulin, D., Dekker, N. H. An optimized software framework for real-time, high-throughput tracking of spherical beads. Rev Sci Instrum. 85 (10), 103712 (2014).
  61. Green, M. R., Sambrook, J. Cloning and transformation with plasmid vectors. Cold Spring Harb Protoc. 2021 (11), (2021).
  62. Haneskog, L. Purification of histidine-tagged proteins using stepwise elution with imidazole. Cold Spring Harb Protoc. 2006 (1), (2006).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

210

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены