Analisi delle interazioni proteina-DNA telomerico utilizzando pinzette magnetiche a singola molecola

Riepilogo

Questo protocollo dimostra l'utilizzo di pinzette magnetiche a singola molecola per studiare le interazioni tra le proteine telomeriche leganti il DNA (Telomere Repeat-binding Factor 1 [TRF1] e TRF2) e i lunghi telomeri estratti da cellule umane. Descrive le fasi preparatorie per i telomeri e i fattori di legame ripetuto telomerico, l'esecuzione di esperimenti su singole molecole e i metodi di raccolta e analisi dei dati.

Abstract

I telomeri, le strutture protettive alle estremità dei cromosomi, sono fondamentali per mantenere la longevità cellulare e la stabilità del genoma. Il loro corretto funzionamento dipende da processi strettamente regolati di replicazione, allungamento e risposta al danno. Il complesso shelterin, in particolare il fattore 1 legante la ripetizione dei telomeri (TRF1) e TRF2, svolge un ruolo fondamentale nella protezione dei telomeri ed è emerso come un potenziale bersaglio antitumorale per la scoperta di farmaci. Queste proteine si legano al motivo ripetitivo del DNA telomerico TTAGGG, facilitando la formazione di strutture protettive e il reclutamento di altre proteine telomeriche. I metodi strutturali e le tecniche di imaging avanzate hanno fornito informazioni sulle interazioni proteina-DNA telomeriche, ma l'indagine sui processi dinamici richiede approcci a singola molecola. Strumenti come pinzette magnetiche, pinzette ottiche e microscopia a forza atomica (AFM) sono stati impiegati per studiare le interazioni proteina-DNA telomera, rivelando dettagli importanti come la distorsione del DNA dipendente da TRF2 e la catalisi della telomerasi. Tuttavia, la preparazione di costrutti a singola molecola con motivi ripetitivi telomerici continua ad essere un compito impegnativo, limitando potenzialmente l'ampiezza degli studi che utilizzano metodi meccanici a singola molecola. Per risolvere questo problema, abbiamo sviluppato un metodo per studiare le interazioni utilizzando DNA telomerico umano a lunghezza intera con pinzette magnetiche. Questo protocollo descrive come esprimere e purificare TRF2, preparare il DNA telomerorico, impostare saggi meccanici a singola molecola e analizzare i dati. Questa guida dettagliata andrà a beneficio dei ricercatori in biologia dei telomeri e nella scoperta di farmaci mirati ai telomeri.

Introduzione

I telomeri sono strutture protettive alle estremità dei cromosomi ^1,2,3. L'erosione dei telomeri durante la divisione cellulare porta alla senescenza cellulare e all'invecchiamento, mentre l'allungamento anomalo dei telomeri contribuisce al cancro ^4,5. Affinché i telomeri funzionino correttamente, la loro replicazione, allungamento e risposte al danno devono essere altamente regolate ^6,7,8. La shelterina, composta da sei subunità, svolge un ruolo centrale nella protezione dei telomeri ^9,10,11. Una comprensione più approfondita dei telomeri fornirà preziose informazioni sulla biologia dei telomeri.

TRF1 e TRF2, subunità principali della shelterina, sono proteine leganti i telomeri^12,13. Sia TRF1 che TRF2 si legano al motivo ripetitivo del DNA TTAGGG nei telomeri attraverso i loro domini Myb¹⁴. Formano dimeri attraverso i loro domini TRFH condivisi, che consentono loro di circondare il DNA telomerico a doppio filamento e di reclutare proteine telomeriche 15,16,17,18,19. TRF2 è particolarmente importante per la formazione di D-loop telomerici e T-loop^20,21. A causa del loro ruolo cruciale nella protezione dei telomeri, TRF1 e TRF2 sono emersi come potenziali bersagli farmacologici antitumorali 22,23,24,25.

Sono stati compiuti sforzi significativi per studiare le interazioni proteina-DNA nei telomeri. Metodi biochimici come l'Electrophoretic Mobility Shift Assay (EMSA) e la Surface Plasmon Resonance (SPR) sono stati utilizzati per esaminare le affinità di legame ^20,26. Numerose strutture di proteine leganti telomerici complessate con il DNA sono state chiarite utilizzando la microscopia crioelettronica (cryo-EM), la cristallografia a raggi X e la risonanza magnetica nucleare (NMR)27,28,29. Tecniche di imaging a super-risoluzione come la microscopia a ricostruzione ottica stocastica (STORM) hanno rivelato la formazione di T-loop²¹ TRF2-dipendente. Recentemente, il sequenziamento dei nanopori è stato sviluppato per profilare le sequenze telomeriche ^4,30,31. Queste intuizioni strutturali hanno notevolmente migliorato la nostra comprensione delle interazioni proteina-DNA telomeriche. Per approfondire le dinamiche delle interazioni proteina-DNA telomeriche, lo sviluppo di nuove tecnologie è essenziale.

Gli strumenti a singola molecola sono tecniche potenti per esplorare le interazioni proteina-DNA nei telomeri 32,33,34. Metodi meccanici a singola molecola, come pinzette magnetiche, pinzette ottiche e AFM, sono stati impiegati per studiare la distorsione del DNA TRF2-dipendente, rivelare l'impilamento colonnare mediato da TRF2 della cromatina telomerica umana e osservare la catalisi processativa della telomerasi, tra le altre applicazioni 35,36,37,38,39,40. Questi metodi sono particolarmente utili per sondare le conformazioni topologiche e la cinetica di associazione e dissociazione proteina-DNA.

Tuttavia, la preparazione di costrutti a singola molecola con motivi ripetitivi telomerici presenta ancora delle sfide, il che limita gli studi con metodi meccanici a singola molecola. Per affrontare questa limitazione, abbiamo sviluppato un metodo meccanico a singola molecola per studiare le interazioni globali proteina-DNA su telomeri umani a lunghezza intera⁴¹. Questo metodo estrae direttamente il DNA telomerico dalle cellule umane, eludendo la laboriosa preparazione del DNA telomerico artificiale. Facilita lo studio dei processi cinetici su lunghi telomeri nativi che si estendono su diverse kilobasi.

In questo protocollo, forniamo una descrizione dettagliata dei passaggi per sondare le interazioni proteina-DNA telomerica utilizzando pinzette magnetiche, un popolare strumento meccanico a singola molecola 42,43,44. Dimostriamo come esprimere e purificare le proteine telomeriche, utilizzando TRF2 come esempio, e come preparare il DNA telomerico da cellule umane. Inoltre, mostriamo come impostare un saggio a singola molecola su pinzette magnetiche per studiare le interazioni proteina-DNA telomeriche, e copriamo la successiva analisi dei dati di esperimenti su singole molecole. Questo protocollo andrà a beneficio dei ricercatori nel campo della biologia dei telomeri e della scoperta di farmaci mirati ai telomeri.

Protocollo

1. Materiali e metodi generali

1. Fare riferimento al file della Tabella dei materiali per i sali, le sostanze chimiche, gli antibiotici, gli enzimi, gli anticorpi e i materiali in resina utilizzati in questo protocollo.
2. Preparare il terreno liquido Luria-Bertani (LB), le piastre di agar LB, il tampone HEPES, l'elettroforesi su gel di poliacrilammide SDS (SDS-PAGE), la soluzione salina tamponata con fosfato (PBS), il tampone Tris-EDTA (TE) secondo le ricette dei protocolli di porto di sorgente fredda 45,46,47,48,49,50,51,52,53.
3. Acquisire il vettore pET28a (Addgene), le linee cellulari procariotiche ed eucariotiche (ATCC) attraverso fonti commerciali. Quindi, coltura continua e passaggio in laboratorio.
4. Per grandi volumi di liquido, sterilizzare in autoclave a 120 °C per 20 min. Per piccoli volumi, utilizzare un filtro sterile con una dimensione dei pori di 0,22 μm.
5. Regolare il pH delle soluzioni al livello desiderato utilizzando HCl o NaOH prima di portarle ai loro volumi finali.
   NOTA: Le pinzette magnetiche sono costruite su misura ed eseguite in un ambiente di LabVIEW 2017, mentre l'analisi dei dati a singola molecola viene eseguita in MATLAB 2017 ^2,54,55.
6. Per motivi di sicurezza, indossare camici da laboratorio a maniche lunghe, guanti in nitrile (o guanti realizzati con un materiale impermeabile e resistente alla sostanza), occhiali o occhiali di sicurezza e scarpe chiuse.

2. Espressione proteica e purificazione di proteine telomerici leganti il DNA

1. Eseguire colture cellulari e indurre l'espressione proteica.
   1. Inserire la sequenza codificante per le proteine leganti il DNA telomerico (Figura 1A), TRF2 come esempio in questo caso, nel vettore pET28a mediante digestione enzimatica e legatura, con SUMO impiegato come tag di fusione. Inserire tra i siti di restrizione di BamHI e HindIII, producendo il plasmide di pET28a-SUMO-TRF2 (Figura 1B).
   2. Trasformare le cellule BL21(DE3) con il plasmide pET28a-SUMO-TRF2.
      1. Scongelare un'aliquota di 50 μL di cellule BL21(DE3) competenti su ghiaccio.
      2. Aggiungere 1 μL di DNA del plasmide pET28a-SUMO-TRF2 (contenente 50 ng di DNA) alle cellule competenti. Agitare delicatamente per miscelare senza pipettare su e giù.
         NOTA: Non vortice.
      3. Incubare la miscela con ghiaccio per 30 minuti.
      4. In caso di shock termico, riscaldare la miscela di celle a 42 °C per esattamente 45 s in un bagno d'acqua. Rimettere immediatamente le cellule nel ghiaccio per 2 minuti per stabilizzare le cellule trasformate.
      5. Aggiungere 950 μl di terreno a temperatura ambiente (RT) LB alle celle per facilitare il recupero.
      6. Incubare le cellule trasformate a 37 °C per 1 ora agitando a 220 giri/min.
      7. Distribuire 100 μl della miscela di trasformazione su una piastra di agar LB contenente 50 μg/mL di kanamicina (85,8 μM).
      8. Incubare le celle piastrate per una notte a 37 °C. Dopo l'incubazione, selezionare colonie distinte da utilizzare nell'inoculazione delle colture starter.
         NOTA: Le colonie su piastre possono essere conservate a 4 °C per un massimo di 2 settimane.
   3. Prelevare una colonia di cellule BL21(DE3) trasformate e coltivarla in 5 mL di terreno LB integrato con 50 μg/mL di kanamicina (85,8 μM). Incubare per 18 ore a 37 °C agitando a 220 giri/min.
   4. Per aumentare le dimensioni, trasferire 2 mL di coltura notturna a 200 mL di terreno LB contenente 50 μg/mL di kanamicina (85,8 μM). Continuare l'incubazione a 37 °C con agitazione a 220 giri/min fino a quando la densità ottica a 600 nm (OD 600) raggiunge 0,6-0,8.
   5. Prelevare 1 mL di coltura come campione di controllo non indotto.
   6. Indurre la coltura rimanente con isopropil β-d-1-tiogalattopiranoside (IPTG) a una concentrazione finale di 1 mM e incubare a 20 °C per 17 ore per promuovere l'espressione proteica.
   7. Eseguire SDS-PAGE utilizzando un gel di impilamento al 5% e un gel di separazione al 10%. Caricare i campioni con il buffer di caricamento SDS-PAGE ed eseguire SDS-PAGE inizialmente a 100 V per 30 minuti, seguito da 120 V per 50 minuti in un tampone Tris-glicina. Colorare con il blu di Coomassie per visualizzare l'espressione proteica (vedere le ricette nella Tabella supplementare 1) (Figura 1C).
      NOTA: Vedere la discussione per la risoluzione dei problemi se l'espressione non viene osservata.
2. Purificare le proteine.
   1. Raccogliere le cellule mediante centrifugazione a 4 °C, 8500 x g per 10 min. Scartare il surnatante e lavare il pellet in 200 mL di PBS. Centrifugare di nuovo, scartare il surnatante e risospendere il pellet cellulare in 25 mL di tampone di lisi (20 mM HEPES, 300 mM NaCl, 20 mM imidazolo, 10% glicerolo, 0,5 mM DTT, 1 mM fenilmetilsulfonilfluoruro [PMSF]).
      ATTENZIONE: Il PMSF è corrosivo e tossico e provoca ustioni. Indossare indumenti protettivi adeguati, guanti e protezioni per occhi/viso.
      NOTA: Congelare a -80 °C se non si procede immediatamente.
   2. Aggiungere 5 μL di 100 mg/mL di lisozima, 5 μL di 1 U/μL di DNasi I e 5 μL di 10 mg/mL di RNasi A alle cellule risospese.
   3. Eseguire la sonicazione sul ghiaccio, con raffiche di 1 s a 250 W seguite da una pausa di 2 s, per un totale di 30 minuti.
   4. Centrifugare a 38.000 x g, 4 °C per 40 minuti (30-60 minuti è accettabile) e filtrare il surnatante attraverso un filtro per siringa da 0,22 μm.
   5. Preparare 500 mL di tampone legante la colonna di Ni sciogliendo 8,76 g di NaCl (concentrazione finale 300 mM) e 0,68 g di imidazolo (concentrazione finale 20 mM) in 20 mM HEPES (pH 8,0). Filtrare la soluzione attraverso un filtro da 0,22 μm.
      ATTENZIONE: L'imidazolo è pericoloso e può causare irritazione alla pelle e agli occhi. Può anche danneggiare un nascituro. Evitare il contatto con occhi, pelle e indumenti. Non ingerire o inalare. Indossare dispositivi di protezione individuale, compresa la protezione per il viso.
   6. Preparare tamponi per eluizione in colonna Ni (20 mM HEPES (pH 8,0), 300 mM NaCl) con concentrazioni crescenti di imidazolo (100 mM, 200 mM, 300 mM e 500 mM) per l'eluizione graduale, assicurandosi che tutti i tamponi siano filtrati in modo appropriato.
   7. Caricare il surnatante filtrato sulla colonna di Ni pre-equilibrata nel tampone legante (20 mM HEPES (pH 8,0), 300 mM NaCl, 20 mM imidazolo). Lavare con il tampone legante ed eluire la proteina con il gradiente di imidazolo preparato, raccogliendo 12 frazioni, ciascuna con 1 mL (Figura 1C). Combina frazioni con purezza del >95%.
   8. Misurare la concentrazione della proteina di fusione 6xHis-sumo-TRF2 eluita mediante A₂₈₀ in uno spettrofotometro.
   9. Per le proteine utilizzate nei saggi a singola molecola, aggiungere sumo proteasi secondo le istruzioni del produttore (in genere 0,125 U di proteasi per 2 μg di proteina di fusione) e consentire la digestione notturna a 4 °C.
   10. Dopo il trattamento con sumo proteasi, caricare nuovamente la miscela su una colonna di Ni per legare qualsiasi proteina di fusione non digerita e il sumo marcato con His, consentendo il passaggio della proteina TRF2 senza tag. Raccogli il flusso.
3. Determinare la concentrazione proteica e immagazzinare le proteine.
   1. Concentrare la proteina TRF2 purificata utilizzando un'unità di filtro centrifugo cutoff da 30 kDa e scambiarla in un tampone di conservazione contenente 20 mM di HEPES (pH 8,0), 150 mM di NaCl, 0,5 mM di DTT, per ridurre la concentrazione di imidazolo al di sotto di 150 mM.
   2. Ripetere il processo di concentrazione fino a quando il volume non si riduce a meno di 1 ml.
   3. Analizzare i campioni di ogni fase di purificazione mediante SDS-PAGE per valutare la purezza e l'integrità della proteina (Figura 1C).
      NOTA: La cromatografia di affinità viene utilizzata per purificare le proteine, raccogliere e lavare i campioni eluiti ed eseguire SDS-PAGE per valutare l'integrità delle proteine e garantire il controllo di qualità. Quando la cromatografia di affinità da sola non soddisfa i requisiti di purezza, viene impiegata la cromatografia ad esclusione dimensionale per migliorare ulteriormente la purezza delle proteine. Le curve di assorbanza UV aiutano a valutare le frazioni di eluizione e SDS-PAGE verifica l'integrità delle proteine, garantendo un rigoroso controllo di qualità durante tutto il processo.
   4. Aggiungere glicerolo a una concentrazione finale del 50% alla proteina concentrata e scambiata con tampone per la conservazione.
   5. Conservare le proteine a -80 °C.

3. Preparazione di frammenti di restrizione telomerica umana

1. Estrarre il DNA genomico.
   1. Seguendo il diagramma di flusso (Figura 2A), centrifugare 1 x 10⁷ celle a 1000 x g per 3 minuti ed eliminare il surnatante. Per il lavaggio, risospendere le cellule in 200 μL di PBS, centrifugare nuovamente a 1000 x g per 3 minuti ed eliminare il surnatante.
   2. Aggiungere 760 μl di tampone contenente 50 mM di Tris-HCl (pH 8,0), 100 mM di NaCl, 100 mM di EDTA e 1% di SDS alla provetta contenente 1 x 10⁷ cellule e risospendere delicatamente mediante pipettaggio per evitare bolle d'aria.
      NOTA: Non vortice.
   3. Per la digestione delle proteine e l'eliminazione delle DNasi e delle RNasi nel campione, aggiungere la proteinasi K a una concentrazione finale di 0,5 mg/mL, corrispondente a 40 μl di una soluzione madre da 10 mg/mL. Picchiettare il fondo del tubo per mescolare (non vortice).
   4. Incubare per una notte a 37 °C.
   5. Aggiungere 265 μl di NaCl 5,4 M. Mescolare per 5 minuti capovolgendo il tubo cinque volte al minuto, quindi mettere sul ghiaccio per 20 minuti.
   6. Centrifugare alla massima velocità (ad es. 16.900 x g) per 10 minuti a RT.
   7. Trasferire il surnatante in una provetta da centrifuga e aggiungere un volume uguale di isopropanolo (circa 750 μL), evitando la formazione di lipidi o sedimenti galleggianti. Il DNA è nel surnatante.
   8. Capovolgere il tubo cinque volte per mescolare. Confermare visivamente la presenza di un pellet di DNA che precipita nella provetta da centrifuga.
   9. Centrifugare a RT alla massima velocità per 10 min.
   10. Scartare il surnatante. Lavare il pellet di DNA con 500 μL di etanolo al 70% capovolgendo la provetta da centrifuga cinque volte.
       NOTA: Il pellet è DNA.
   11. Centrifugare a RT alla massima velocità (ad es. 16.900 x g) per 10 min.
   12. Rimuovere con cura tutto il surnatante, lasciando il pellet di DNA. Lasciare asciugare il pellet all'aria a RT per 5 minuti.
       NOTA: Evitare l'essiccazione eccessiva, poiché il DNA genomico può diventare difficile da sciogliere.
   13. Risospendere il pellet di DNA in 475 μL di tampone TE (10 mM Tris-HCl [pH 8,0], 1 mM EDTA). Mescolare delicatamente picchiettando il fondo del tubo. Per la digestione dell'RNA durante la preparazione del DNA, aggiungere 25 μL di RNasi A da 10 mg/mL (concentrazione finale 0,5 mg/mL) e mescolare picchiettando delicatamente fino a quando il pellet di DNA non si è completamente sciolto.
       NOTA: Evitare il vortice per evitare il taglio del DNA.
   14. Incubare il campione di DNA a 4 °C per una notte.
   15. Eseguire un'estrazione con fenolo trisaturato di uguale volume: aggiungere 500 μl di fenolo alla provetta da centrifuga, mescolare delicatamente con una pipetta e centrifugare alla massima velocità per 10 minuti a 4 °C.
       ATTENZIONE: L'esposizione al fenolo può causare irritazione alla pelle, agli occhi, al naso, alla gola e al sistema nervoso. Evitare il contatto con occhi, pelle e indumenti. Non ingerire o inalare. Indossare dispositivi di protezione individuale, compresa la protezione per il viso.
       NOTA: Il DNA si trova nella fase acquosa superiore, le proteine si trovano nell'interfase e la fase organica si trova nella parte inferiore.
   16. Ripeti tre volte. Prendi il surnatante del DNA (circa 280 μL).
   17. In base al volume del campione di DNA, aggiungere 1/10 di volume (28 μL) di acetato di sodio 3 M (concentrazione finale 0,3 M, pH 5,2) e 2 volumi (616 μL) di etanolo freddo al 100%. Posizionare la provetta da centrifuga a -80 °C per 2-3 ore.
   18. Centrifugare alla massima velocità (ad es. 16.900 x g) per 10 minuti a 4 °C. Scongelare la soluzione con ghiaccio se congelata prima della centrifugazione.
   19. Scartare il surnatante e lavare 3-4 volte con etanolo al 70% capovolgendo la provetta da centrifuga. Centrifugare alla massima velocità per 5 min a 4 °C.
   20. Rimuovere l'etanolo e lasciare asciugare il pellet all'aria a RT per 5 minuti.
   21. Aggiungere 100 μl di tampone TE, picchiettare la provetta per miscelare e lasciarla riposare a 4 °C per 2 ore per scioglierla completamente.
       NOTA: Esaminare l'integrità del DNA genomico su un gel di agarosio all'1% (Figura 2B).
   22. Conservare il DNA a -20 °C in congelatore. Rimarrà stabile per almeno 1 anno.
2. Eseguire la digestione e la modifica genomica del DNA.
   1. Prelevare 4 μg di DNA genomico e combinarli con 1 μL di CviAII (10 U), 2 μL di tampone di digestione 10x (vedere la Tabella supplementare 1 per le ricette) e aggiungere acqua per raggiungere un volume totale di 20 μL. Incubare la miscela a 25 °C per 12 ore.
      NOTA: FatI può sostituire CviAII, che è ora fuori produzione da NEB.
   2. Aggiungere 1 μL di NdeI (20 U), 1 μL di MseI (10 U) e 1 μL di BfaI (10 U) alla stessa provetta contenente la miscela precedente (20 μL). Inoltre, aggiungere 2 μL di tampone di digestione 10x e 15 μL di acqua per ottenere un volume totale di 40 μL. Incubare a 37 °C per 12 ore, quindi inattivare a caldo tutti gli enzimi a 80 °C per 20 minuti.
      NOTA: La digestione del DNA genomico può essere esaminata utilizzando il metodo del frammento di restrizione terminale (TRF) (Figura 2C). La combinazione dei quattro enzimi di restrizione (CviAII, NdeI, MseI e BfaI) digerisce il DNA genomico in frammenti di circa 800 bp e produce i TRF con una minima contaminazione subtelomerica del DNA.
   3. Per la modifica della digossigenina, prelevare 40 μL di DNA genomico digerito e aggiungere 4 μL di 1 mM di dATP (concentrazione finale 0,08 mM), 4 μL di 1 mM di digossigenina-11-dUTP (concentrazione finale 0,08 mM), 1 μL di frammento di Klenow (5 U), 0,5 μL di 100 mM DTT (concentrazione finale 1 mM) e 1 μL di tampone di digestione 10x. Incubare a 37 °C per 12 ore, quindi riscaldare a 75 °C per 20 minuti per inattivare il frammento di Klenow.
   4. Per la marcatura della biotina, prelevare 12,5 μL di DNA genomico modificato con digossigenina (1 μg) e aggiungere 1 μL di sonda telomerica biotinilata da 1 μM (cioè 1 pmol) che sono complementari alla sporgenza telomerica a filamento singolo. Aggiungere 611,5 μl di tampone TE Li (10 mM Tris-HCl (pH 8,0), 1 mM EDTA, 50 mM LiCl) per diluire gli ioni K da 50 mM a 1 mM, ottenendo un volume totale di 625 μl, che può essere diviso in 16 provette da 39 μl ciascuna.
   5. Riscaldare a 75 °C per 3 minuti in un termociclatore, quindi diminuire la temperatura di 0,1 °C ogni 30 s fino a raggiungere i 25 °C.
   6. Conservare i campioni di DNA a -20 °C per almeno un anno.

4. Impostazione di una cella di flusso per un campione di DNA telomerico su pinzette magnetiche

1. Realizzare una cella a flusso per saggi a singola molecola.
   1. Utilizzare una smerigliatrice elettrica per praticare dei fori poiché l'ingresso e l'uscita sui vetrini coprioggetti superiori (vetro di copertura # 2 con uno spessore di 0,2 mm).
   2. Pulire i vetrini coprioggetti con il detersivo mediante sonicazione per 30 minuti.
   3. Lavare i vetrini coprioggetti con acqua ultrapura 3 volte.
   4. Pulire i vetrini coprioggetti in isopropanolo mediante sonicazione per 30 min.
   5. Lavare i vetrini coprioggetti con acqua ultrapura 3 volte.
   6. Pulire i vetrini coprioggetti in ultra-puro mediante sonicazione per 15-30 minuti.
   7. Asciugare i vetrini coprioggetti con azoto.
      NOTA: Il protocollo può essere interrotto qui e i vetrini coprioggetti puliti possono essere conservati per un uso successivo.
   8. Rivestire i vetrini coprioggetti inferiori (senza fori) con 20 μl di nitrocellulosa allo 0,1% e aggiungere le perle di riferimento (diluizione 20x, diametro 3 μm). Infornare a 100 °C per 4 min.
   9. Utilizzare un bisturi per tagliare i distanziatori di parafilm a doppio strato secondo uno stampo metallico. Lo stampo è un pezzo rettangolare in lega di alluminio con le stesse dimensioni del vetrino coprioggetti, caratterizzato da un centro scavato per facilitare il taglio del canale.
   10. Assemblare il sandwich della cella di flusso (Figura 3A). Riscaldare a 85 °C e massaggiare con due tamponi fino a quando il parafilm sigilla il canale.
   11. Rivestire la cella di flusso con un anticorpo. Iniettare 70 μL di anticorpo anti-digossigenina (0,1 mg/mL) direttamente nella cella a flusso. Lasciare a RT per 1 ora.
   12. Passivare la cella di flusso. Iniettare 70 μL di 10 mg/mL di BSA per sostituire l'anticorpo anti-digossigenina. Partenza da RT per 12 h. Gli anticorpi anti-digossigenina non legati verranno eliminati nelle fasi successive con un lavaggio rigoroso.
       NOTA: Conservare la cella di flusso a 4 °C per 1-2 settimane.
   13. Verificare la presenza di un legame aspecifico inserendo nella cella di flusso 5 μL di perle MyOne (10 mg/mL) lavate (o 5 μL di M270 (10 mg/mL) lavate senza DNA. Lasciare agire per 10 minuti, quindi sciacquare le perle utilizzando un tampone di lavoro (20 mM HEPES (pH 7,5), 100 mM NaCl, 1 mM EDTA). Conta il numero di perline attaccate alla superficie in un campo visivo. Una superficie ben trattata dovrebbe mostrare zero o solo poche perline.
2. Isolare e immobilizzare i legami di DNA telomerico in una cella a flusso.
   1. Prelevare 10 μL di microsfere M270 (10 mg/mL) o 5 μL di MyOne da 10 mg/mL e lavarle cinque volte con 50 μL di tampone di lavoro (20 mM HEPES [pH 7,5], 100 mM NaCl, 1 mM EDTA) utilizzando un magnete.
   2. Prendi 500 ng di DNA genomico digerito e mettili in una provetta da centrifuga da 1,5 mL. Aggiungere tutte le microsfere (50 μl) sopra il campione di DNA.
   3. Senza pipettaggio, agitare delicatamente la provetta da centrifuga alcune volte per miscelare le microsfere e il campione di DNA. Lasciare il composto in ghiaccio per 1 ora. Lavare con 500 μL di tampone di lavoro tre volte utilizzando un magnete per tirare le perle verso il basso, con intervalli di 10 minuti tra i lavaggi.
   4. Risospendere il campione utilizzando 30 μl di tampone di lavoro e caricare la miscela nella cella di flusso. Lasciare agire per 30 min. Sciacquare le perline magnetiche non legate.
      NOTA: Il DNA telomerico è legato tra il vetrino coprioggetti inferiore e la perlina magnetica attraverso interazioni di affinità mediate da digoxigenina-anticorpo e biotina-streptavidina (Figura 3B).
3. Impostazione di una cella di flusso su una pinzetta magnetica
   1. Pulire la cella a flusso con etanolo al 70% e asciugare la superficie con un panno per lenti. Posizionare la cella di flusso pulita sul portacampioni inferiore e assemblare delicatamente il rack superiore utilizzando un cacciavite.
   2. Applicare una goccia di olio per lenti sulla superficie inferiore della cella di flusso, dove si allinea con la lente dell'obiettivo. Quindi, posizionare il portacampione sopra la lente dell'obiettivo e fissarlo con un cacciavite.
   3. Seleziona una coppia di magneti cubici da 5 mm disposti in configurazione verticale. Allineare il supporto del magnete con l'asse X del percorso della luce delle pinzette magnetiche per l'imaging.
      NOTA: Questo è un passaggio critico. La direzione del campo magnetico è allineata e quindi determinata dall'orientamento del supporto del magnete.
   4. Avvia il software di programmazione grafica e collega i controller per le pinzette magnetiche. Regolare il campo visivo per individuare un cordone di riferimento nella parte inferiore della cella di flusso e regolare leggermente la lente dell'obiettivo in modo che il cordone di riferimento mostri chiari anelli di diffrazione.
   5. Spostare i magneti verso il basso verso la parte superiore della cella di flusso.
      NOTA: Questo è un passaggio critico. Cambiamenti improvvisi nel modello di diffrazione delle perle indicano che i magneti hanno appena toccato la superficie della cella di flusso. Questa posizione è considerata l'offset per il punto zero di misura.
      NOTA: Abbassare i magneti con cautela, iniziando con passi più grandi e passando gradualmente a gradini più piccoli. Muoversi con incrementi di 0,1 mm per evitare di danneggiare la cella di flusso quando ci si avvicina alla cella di flusso.
   6. Sollevare i magneti nella posizione più alta e rimuovere il supporto del magnete.
   7. Accendere la pompa peristaltica collegata al flacone di scarico ed eliminare il liquido. Aggiungere 100 μl di tampone di lavoro all'ingresso e impostare la portata della pompa peristaltica a 100 μl/min per riempire la cella di flusso con il tampone.

5. Misure di un telomero utilizzando pinzette magnetiche a singola molecola

1. Configura la fotocamera.
   1. Impostate la scala di grigi della fotocamera CMOS (Complementary Metal-Oxide Semiconductor) con una regolazione della luminosità su 150 livelli.
   2. Definisci le dimensioni della regione di interesse (ROI).
   3. Impostare il framerate su 200 Hz con un tempo di esposizione di 5000 μs.
      NOTA: Questo è un passaggio critico. Assicurarsi che il tempo di inattività dell'otturatore sia impostato su zero.
   4. Spostare la posizione del magnete a 3 cm (circa 8 pN) e regolare la messa a fuoco dell'obiettivo sulle perline.
2. Stabilire la tabella di ricerca (LUT).
   1. Spostare i magneti in una posizione corrispondente a 8 pN per allungare saldamente la perlina magnetica legata al DNA.
   2. Impostare la LUT su 200 passi con una dimensione del passo di 0,05 μm.
   3. Utilizzare una fotocamera CMOS per catturare i profili delle perline magnetiche in diverse posizioni per stabilire la LUT.
      NOTA: Questo è un passaggio critico. Le perle di polistirene fissate nella cella di flusso fungono da perline di riferimento per eliminare la deriva per le perle di interesse.
3. Progetta un esperimento meccanico a singola molecola.
   1. Scrivi uno script in MATLAB per controllare i movimenti motori per saggi di rampa di forza o salto di forza.
      NOTA: Questo è un passaggio critico. Questo script codifica i comandi per i movimenti del magnete. La velocità di carico della forza viene impostata in questa fase per un saggio di rampa di forza. Qui vengono determinati anche i livelli e la durata dei saggi di salto di forza (Figura 4, File supplementare 1, File supplementare 2 e File supplementare 3).
   2. Importa lo script in un software di programmazione grafica per testare gli esperimenti su una singola molecola.
   3. Controllare il numero totale di fotogrammi necessari per l'esecuzione dell'esperimento a singola molecola e assicurarsi che la memoria disponibile superi questo requisito.
      NOTA: I dati andranno persi se la memoria allocata è inferiore a quella richiesta perché il salvataggio dei dati richiede tempo.
   4. Verificare la velocità massima di imaging per determinare il numero massimo di microsfere che possono essere monitorate contemporaneamente.
      NOTA: L'esperimento verrà terminato se viene superato il limite di velocità di imaging.
   5. Utilizzando un saggio di salto di forza come esempio, esegui l'esperimento meccanico a singola molecola. Le forze vengono applicate bruscamente alla perlina magnetica, che trasmette queste forze alla molecola di DNA, allungandola immediatamente verso l'alto.

6. Misurazioni di TRF1/2 su un telomero utilizzando pinzette magnetiche

1. Saggio a rampa di forza
   1. Utilizzando TRF1 come esempio, caricare 200 μL di 10 nM TRF1 nella cella di flusso a una velocità di flusso lenta (ad esempio, 30 μL/min). Attendere 30 minuti affinché TRF1 si leghi al DNA telomerico.
   2. Scegliere uno script per un esperimento di rampa di forza con una velocità di carico della forza di ±1 pN/s.
   3. Assegnare un nome appropriato ai file di dati ed eseguire l'esperimento. I dati verranno salvati nella destinazione specificata per l'analisi (Figura 5).
      NOTA: Durante questo esperimento, la forza viene aumentata e diminuita linearmente tra 0 pN e 17 pN, il che allunga e rilassa il DNA telomerico e rompe i loop di DNA mediati da TRF1/2.
2. Saggio di salto forzato
   1. Selezionare uno script per eseguire un test di salto forzato.
      NOTA: Vengono applicate varie forze per allungare il DNA telomerorico, ad esempio, "Forza a riposo" (Frest) a 0 pN per 40 s, "Forza di prova" (Ftest) che varia da 2 a 8 pN per 60 s, "Alta forza" (Fhigh) a 10 pN per 30 s e "Forza massima" (Fmax) a 20 pN per 30 s.
   2. Assegnare un nome appropriato ai file di dati ed eseguire l'esperimento. I dati verranno salvati nella destinazione specificata per l'analisi (Figura 5).

Risultati

La Figura 1A illustra i domini schematici e le strutture di TRF1 e TRF2, costituiti rispettivamente da 439 e 542 amminoacidi, che possono essere espressi nelle cellule procariotiche. La preparazione di TRF1 è stata precedentemente descritta in letteratura⁴¹. Qui, forniamo una descrizione completa e risultati rappresentativi della preparazione di TRF2. La Figura 1B mostra la mappa plasmidica utilizzata pe...

Discussione

Questo protocollo impiega pinzette magnetiche per la manipolazione di TRF a livello di singola molecola 57,58,59. Utilizziamo microsfere magnetiche per separare i TRF dai frammenti di DNA genomico. Dopo la digestione per restrizione, i TRF si legano alle biglie magnetiche, consentendo la loro facile separazione dai frammenti di DNA genomico. Questo approccio consente la manipolazione utilizzando...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anti-Digoxigenin	Roche	11214667001
BfaI	New England Biolab (NEB)	R0568S
BSA	Sigma-Aldrich	V900933
CMOS camera	Mikrotron	MC1362
CviAII	New England Biolab (NEB)	R0640S
DIG-11-dUTP	Jena Bioscience	NU-803-DIGXL
DNA extraction solution	G-CLONE	EX0108
Dnase I, Rnase-Free, Hc Ea	Thermo Fisher Scientific	EN0523
dNTP mixture	Nanjing Vazyme Biotech Co., Ltd (Vazyme)	P032-02
DTT	Solarbio	D1070
Dynabeads M-270  beads	Thermo Fisher Scientific	65305	Streptavidin beads
Dynabeads MyOne beads	Thermo Fisher Scientific	65001	Streptavidin beads
Ethanol	Tianjin No.6 Chemical Reagent Factory	1083
Glycerol	Beijing Hwrkchemical Co,. Ltd	SMG66258-1
Imidazole	Solarbio	II0070
IPTG	Solarbio	I8070
Isopropanol	Tianjin No.6 Chemical Reagent Factory	A1079
Kanamycin	Thermo Fisher Scientific	EN0523
Klenow fragment (3′-5′ exo-)	New England Biolab (NEB)	M0212S
LabView	National Instruments	https://www.ni.com/en-us/shop/product/labview.html	Graphical programming software
LiCl	Bide Pharmatech Co., Ltd (bidepharm)	BD136449
Lysozyme	Solarbio	L8120-5
MseI	New England Biolab (NEB)	R0525S
NaCl	Shanghai Aladdin	C111533
NanoDrop	Thermo Fisher Scientific		Spectrophotometer
NdeI	New England Biolab (NEB)	R0111S
Ni NTA Beads 6FF	Changzhou Smart-Lifesciences Biotechnology Co.,Ltd	SA005025
Nitrocellulose membrane	ABclonal	RM02801
PMSF	Solarbio	P8340
Proteinase K	Beyotime Biotech Inc (beyotime)	ST535-500mg
rCutSmart Buffer	New England Biolab (NEB)	B6004S
Rnase A	Sigma-Aldrich	R4875
Sodium acetate	SERVA Electrophoresis GmbH	2124902
Sumo protease	Beyotime Biotech Inc (beyotime)	P2312M