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摘要

该协议演示了使用单分子磁镊研究端粒 DNA 结合蛋白（端粒重复结合因子 1 [TRF1] 和 TRF2）与从人类细胞中提取的长端粒之间的相互作用。它描述了端粒和端粒重复结合因子的准备步骤、单分子实验的执行以及数据收集和分析方法。

摘要

端粒是染色体末端的保护结构，对于维持细胞寿命和基因组稳定性至关重要。它们的正常功能取决于严格调节的复制、伸长和损伤反应过程。shelterin 复合物，尤其是端粒重复结合因子 1 （TRF1） 和 TRF2，在端粒保护中起着关键作用，并已成为药物发现的潜在抗癌靶点。这些蛋白与重复的端粒 DNA 基序 TTAGGG 结合，促进保护结构的形成和其他端粒蛋白的募集。结构方法和先进的成像技术为端粒蛋白质-DNA 相互作用提供了见解，但探测动态过程需要单分子方法。磁镊、光镊和原子力显微镜 （AFM） 等工具已被用于研究端粒蛋白-DNA 相互作用，揭示了 TRF2 依赖性 DNA 畸变和端粒酶催化等重要细节。然而，制备具有端粒重复基序的单分子构建体仍然是一项具有挑战性的任务，这可能会限制利用单分子机械方法的研究范围。为了解决这个问题，我们开发了一种使用全长人类端粒 DNA 与磁镊研究相互作用的方法。该协议描述了如何表达和纯化 TRF2、制备端粒 DNA、设置单分子机械测定以及分析数据。这份详细的指南将使端粒生物学和端粒靶向药物发现的研究人员受益。

引言

端粒是染色体末端的保护性结构 1,2,3。细胞分裂过程中的端粒侵蚀会导致细胞衰老和衰老，而端粒的异常伸长会导致癌症 4,5。为了使端粒正常运作，它们的复制、伸长和损伤反应必须受到高度调节 6,7,8。Shelterin 由 6 个亚基组成，在端粒保护中起着核心作用 9,10,11。对端粒的更深入理解将为端粒生物学提供有价值的见解。

TRF1 和 TRF2 是 shelterin 的核心亚基，是端粒结合蛋白12,13。TRF1 和 TRF2 都通过其 Myb 结构域与端粒中的重复 DNA 基序 TTAGGG 结合14。它们通过共享的 TRFH 结构域形成二聚体，这使它们能够包围端粒双链 DNA 并募集端粒蛋白 15,16,17,18,19。TRF2 对于端粒 D 环和 T 环的形成特别重要20,21。由于它们在端粒保护中起着关键作用，TRF1 和 TRF2 已成为潜在的抗癌药物靶点 22,23,24,25。

已经为研究端粒处的蛋白质-DNA 相互作用做出了重大努力。电泳迁移率变化测定 （EMSA） 和表面等离子体共振 （SPR） 等生化方法已被用于检查结合亲和力20,26。使用冷冻电子显微镜 （cryo-EM）、X 射线晶体学和核磁共振 （NMR） 阐明了与 DNA 复合的端粒结合蛋白的许多结构27,28,29。随机光学重建显微镜 （STORM） 等超分辨率成像技术揭示了 TRF2 依赖性 T 环形成21。最近，已经开发了纳米孔测序来分析端粒序列 4,30,31。这些结构见解极大地增强了我们对端粒蛋白质-DNA 相互作用的理解。为了进一步探索端粒蛋白质-DNA 相互作用的动力学，新技术的开发至关重要。

单分子工具是探索端粒32、33、34 处蛋白质-DNA 相互作用的强大技术。单分子力学方法，如磁镊、光镊和 AFM，已被用于研究 TRF2 依赖性 DNA 畸变，揭示 TRF2 介导的人端粒染色质柱状堆积，并观察端粒酶催化进行过程中的催化，以及其他应用 35,36,37,38,39,40.这些方法对于探测拓扑构象以及蛋白质-DNA 结合和解离的动力学特别有用。

然而，制备具有端粒重复基序的单分子构建体仍然存在挑战，这限制了使用单分子力学方法的研究。为了解决这一限制，我们开发了一种单分子机械方法来研究全长人类端粒上的整体蛋白质-DNA 相互作用41。该方法直接从人类细胞中提取端粒 DNA，避免了人工端粒 DNA 的费力制备。它有助于研究跨越几千碱基的长天然端粒上的动力学过程。

在该协议中，我们详细描述了使用磁镊（一种流行的单分子机械工具）探测端粒蛋白-DNA 相互作用的步骤 42,43,44。我们以 TRF2 为例，演示如何表达和纯化端粒蛋白，以及如何从人类细胞中制备端粒 DNA。此外，我们展示了如何在磁镊上设置单分子测定以研究端粒蛋白质-DNA 相互作用，并介绍了单分子实验的后续数据分析。该协议将使端粒生物学和端粒靶向药物发现领域的研究人员受益。

研究方案

1. 一般材料和方法

  1. 有关本协议中使用的盐、化学品、抗生素、酶、抗体和树脂材料，请参阅 材料表 文件。
  2. 根据冷泉港方案45、46、47、48、49、50、51、52、53 的配方制备 Luria-Bertani （LB） 液体培养基、LB 琼脂平板、HEPES 缓冲液、SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳 （SDS-PAGE）、磷酸盐缓冲盐水 （PBS）、Tris-EDTA （TE） 缓冲液。
  3. 通过商业来源获取 pET28a 载体 （Addgene）、原核细胞系和真核细胞系 （ATCC）。然后，在实验室中不断培养和传代它们。
  4. 对于大量液体，在 120 °C 下高压灭菌 20 分钟。对于小体积，请使用孔径为 0.22 μm 的无菌过滤器。
  5. 在使溶液达到最终体积之前，使用 HCl 或 NaOH 将溶液的 pH 值调节至所需水平。
    注意:磁镊是定制的，并在 LabVIEW 2017 环境中运行，而单分子数据分析在 MATLAB 2017 2,54,55 中执行。
  6. 出于安全原因，请穿长袖实验室外套、丁腈手套（或由不透水和耐物质材料制成的手套）、安全眼镜或护目镜和露趾鞋。

2. 端粒 DNA 结合蛋白的蛋白表达和纯化

  1. 进行细胞培养并诱导蛋白质表达。
    1. 通过酶消化和连接将端粒 DNA 结合蛋白的编码序列（图 1A），在本例中为 TRF2 插入 pET28a 载体中，使用 SUMO 作为融合标签。在 BamHI 和 HindIII 的限制性位点之间插入，产生 pET28a-SUMO-TRF2 的质粒（图 1B）。
    2. 用 pET28a-SUMO-TRF2 质粒转化 BL21 （DE3） 细胞。
      1. 在冰上解冻 50 μL 等分试样的感受态 BL21 （DE3） 细胞。
      2. 向感受态细胞中加入 1 μL pET28a-SUMO-TRF2 质粒（含有 50 ng DNA）的 DNA。轻轻旋转以混合，无需上下移液。
        注意:请勿涡旋。
      3. 将混合物在冰上孵育 30 分钟。
      4. 对于热休克，在水浴中将细胞混合物在 42 °C 下加热正好 45 秒。立即将细胞放回冰中 2 分钟以稳定转化的细胞。
      5. 向细胞中加入 950 μL 室温 （RT） LB 培养基以促进回收。
      6. 将转化的细胞在 37 °C 下孵育 1 小时，同时以 220 rpm 摇动。
      7. 将 100 μL 转化混合物涂布在含有 50 μg/mL 卡那霉素 （85.8 μM） 的 LB 琼脂平板上。
      8. 将铺板的细胞在 37 °C 下孵育过夜。 孵育后，选择不同的菌落用于发酵剂培养物的接种。
        注意:平板上的菌落可在 4 °C 下储存长达 2 周。
    3. 拾取转化的 BL21 （DE3） 细胞的集落，并在 5 mL 补充有 50 μg/mL 卡那霉素 （85.8 μM） 的 LB 培养基中培养。在 37 °C 下孵育 18 小时，以 220 rpm 振荡。
    4. 要扩大规模，将 2 mL 过夜培养物转移到 200 mL 含有 50 μg/mL 卡那霉素 （85.8 μM） 的 LB 培养基中。继续在 37 °C 下孵育，以 220 rpm 振荡，直到 600 nm 处的光密度 （OD 600） 达到 0.6-0.8。
    5. 取 1 mL 培养物作为未诱导的对照样品。
    6. 用异丙基 β-d-1-硫代吡喃半乳糖苷 （IPTG） 诱导剩余的培养物至终浓度为 1 mM，并在 20 °C 下孵育 17 小时以促进蛋白质表达。
    7. 使用 5% 浓缩胶和 10% 分离胶进行 SDS-PAGE。用 SDS-PAGE 上样缓冲液加载样品，最初在 100 V 下运行 SDS-PAGE 30 分钟，然后在 Tris-甘氨酸缓冲液中以 120 V 运行 50 分钟。用考马斯蓝染色以可视化蛋白质表达（参见 补充表 1 中的食谱）（图 1C）。
      注意:如果未观察到表达式，请参阅讨论以进行故障排除。
  2. 纯化蛋白质。
    1. 通过在 4 °C、8500 x g 下离心 10 分钟来收获细胞。弃去上清液，用 200 mL PBS 洗涤沉淀。再次离心，弃去上清液，并将细胞沉淀重悬于 25 mL 裂解缓冲液（20 mM HEPES、300 mM NaCl、20 mM 咪唑、10% 甘油、0.5 mM DTT、1 mM 苯甲基磺酰氟 [PMSF]）中。
      注意:PMSF 具有腐蚀性和毒性，可引起灼伤。穿戴合适的防护服、手套和眼睛/面部防护装置。
      注意:如果不立即进行，请在 -80 °C 下冷冻。
    2. 向重悬细胞中加入 5 μL 100 mg/mL 溶菌酶、5 μL 1 U/μL DNase I 和 5 μL 10 mg/mL RNase A。
    3. 在冰上进行超声处理，以 250 W 的功率爆发 1 秒，然后暂停 2 秒，总共 30 分钟。
    4. 以 38,000 x g 离心，4 °C 40 分钟（30-60 分钟是可以接受的），并通过 0.22 μm 注射器过滤器过滤上清液。
    5. 通过将 8.76 g NaCl（终浓度 300 mM）和 0.68 g 咪唑（终浓度 20 mM）溶解在 20 mM HEPES（pH 8.0）中，制备 500 mL 镍柱结合缓冲液。通过 0.22 μm 过滤器过滤溶液。
      注意:咪唑很危险，会引起皮肤和眼睛刺激。它还可能伤害未出生的孩子。避免接触眼睛、皮肤和衣服。请勿吞食或吸入。穿戴个人防护装备，包括面部防护装置。
    6. 制备镍柱洗脱缓冲液（20 mM HEPES （pH 8.0），300 mM NaCl），并增加咪唑浓度（100 mM、200 mM、300 mM 和 500 mM）进行逐步洗脱，确保所有缓冲液都经过适当过滤。
    7. 将过滤后的上清液加载到结合缓冲液（20 mM HEPES （pH 8.0）、300 mM NaCl、20 mM 咪唑）中的预平衡 Ni 柱上。用结合缓冲液洗涤，用制备好的咪唑梯度洗脱蛋白质，收集 12 个级分，每个级分 1 mL（图 1C）。合并纯度为 >95% 的馏分。
    8. 在分光光度计中通过 A280 测量洗脱的 6xHis-sumo-TRF2 融合蛋白的浓度。
    9. 对于单分子测定中使用的蛋白质，根据制造商的说明添加相扑蛋白酶（通常每 2 μg 融合蛋白 0.125 U 蛋白酶），并在 4 °C 下过夜消化。
    10. Sumo 蛋白酶处理后，将混合物装回 Ni 柱上，以结合任何未消化的融合蛋白和 His 标记的 sumo，使无标签的 TRF2 蛋白流过。收集流出。
  3. 测定蛋白质浓度并储存蛋白质。
    1. 使用 30 kDa 截止离心过滤装置浓缩纯化的 TRF2 蛋白，并将其更换到含有 20 mM HEPES （pH 8.0）、150 mM NaCl、0.5 mM DTT 的储存缓冲液中，以将咪唑浓度降低到 150 mM 以下。
    2. 重复浓缩过程，直到体积减少到 1 mL 以下。
    3. 通过 SDS-PAGE 分析每个纯化步骤的样品，以评估蛋白质的纯度和完整性（图 1C）。
      注:亲和层析用于纯化蛋白质，收集和洗涤洗脱的样品，并进行 SDS-PAGE 以评估蛋白质完整性并确保质量控制。当单独的亲和层析不能满足纯度要求时，采用体积排阻层析来进一步提高蛋白质纯度。UV 吸光度曲线有助于评估洗脱馏分，SDS-PAGE 验证蛋白质完整性，确保整个过程的严格质量控制。
    4. 将甘油加入终浓度为 50% 的浓缩和缓冲液交换蛋白中进行储存。
    5. 将蛋白质储存在 -80 °C。

3. 人端粒限制性片段的制备

  1. 提取基因组 DNA。
    1. 按照流程图（图 2A），以 1000 x g 离心 1 x 107 个细胞 3 分钟，并弃去上清液。洗涤时，将细胞重悬于 200 μL PBS 中，再次以 1000 x g 离心 3 分钟，然后弃去上清液。
    2. 将 760 μL 含有 50 mM Tris-HCl （pH 8.0）、100 mM NaCl、100 mM EDTA 和 1% SDS 的缓冲液添加到含有 1 x 107 个细胞的试管中，并通过移液轻轻重悬以避免气泡。
      注意:请勿涡旋。
    3. 为了消化蛋白质并消除样品中的 DNase 和 RNase，添加蛋白酶 K 至终浓度为 0.5 mg/mL，相当于 40 μL 的 10 mg/mL 储备液。轻敲试管底部进行混合（不要涡旋）。
    4. 在 37 °C 下孵育过夜。
    5. 加入 265 μL 的 5.4 M NaCl。每分钟倒置试管 5 次，混合 5 分钟，然后置于冰上 20 分钟。
    6. 在 RT 下以最大速度（例如，16,900 x g）离心 10 分钟。
    7. 将上清液转移至离心管中，加入等体积的异丙醇（约 750 μL），避免脂质或沉淀物漂浮。DNA 在上清液中。
    8. 将试管倒置五次以混合。目视确认离心管中是否存在沉淀的 DNA 沉淀。
    9. 在 RT 下以最大速度离心 10 分钟。
    10. 丢弃上清液。将离心管倒置 5 次，用 500 μL 70% 乙醇洗涤 DNA 沉淀。
      注意:沉淀是 DNA。
    11. 在 RT 下以最大速度（例如，16,900 x g ）离心 10 分钟。
    12. 小心去除所有上清液，留下 DNA 沉淀。让沉淀在 RT 下风干 5 分钟。
      注:避免过度干燥，因为基因组 DNA 可能变得难以溶解。
    13. 将 DNA 沉淀重悬于 475 μL TE 缓冲液（10 mM Tris-HCl [pH 8.0]，1 mM EDTA）中。轻敲试管底部轻轻混合。为了在 DNA 制备过程中消化 RNA，加入 25 μL 10 mg/mL RNase A（终浓度 0.5 mg/mL），轻轻敲击混匀，直到 DNA 沉淀完全溶解。
      注:避免涡旋以防止 DNA 剪切。
    14. 将 DNA 样品在 4 °C 下孵育过夜。
    15. 进行等体积的 Tris 饱和苯酚提取:向离心管中加入 500 μL 苯酚，用移液管轻轻混合，然后在 4 °C 下以最大速度离心 10 分钟。
      注意: 接触苯酚可能会刺激皮肤、眼睛、鼻子、喉咙和神经系统。避免接触眼睛、皮肤和衣服。请勿吞食或吸入。穿戴个人防护装备，包括面部防护装置。
      注:DNA 位于上层水相，蛋白质位于间相，有机相位于底部。
    16. 重复 3 次。取 DNA 上清液（约 280 μL）。
    17. 根据 DNA 样品的体积，加入 1/10 体积 （28 μL） 的 3 M 乙酸钠（终浓度 0.3 M，pH 值 5.2）和 2 体积 （616 μL） 的 100% 冷乙醇。将离心管置于-80°C下2-3小时。
    18. 在 4 °C 下以最大速度（例如，16,900 x g ）离心 10 分钟。 如果离心前冷冻，请在冰上解冻溶液。
    19. 弃去上清液，倒置离心管，用 70% 乙醇洗涤 3-4 次。在 4 °C 下以最大速度离心 5 分钟。
    20. 取出乙醇，让沉淀在 RT 下风干 5 分钟。
    21. 加入 100 μL 的 TE 缓冲液，轻敲试管混合，并在 4 °C 下静置 2 小时以完全溶解。
      注:检查 1% 琼脂糖凝胶上基因组 DNA 的完整性（图 2B）。
    22. 将 DNA 储存在 -20 °C 的冰箱中。它将保持稳定至少 1 年。
  2. 进行基因组 DNA 消化和修饰。
    1. 取 4 μg 基因组 DNA，与 1 μL CviAII （10 U）、2 μL 10x 消化缓冲液混合（配方见 补充表 1 ），加水达到 20 μL 的总体积。将混合物在 25 °C 孵育 12 小时。
      注意:FatI 可以替代 CviAII，后者现已被 NEB 停产。
    2. 将 1 μL NdeI （20 U）、1 μL MseI （10 U） 和 1 μL BfaI （10 U） 添加到含有先前混合物 （20 μL） 的同一管中。此外，加入 2 μL 的 10x 消化缓冲液和 15 μL 的水，以达到 40 μL 的总体积。在 37 °C 下孵育 12 小时，然后在 80 °C 下热灭活所有酶 20 分钟。
      注:可以使用末端限制性片段 （TRF） 方法检查基因组 DNA 的消化（图 2C）。四种限制性内切酶（CviAII、NdeI、MseI 和 BfaI）的组合将基因组 DNA 消化成约 800 bp 的片段，并产生亚端粒 DNA 污染最小的 TRF。
    3. 对于地高辛修饰，取 40 μL 消化的基因组 DNA，加入 4 μL 1 mM dATP（终浓度 0.08 mM）、4 μL 1 mM 地高辛-11-dUTP（终浓度 0.08 mM）、1 μL Klenow 片段 （5 U）、0.5 μL 100 mM DTT（终浓度 1 mM）和 1 μL 10x 消化缓冲液。在 37 °C 下孵育 12 小时，然后在 75 °C 下加热 20 分钟以灭活 Klenow 片段。
    4. 对于生物素标记，取 12.5 μL 地高辛修饰的基因组 DNA （1 μg） 并添加 1 μL 1 μM 生物素化端粒探针（即 1 pmol），这些探针与端粒单链突出端互补。加入 611.5 μL TE Li 缓冲液（10 mM Tris-HCl （pH 8.0）、1 mM EDTA、50 mM LiCl），将 50 mM K 离子稀释至 1 mM，使总体积为 625 μL，可分为 16 个试管，每个试管 39 μL。
    5. 在热循环仪中在 75 °C 下加热 3 分钟，然后每 30 秒将温度降低 0.1 °C，直到达到 25 °C。
    6. 将 DNA 样品在 -20 °C 下储存至少一年。

4. 在磁镊上为端粒 DNA 样品设置流通池

  1. 制作用于单分子检测的流通池。
    1. 使用电动研磨机在顶部盖玻片（厚度为 0.2 mm 的 #2 盖玻片）上钻孔作为入口和出口。
    2. 通过超声处理在去污剂中清洁盖玻片 30 分钟。
    3. 用超纯水清洗盖玻片 3 次。
    4. 通过超声处理在异丙醇中清洁盖玻片 30 分钟。
    5. 用超纯水清洗盖玻片 3 次。
    6. 通过超声处理清洁超纯盖玻片 15-30 分钟。
    7. 用氮气干燥盖玻片。
      注意:该方案可以在此处停止，清洁后的盖玻片可以储存以备后用。
    8. 用 20 μL 0.1% 硝酸纤维素包被底部盖玻片（无孔），并添加参比珠（20 倍稀释，直径 3 μm）。在 100 °C 下烘烤 4 分钟。
    9. 使用手术刀根据金属模具切割双层封口膜垫片。模具是矩形铝合金件，尺寸与盖玻片相同，具有镂空中心，便于通道切割。
    10. 组装流通池三明治（图 3A）。在 85 °C 下加热，用两根棉签按摩，直到封口膜密封通道。
    11. 用抗体包被流动池。将 70 μL 抗地高辛抗体 （0.1 mg/mL） 直接注入流通池。在 RT 下放置 1 小时。
    12. 钝化流通池。注射 70 μL 10 mg/mL BSA 以取代抗地高辛抗体。在 RT 放置 12 小时。未结合的抗地高辛抗体将按照以下步骤通过严格冲洗冲走。
      注:将流通池在 4 °C 下储存 1-2 周。
    13. 将 5 μL 不含 DNA 的洗涤 MyOne （10 mg/mL）（或 5 μL 洗涤的 M270 （10 mg/mL））珠子冲入流动槽中，检测非特异性结合。放置 10 分钟，然后使用工作缓冲液（20 mM HEPES （pH 7.5）、100 mM NaCl、1 mM EDTA）冲洗珠子。计算一个视野中粘附在表面上的珠子数量。处理良好的表面应显示零或仅显示少量珠子。
  2. 在流通池中分离并固定端粒 DNA 系绳。
    1. 取 10 μL M270 珠子 （10 mg/mL） 或 5 μL 10 mg/mL MyOne，用 50 μL 工作缓冲液（20 mM HEPES [pH 7.5]、100 mM NaCl、1 mM EDTA）使用磁铁洗涤五次。
    2. 取 500 ng 消化的基因组 DNA，并将其放入 1.5 mL 离心管中。将所有磁珠 （50 μL） 添加到 DNA 样品的顶部。
    3. 无需移液，轻轻轻弹离心管几次，以混合磁珠和 DNA 样品。将混合物在冰上放置 1 小时。用 500 μL 工作缓冲液洗涤 3 次，使用磁铁将磁珠向下拉，两次洗涤之间间隔 10 分钟。
    4. 使用 30 μL 工作缓冲液重悬样品，并将混合物上样到流通池中。静置 30 分钟。冲洗未结合的磁珠。
      注:端粒 DNA 通过地高辛-抗体和生物素-链霉亲和素介导的亲和相互作用拴在底盖玻片和磁珠之间（图 3B）。
  3. 在磁镊上设置流通池
    1. 用 70% 乙醇清洁流通池，并使用镜头纸干燥表面。将清洁后的流通池放在下部样品架上，然后用螺丝刀轻轻组装上部样品架。
    2. 将一滴透镜油滴在流通池的底面上，使其与物镜对齐。然后，将样品架放在物镜顶部并使用螺丝刀固定。
    3. 选择一对垂直配置的 5 mm 立方体磁体。将磁铁支架与磁镊光路的 X 轴对齐以进行成像。
      注意:这是一个关键步骤。磁场的方向是对齐的，因此由磁体支架的方向决定。
    4. 启动图形编程软件并连接磁镊的控制器。调整视野以将参比微球定位在流通池底部，并略微调整物镜，使参比微球显示清晰的衍射环。
    5. 将磁体向下移动到流通池的顶部。
      注意:这是一个关键步骤。磁珠衍射图谱的突然变化表明磁体刚刚接触流通池的表面。此位置被视为测量零点的偏移量。
      注意: 小心地降低磁铁，从较大的步骤开始，然后逐渐转移到较小的步骤。以 0.1 mm 的增量移动，以避免在接近流通池时损坏流通池。
    6. 将磁铁升至最高位置并取下磁铁支架。
    7. 打开连接到废液瓶的蠕动泵，丢弃液体。向进样口添加 100 μL 工作缓冲液，并将蠕动泵流速设置为 100 μL/min，以向流通池填充缓冲液。

5. 使用单分子磁镊测量端粒

  1. 设置相机。
    1. 将互补金属氧化物半导体 （CMOS） 相机的灰度设置为亮度调节 150 级。
    2. 定义感兴趣区域 （ROI） 的大小。
    3. 设置帧率为 200 Hz，曝光时间为 5000 μs。
      注意:这是一个关键步骤。确保快门死时间设置为零。
    4. 将磁体位置移至 3 cm（约 8 pN）并调整珠子上的物镜焦点。
  2. 建立查找表 （LUT）。
    1. 将磁体移动到对应于 8 pN 的位置，以紧紧拉伸 DNA 栓系磁珠。
    2. 将 LUT 设置为 200 步，步长为 0.05 μm。
    3. 使用 CMOS 相机捕获不同位置的磁珠轮廓以建立 LUT。
      注意:这是一个关键步骤。固定在流通池中的聚苯乙烯微珠用作参比微珠，以消除目标微珠的漂移。
  3. 设计一个单分子力学实验。
    1. 在 MATLAB 中编写脚本来控制力斜坡或力跳跃分析的运动。
      注意:这是一个关键步骤。此脚本对磁体移动的命令进行编码。在此步骤中设置力加载率以进行力斜坡测定。这里还确定了力跳跃测定的水平和持续时间（图 4、 补充文件 1、补充文件 2 和 补充文件 3）。
    2. 将脚本导入图形编程软件以测试单分子实验。
    3. 检查运行单分子实验所需的总帧数，并确保可用内存超过此要求。
      注意:如果分配的内存小于所需内存，则数据将丢失，因为保存数据需要时间。
    4. 验证最大成像速度，以确定可以同时监测的最大微珠数量。
      注意:如果超过成像速度限制，实验将终止。
    5. 以力跳跃测定为例，运行单分子力学实验。突然对磁珠施加力，磁珠将这些力传递到 DNA 分子，立即将其向上拉伸。

6. 使用磁镊测量端粒上的 TRF1/2

  1. Force ramp 测定
    1. 以 TRF1 为例，以低流速（例如 30 μL/min）将 200 μL 10 nM TRF1 加载到流通池中。让 TRF1 与端粒 DNA 结合 30 分钟。
    2. 为力加载速率为 ±1 pN/s 的力斜坡实验选择脚本。
    3. 适当地命名数据文件并运行实验。数据将被保存到指定的目的地进行分析（图 5）。
      注:在本实验中，力在 0 pN 和 17 pN 之间线性增加和减少，这会拉伸和松弛端粒 DNA 并打破由 TRF1/2 介导的 DNA 环。
  2. Force Jump 检测
    1. 选择脚本以运行力跳跃分析。
      注:施加各种力来拉伸端粒 DNA，例如，0 pN 的"静止力"（Frest）持续 40 秒，"测试力"（Ftest）范围为 2-8 pN，持续 60 秒，10 pN 的"高力"（Fhigh）持续 30 秒，以及 20 pN 的"最大力"（Fmax）持续 30 秒。
    2. 适当地命名数据文件并运行实验。数据将被保存到指定的目的地进行分析（图 5）。

结果

图 1A 说明了 TRF1 和 TRF2 的示意图结构域和结构，分别由 439 个和 542 个氨基酸组成，可在原核细胞中表达。TRF1 的制备已在文献41 中先前描述过。在这里，我们提供了 TRF2 制备的全面描述和代表性结果。 图 1B 显示了用于在 大肠杆菌中表达 TRF2 的质粒图谱。我们评估了大 肠杆菌诱导前后的 TRF2 表?...

讨论

该协议使用磁镊在单分子水平 57,58,59 上操纵 TRF。我们利用磁珠从基因组 DNA 片段中分离 TRF。限制性酶切后，TRF 与磁珠结合，使其能够轻松从基因组 DNA 片段中分离。这种方法允许使用磁镊进行操作，这与受透明度问题限制的光镊不同，它可以有效地捕获磁珠。此外，虽然 AFM 可用于单分子操作，但需?...

披露声明

作者声明不存在竞争性经济利益或其他利益冲突。

致谢

这项工作得到了中国国家自然科学基金 [授予 Z.Y.32071227]、天津市自然科学基金（22JCYBJC01070 至 Z.Y.）和精密测量技术与仪器国家重点实验室（天津大学）[授予 pilab2210 至 Z.Y.] 的支持。

材料

NameCompanyCatalog NumberComments
Anti-DigoxigeninRoche11214667001
BfaINew England Biolab (NEB)R0568S
BSASigma-AldrichV900933
CMOS camera MikrotronMC1362
CviAIINew England Biolab (NEB)R0640S
DIG-11-dUTPJena BioscienceNU-803-DIGXL
DNA extraction solutionG-CLONEEX0108
Dnase I, Rnase-Free, Hc EaThermo Fisher ScientificEN0523
dNTP mixtureNanjing Vazyme Biotech Co., Ltd (Vazyme)P032-02
DTTSolarbioD1070
Dynabeads M-270  beadsThermo Fisher Scientific65305Streptavidin beads
Dynabeads MyOne beadsThermo Fisher Scientific65001Streptavidin beads
EthanolTianjin No.6 Chemical Reagent Factory1083
GlycerolBeijing Hwrkchemical Co,. LtdSMG66258-1
ImidazoleSolarbioII0070
IPTGSolarbioI8070
IsopropanolTianjin No.6 Chemical Reagent FactoryA1079
KanamycinThermo Fisher ScientificEN0523
Klenow fragment (3′-5′ exo-)New England Biolab (NEB)M0212S
LabViewNational Instrumentshttps://www.ni.com/en-us/shop/product/labview.htmlGraphical programming software 
LiClBide Pharmatech Co., Ltd (bidepharm)BD136449
LysozymeSolarbioL8120-5
MseINew England Biolab (NEB)R0525S
NaClShanghai AladdinC111533
NanoDropThermo Fisher ScientificSpectrophotometer
NdeINew England Biolab (NEB)R0111S
Ni NTA Beads 6FFChangzhou Smart-Lifesciences Biotechnology Co.,LtdSA005025
Nitrocellulose membraneABclonalRM02801
PMSFSolarbioP8340
Proteinase KBeyotime Biotech Inc (beyotime)ST535-500mg
rCutSmart BufferNew England Biolab (NEB)B6004S
Rnase ASigma-AldrichR4875
Sodium acetateSERVA Electrophoresis GmbH2124902
Sumo proteaseBeyotime Biotech Inc (beyotime)P2312M

参考文献

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