使用单分子磁镊分析端粒蛋白-DNA 相互作用

摘要

该协议演示了使用单分子磁镊研究端粒 DNA 结合蛋白（端粒重复结合因子 1 [TRF1] 和 TRF2）与从人类细胞中提取的长端粒之间的相互作用。它描述了端粒和端粒重复结合因子的准备步骤、单分子实验的执行以及数据收集和分析方法。

摘要

端粒是染色体末端的保护结构，对于维持细胞寿命和基因组稳定性至关重要。它们的正常功能取决于严格调节的复制、伸长和损伤反应过程。shelterin 复合物，尤其是端粒重复结合因子 1 （TRF1） 和 TRF2，在端粒保护中起着关键作用，并已成为药物发现的潜在抗癌靶点。这些蛋白与重复的端粒 DNA 基序 TTAGGG 结合，促进保护结构的形成和其他端粒蛋白的募集。结构方法和先进的成像技术为端粒蛋白质-DNA 相互作用提供了见解，但探测动态过程需要单分子方法。磁镊、光镊和原子力显微镜 （AFM） 等工具已被用于研究端粒蛋白-DNA 相互作用，揭示了 TRF2 依赖性 DNA 畸变和端粒酶催化等重要细节。然而，制备具有端粒重复基序的单分子构建体仍然是一项具有挑战性的任务，这可能会限制利用单分子机械方法的研究范围。为了解决这个问题，我们开发了一种使用全长人类端粒 DNA 与磁镊研究相互作用的方法。该协议描述了如何表达和纯化 TRF2、制备端粒 DNA、设置单分子机械测定以及分析数据。这份详细的指南将使端粒生物学和端粒靶向药物发现的研究人员受益。

引言

端粒是染色体末端的保护性结构 ^1,2,3。细胞分裂过程中的端粒侵蚀会导致细胞衰老和衰老，而端粒的异常伸长会导致癌症 ^4,5。为了使端粒正常运作，它们的复制、伸长和损伤反应必须受到高度调节 ^6,7,8。Shelterin 由 6 个亚基组成，在端粒保护中起着核心作用 ^9,10,11。对端粒的更深入理解将为端粒生物学提供有价值的见解。

TRF1 和 TRF2 是 shelterin 的核心亚基，是端粒结合蛋白^12,13。TRF1....

研究方案

1. 一般材料和方法

1. 有关本协议中使用的盐、化学品、抗生素、酶、抗体和树脂材料，请参阅 材料表 文件。
2. 根据冷泉港方案^{45、46、47、48、49、50、51、52、53} 的配方制备 Luria-Bertani （LB） 液体培养基、LB 琼脂平板、HEPES 缓冲液、SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳 （SDS-PAGE）、磷酸盐缓冲盐水 （PBS）、Tris-EDTA （TE） 缓冲液。
3. 通过商业来源获取 pET28a 载体 （Addgene）、原核细胞系和真核细胞系 （ATCC）。然后，在实验室中不断培养和传代它们。
4. 对于大....

讨论

该协议使用磁镊在单分子水平 57,58,59 上操纵 TRF。我们利用磁珠从基因组 DNA 片段中分离 TRF。限制性酶切后，TRF 与磁珠结合，使其能够轻松从基因组 DNA 片段中分离。这种方法允许使用磁镊进行操作，这与受透明度问题限制的光镊不同，它可以有效地捕获磁珠。此外，虽然 AFM 可用于单分子操作，但需?.......

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anti-Digoxigenin	Roche	11214667001
BfaI	New England Biolab (NEB)	R0568S
BSA	Sigma-Aldrich	V900933
CMOS camera	Mikrotron	MC1362
CviAII	New England Biolab (NEB)	R0640S
DIG-11-dUTP	Jena Bioscience	NU-803-DIGXL
DNA extraction solution	G-CLONE	EX0108
Dnase I, Rnase-Free, Hc Ea	Thermo Fisher Scientific	EN0523
dNTP mixture	Nanjing Vazyme Biotech Co., Ltd (Vazyme)	P032-02
DTT	Solarbio	D1070
Dynabeads M-270  beads	Thermo Fisher Scientific	65305	Streptavidin beads
Dynabeads MyOne beads	Thermo Fisher Scientific	65001	Streptavidin beads
Ethanol	Tianjin No.6 Chemical Reagent Factory	1083
Glycerol	Beijing Hwrkchemical Co,. Ltd	SMG66258-1
Imidazole	Solarbio	II0070
IPTG	Solarbio	I8070
Isopropanol	Tianjin No.6 Chemical Reagent Factory	A1079
Kanamycin	Thermo Fisher Scientific	EN0523
Klenow fragment (3′-5′ exo-)	New England Biolab (NEB)	M0212S
LabView	National Instruments	https://www.ni.com/en-us/shop/product/labview.html	Graphical programming software
LiCl	Bide Pharmatech Co., Ltd (bidepharm)	BD136449
Lysozyme	Solarbio	L8120-5
MseI	New England Biolab (NEB)	R0525S
NaCl	Shanghai Aladdin	C111533
NanoDrop	Thermo Fisher Scientific		Spectrophotometer
NdeI	New England Biolab (NEB)	R0111S
Ni NTA Beads 6FF	Changzhou Smart-Lifesciences Biotechnology Co.,Ltd	SA005025
Nitrocellulose membrane	ABclonal	RM02801
PMSF	Solarbio	P8340
Proteinase K	Beyotime Biotech Inc (beyotime)	ST535-500mg
rCutSmart Buffer	New England Biolab (NEB)	B6004S
Rnase A	Sigma-Aldrich	R4875
Sodium acetate	SERVA Electrophoresis GmbH	2124902
Sumo protease	Beyotime Biotech Inc (beyotime)	P2312M