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Resumo

Este protocolo demonstra o uso de pinças magnéticas de molécula única para estudar as interações entre proteínas teloméricas de ligação ao DNA (Telomere Repeat-binding Factor 1 [TRF1] e TRF2) e telômeros longos extraídos de células humanas. Ele descreve as etapas preparatórias para telômeros e fatores de ligação de repetição teloméricos, a execução de experimentos de molécula única e os métodos de coleta e análise de dados.

Resumo

Os telômeros, as estruturas protetoras nas extremidades dos cromossomos, são cruciais para manter a longevidade celular e a estabilidade do genoma. Sua função adequada depende de processos rigidamente regulados de replicação, alongamento e resposta a danos. O complexo shelterina, especialmente o fator de ligação à repetição dos telômeros 1 (TRF1) e TRF2, desempenha um papel fundamental na proteção dos telômeros e emergiu como um potencial alvo anticâncer para a descoberta de medicamentos. Essas proteínas se ligam ao motivo repetitivo do DNA telomérico TTAGGG, facilitando a formação de estruturas protetoras e o recrutamento de outras proteínas teloméricas. Métodos estruturais e técnicas avançadas de imagem forneceram insights sobre as interações proteína-DNA telomérica, mas sondar os processos dinâmicos requer abordagens de molécula única. Ferramentas como pinças magnéticas, pinças ópticas e microscopia de força atômica (AFM) têm sido empregadas para estudar as interações proteína-DNA telomérico, revelando detalhes importantes, como distorção do DNA dependente de TRF2 e catálise da telomerase. No entanto, a preparação de construções de molécula única com motivos repetitivos teloméricos continua a ser uma tarefa desafiadora, potencialmente limitando a amplitude de estudos que utilizam métodos mecânicos de molécula única. Para resolver isso, desenvolvemos um método para estudar interações usando DNA telomérico humano de comprimento total com pinças magnéticas. Este protocolo descreve como expressar e purificar o TRF2, preparar o DNA telomérico, configurar ensaios mecânicos de molécula única e analisar dados. Este guia detalhado beneficiará pesquisadores em biologia de telômeros e descoberta de medicamentos direcionados a telômeros.

Introdução

Os telômeros são estruturas protetoras nas extremidades dos cromossomos 1,2,3. A erosão dos telômeros durante a divisão celular leva à senescência e envelhecimento celular, enquanto o alongamento anormal dos telômeros contribui para o câncer 4,5. Para que os telômeros funcionem adequadamente, sua replicação, alongamento e respostas a danos devem ser altamente regulados 6,7,8. A shelterina, composta por seis subunidades, desempenha um papel central na proteção dos telômeros 9,10,11. Uma compreensão mais profunda dos telômeros fornecerá informações valiosas sobre a biologia dos telômeros.

TRF1 e TRF2, subunidades centrais da shelterina, são proteínas de ligação telomérica12,13. Tanto o TRF1 quanto o TRF2 se ligam ao motivo repetitivo de DNA TTAGGG nos telômeros por meio de seus domínios Myb14. Eles formam dímeros por meio de seus domínios TRFH compartilhados, que lhes permitem circundar o DNA telomérico de fita dupla e recrutar proteínas teloméricas 15,16,17,18,19. O TRF2 é particularmente importante para a formação de D-loops e T-loops teloméricos20,21. Devido aos seus papéis cruciais na proteção dos telômeros, TRF1 e TRF2 surgiram como potenciais alvos de drogas anticâncer 22,23,24,25.

Esforços significativos foram feitos para investigar as interações proteína-DNA nos telômeros. Métodos bioquímicos como Electrophoretic Mobility Shift Assay (EMSA) e Surface Plasmon Resonance (SPR) têm sido usados para examinar as afinidades de ligação20,26. Numerosas estruturas de proteínas de ligação telomérica complexadas com DNA foram elucidadas usando microscopia crioeletrônica (crio-EM), cristalografia de raios-X e ressonância magnética nuclear (RMN) 27 , 28 , 29 . Técnicas de imagem de super-resolução, como a microscopia de reconstrução óptica estocástica (STORM), revelaram a formação de T-loop dependente de TRF221. Recentemente, o sequenciamento de nanoporos foi desenvolvido para traçar o perfil de sequências teloméricas 4,30,31. Esses insights estruturais melhoraram muito nossa compreensão das interações proteína-DNA telomérico. Para explorar ainda mais a dinâmica das interações proteína-DNA telomérica, o desenvolvimento de novas tecnologias é essencial.

Ferramentas de molécula única são técnicas poderosas para explorar as interações proteína-DNA nos telômeros 32,33,34. Métodos mecânicos de molécula única, como pinças magnéticas, pinças ópticas e AFM, têm sido empregados para investigar a distorção do DNA dependente de TRF2, revelar o empilhamento colunar mediado por TRF2 da cromatina telomérica humana e observar a catálise processiva da telomerase, entre outras aplicações 35,36,37,38,39,40. Esses métodos são particularmente úteis para sondar conformações topológicas e a cinética de associação e dissociação proteína-DNA.

No entanto, a preparação de construções de molécula única com motivos repetitivos teloméricos ainda apresenta desafios, o que limita os estudos usando métodos mecânicos de molécula única. Para resolver essa limitação, desenvolvemos um método mecânico de molécula única para estudar as interações globais proteína-DNA em telômeros humanos de comprimento total41. Este método extrai diretamente o DNA telomérico das células humanas, contornando a laboriosa preparação do DNA telomérico artificial. Facilita a investigação de processos cinéticos em telômeros nativos longos abrangendo várias quilobases.

Neste protocolo, fornecemos uma descrição detalhada das etapas para sondar as interações proteína-DNA telomérico usando pinças magnéticas, uma ferramenta mecânica popular de molécula única 42,43,44. Demonstramos como expressar e purificar proteínas teloméricas, usando TRF2 como exemplo, e como preparar DNA telomérico a partir de células humanas. Além disso, mostramos como configurar um ensaio de molécula única em pinças magnéticas para estudar as interações proteína-DNA telomérico e cobrimos a análise de dados subsequente de experimentos de molécula única. Este protocolo beneficiará pesquisadores no campo da biologia dos telômeros e da descoberta de medicamentos direcionados aos telômeros.

Protocolo

1. Materiais e métodos gerais

  1. Consulte o arquivo Tabela de Materiais para obter os sais, produtos químicos, antibióticos, enzimas, anticorpos e materiais de resina usados neste protocolo.
  2. Prepare o meio líquido Luria-Bertani (LB), placas de ágar LB, tampão HEPES, eletroforese em gel de poliacrilamida SDS (SDS-PAGE), solução salina tamponada com fosfato (PBS), tampão Tris-EDTA (TE) de acordo com as receitas dos protocolos de porto de primavera fria 45,46,47,48,49,50,51,52,53.
  3. Adquira o vetor pET28a (Addgene), linhagens celulares procarióticas e eucarióticas (ATCC) por meio de fontes comerciais. Em seguida, cultive-os continuamente e passe-os em laboratório.
  4. Para grandes volumes de líquido, autoclave a 120 °C por 20 min. Para pequenos volumes, use um filtro estéril com um tamanho de poro de 0,22 μm.
  5. Ajuste o pH das soluções para o nível desejado usando HCl ou NaOH antes de levá-las aos seus volumes finais.
    NOTA: As pinças magnéticas são construídas sob medida e executadas em um ambiente do LabVIEW 2017, enquanto a análise de dados de molécula única é realizada no MATLAB 2017 2,54,55.
  6. Por razões de segurança, use jalecos de mangas compridas, luvas de nitrilo (ou luvas feitas de um material impermeável e resistente à substância), óculos ou óculos de segurança e sapatos fechados.

2. Expressão proteica e purificação de proteínas teloméricas de ligação ao DNA

  1. Realize a cultura celular e induza a expressão de proteínas.
    1. Insira a sequência de codificação para as proteínas teloméricas de ligação ao DNA (Figura 1A), TRF2 como exemplo neste caso, no vetor pET28a por digestão e ligação enzimática, com SUMO empregado como uma etiqueta de fusão. Insira entre os locais de restrição de BamHI e HindIII, produzindo o plasmídeo de pET28a-SUMO-TRF2 (Figura 1B).
    2. Transforme as células BL21 (DE3) com o plasmídeo pET28a-SUMO-TRF2.
      1. Descongelar uma alíquota de 50 μL de células BL21(DE3) competentes em gelo.
      2. Adicionar 1 μl de ADN do plasmídeo pET28a-SUMO-TRF2 (contendo 50 ng de ADN) às células competentes. Agite suavemente para misturar sem pipetar para cima e para baixo.
        NOTA: Não vórtice.
      3. Incube a mistura no gelo por 30 min.
      4. Para choque térmico, aqueça a mistura de células a 42 °C por exatamente 45 s em banho-maria. Retorne imediatamente as células ao gelo por 2 min para estabilizar as células transformadas.
      5. Adicione 950 μL de meio LB à temperatura ambiente (RT) às células para facilitar a recuperação.
      6. Incubar as células transformadas a 37 °C durante 1 h agitando a 220 rpm.
      7. Espalhar 100 μL da mistura de transformação numa placa de ágar LB contendo 50 μg/ml de canamicina (85,8 μM).
      8. Incubar as células plaqueadas durante a noite a 37 °C. Após a incubação, selecionar colônias distintas para uso na inoculação de culturas iniciais.
        NOTA: As colônias em placas podem ser armazenadas a 4 °C por até 2 semanas.
    3. Pegue uma colônia de células BL21 (DE3) transformadas e cultive-a em 5 mL de meio LB suplementado com 50 μg / mL de canamicina (85,8 μM). Incubar durante 18 h a 37 °C com agitação a 220 rpm.
    4. Para aumentar a escala, transfira 2 mL da cultura noturna para 200 mL de meio LB contendo 50 μg/mL de canamicina (85,8 μM). Continuar a incubar a 37 °C com agitação a 220 rpm até que a densidade óptica a 600 nm (OD 600) atinja 0,6-0,8.
    5. Pegue 1 mL da cultura como uma amostra de controle não induzida.
    6. Induzir a cultura restante com β-d-1-tiogalactopiranosídeo isopropílico (IPTG) até uma concentração final de 1 mM e incubar a 20 °C por 17 h para promover a expressão proteica.
    7. Execute SDS-PAGE usando um gel de empilhamento de 5% e um gel de separação de 10%. Carregue as amostras com o buffer de carregamento SDS-PAGE e execute o SDS-PAGE inicialmente a 100 V por 30 min, seguido por 120 V por 50 min em um tampão Tris-Glicina. Coloração com azul de Coomassie para visualizar a expressão da proteína (ver receitas na Tabela Suplementar 1) (Figura 1C).
      NOTA: Consulte Discussão para solução de problemas se a expressão não for observada.
  2. Purifique a proteína.
    1. Colher as células por centrifugação a 4 °C, 8500 x g durante 10 min. Descarte o sobrenadante e lave o pellet em 200 mL de PBS. Centrifugue novamente, descarte o sobrenadante e ressuspenda o pellet celular em 25 mL de tampão de lise (20 mM HEPES, 300 mM NaCl, 20 mM de imidazol, 10% de glicerol, 0,5 mM de DTT, 1 mM de fluoreto de fenilmetilsulfonilo [PMSF]).
      CUIDADO: O PMSF é corrosivo e tóxico e causa queimaduras. Use roupas de proteção adequadas, luvas e proteção para os olhos/rosto.
      NOTA: Congele a -80 °C se não prosseguir imediatamente.
    2. Adicione 5 μL de 100 mg / mL de lisozima, 5 μL de 1 U / μL DNase I e 5 μL de 10 mg / mL de RNase A às células ressuspensas.
    3. Realize a sonicação no gelo, com rajadas de 1 s a 250 W seguidas de uma pausa de 2 s, por um total de 30 min.
    4. Centrifugue a 38.000 x g, 4 °C por 40 min (30-60 min é aceitável) e filtre o sobrenadante através de um filtro de seringa de 0,22 μm.
    5. Prepare 500 mL de tampão de ligação da coluna de Ni dissolvendo 8,76 g de NaCl (concentração final de 300 mM) e 0,68 g de imidazol (concentração final de 20 mM) em HEPES de 20 mM (pH 8,0). Filtrar a solução através de um filtro de 0,22 μm.
      CUIDADO: O imidazólico é perigoso e pode causar irritação na pele e nos olhos. Também pode prejudicar o feto. Evite o contato com os olhos, pele e roupas. Não ingerir nem inalar. Use equipamento de proteção individual, incluindo proteção facial.
    6. Prepare tampões de eluição de coluna de Ni (HEPES 20 mM (pH 8,0), NaCl 300 mM) com concentrações crescentes de imidazol (100 mM, 200 mM, 300 mM e 500 mM) para eluição gradual, garantindo que todos os tampões sejam filtrados adequadamente.
    7. Carregar o sobrenadante filtrado na coluna de Ni pré-equilibrada em tampão de ligação (HEPES 20 mM (pH 8,0), NaCl 300 mM, imidazol 20 mM). Lave com tampão de ligação e elua a proteína com o gradiente de imidazol preparado, coletando 12 frações, cada uma com 1 mL ( Figura 1C ). Combine frações com >95% de pureza.
    8. Medir a concentração da proteína de fusão eluída 6xHis-sumo-TRF2 por A280 num espectrofotómetro.
    9. Para a proteína usada em ensaios de molécula única, adicione sumo protease de acordo com as instruções do fabricante (normalmente 0,125 U de protease por 2 μg de proteína de fusão) e deixe a digestão durante a noite a 4 ° C.
    10. Após o tratamento com protease de sumô, carregue a mistura de volta em uma coluna de Ni para ligar qualquer proteína de fusão não digerida e o sumô marcado com His, permitindo que a proteína TRF2 sem marca flua. Colete o fluxo.
  3. Determine a concentração de proteína e armazene a proteína.
    1. Concentrar a proteína TRF2 purificada utilizando uma unidade de filtro centrífugo de corte de 30 kDa e trocá-la por um tampão de armazenamento contendo 20 mM de HEPES (pH 8,0), 150 mM de NaCl, 0,5 mM de DTT, para reduzir a concentração de imidazol abaixo de 150 mM.
    2. Repita o processo de concentração até que o volume seja reduzido para menos de 1 mL.
    3. Analise amostras de cada etapa de purificação por SDS-PAGE para avaliar a pureza e integridade da proteína (Figura 1C).
      NOTA: A cromatografia de afinidade é usada para purificar proteínas, coletar e lavar amostras eluídas e conduzir SDS-PAGE para avaliar a integridade da proteína e garantir o controle de qualidade. Quando a cromatografia de afinidade sozinha não atende aos requisitos de pureza, a cromatografia de exclusão de tamanho é empregada para aumentar ainda mais a pureza da proteína. As curvas de absorbância UV ajudam a avaliar as frações de eluição, e o SDS-PAGE verifica a integridade da proteína, garantindo um controle de qualidade rigoroso durante todo o processo.
    4. Adicione glicerol a uma concentração final de 50% à proteína concentrada e trocada por tampão para armazenamento.
    5. Armazene a proteína a -80 °C.

3. Preparação de fragmentos de restrição telomérica humana

  1. Extraia DNA genômico.
    1. Seguindo o fluxograma (Figura 2A), centrifugue 1 x 107 células a 1000 x g por 3 min e descarte o sobrenadante. Para lavar, ressuspenda as células em 200 μL de PBS, centrifugue novamente a 1000 x g por 3 min e descarte o sobrenadante.
    2. Adicione 760 μL de tampão contendo 50 mM de Tris-HCl (pH 8,0), 100 mM de NaCl, 100 mM de EDTA e 1% de SDS ao tubo contendo 1 x 107 células e ressuspenda suavemente pipetando para evitar bolhas de ar.
      NOTA: Não vórtice.
    3. Para a digestão de proteínas e a eliminação de DNases e RNases na amostra, adicionar Proteinase K a uma concentração final de 0,5 mg/mL, correspondendo a 40 μL de uma solução estoque de 10 mg/mL. Bata no fundo do tubo para misturar (não vórtice).
    4. Incubar durante a noite a 37 °C.
    5. Adicione 265 μL de NaCl 5,4 M. Misture por 5 min invertendo o tubo cinco vezes a cada minuto e coloque no gelo por 20 min.
    6. Centrifugue na velocidade máxima (por exemplo, 16.900 x g) por 10 min em RT.
    7. Transferir o sobrenadante para um tubo de centrifugação e adicionar um volume igual de isopropanol (aproximadamente 750 μL), evitando lípidos flutuantes ou sedimentos. O DNA está no sobrenadante.
    8. Inverta o tubo cinco vezes para misturar. Confirme visualmente a presença de um pellet de DNA precipitando no tubo da centrífuga.
    9. Centrifugue em RT na velocidade máxima por 10 min.
    10. Descarte o sobrenadante. Lave o pellet de DNA com 500 μL de etanol a 70% invertendo o tubo da centrífuga cinco vezes.
      NOTA: O pellet é DNA.
    11. Centrifugue em RT na velocidade máxima (por exemplo, 16.900 x g) por 10 min.
    12. Remova cuidadosamente todo o sobrenadante, deixando o pellet de DNA. Deixe o pellet secar ao ar em RT por 5 min.
      NOTA: Evite o ressecamento, pois o DNA genômico pode se tornar difícil de dissolver.
    13. Ressuspenda o pellet de DNA em 475 μL de tampão TE (10 mM Tris-HCl [pH 8,0], 1 mM EDTA). Misture delicadamente batendo no fundo do tubo. Para a digestão do RNA durante a preparação do DNA, adicione 25 μL de 10 mg/mL de RNase A (concentração final de 0,5 mg/mL) e misture batendo suavemente até que o pellet de DNA esteja completamente dissolvido.
      NOTA: Evite o vórtice para evitar o cisalhamento do DNA.
    14. Incubar a amostra de ADN a 4 °C durante a noite.
    15. Realize uma extração de fenol trissaturado de volume igual: adicione 500 μL de fenol ao tubo da centrífuga, misture suavemente com uma pipeta e centrifugue na velocidade máxima por 10 min a 4 °C.
      CUIDADO: A exposição ao fenol pode causar irritação na pele, olhos, nariz, garganta e sistema nervoso. Evite o contato com os olhos, pele e roupas. Não ingerir nem inalar. Use equipamento de proteção individual, incluindo proteção facial.
      NOTA: O DNA está na fase aquosa superior, as proteínas estão na interfase e a fase orgânica está na parte inferior.
    16. Repita três vezes. Pegue o sobrenadante de DNA (aproximadamente 280 μL).
    17. De acordo com o volume da amostra de DNA, adicione 1/10 de volume (28 μL) de acetato de sódio 3 M (concentração final 0,3 M, pH 5,2) e 2 volumes (616 μL) de etanol 100% frio. Coloque o tubo da centrífuga a -80 °C por 2-3 h.
    18. Centrifugue na velocidade máxima (por exemplo, 16.900 x g) por 10 min a 4 °C. Descongele a solução no gelo se congelada antes da centrifugação.
    19. Descarte o sobrenadante e lave 3-4 vezes com etanol a 70% invertendo o tubo da centrífuga. Centrifugue na velocidade máxima por 5 min a 4 °C.
    20. Remova o etanol e deixe o pellet secar ao ar em RT por 5 min.
    21. Adicione 100 μL de tampão TE, bata no tubo para misturar e deixe descansar a 4 °C por 2 h para dissolver completamente.
      NOTA: Examine a integridade do DNA genômico em um gel de agarose a 1% (Figura 2B).
    22. Conservar o ADN a -20 °C no congelador. Ele permanecerá estável por pelo menos 1 ano.
  2. Realizar digestão e modificação do DNA genômico.
    1. Pegue 4 μg de DNA genômico e combine-o com 1 μL de CviAII (10 U), 2 μL de tampão de digestão 10x (consulte a Tabela Suplementar 1 para receitas) e adicione água até atingir um volume total de 20 μL. Incube a mistura a 25 ° C por 12 h.
      NOTA: FatI pode substituir CviAII, que agora foi descontinuado pela NEB.
    2. Adicione 1 μL de NdeI (20 U), 1 μL de MseI (10 U) e 1 μL de BfaI (10 U) ao mesmo tubo que contém a mistura anterior (20 μL). Além disso, adicione 2 μL de tampão de digestão 10x e 15 μL de água para atingir um volume total de 40 μL. Incube a 37 ° C por 12 h e, em seguida, inative todas as enzimas a 80 ° C por 20 min.
      NOTA: A digestão do DNA genômico pode ser examinada usando o método do Fragmento de Restrição Terminal (TRF) (Figura 2C). A combinação das quatro enzimas de restrição (CviAII, NdeI, MseI e BfaI) digere o DNA genômico em fragmentos de cerca de 800 pb e produz os TRFs com contaminação mínima do DNA subtelomérico.
    3. Para modificação da digoxigenina, pegue 40 μL do DNA genômico digerido e adicione 4 μL de 1 mM dATP (concentração final de 0,08 mM), 4 μL de 1 mM de digoxigenina-11-dUTP (concentração final de 0,08 mM), 1 μL de fragmento de Klenow (5 U), 0,5 μL de 100 mM DTT (concentração final de 1 mM) e 1 μL de tampão de digestão 10x. Incubar a 37 °C por 12 h, seguido de aquecimento a 75 °C por 20 min para inativar o fragmento de Klenow.
    4. Para a marcação de biotina, pegue 12,5 μL do DNA genômico modificado com digoxigenina (1 μg) e adicione 1 μL de sonda telomérica biotinilada de 1 μM (ou seja, 1 pmol) que são complementares à saliência telomérica de fita simples. Adicione 611,5 μL de tampão TE Li (10 mM Tris-HCl (pH 8,0), 1 mM EDTA, 50 mM LiCl) para diluir os 50 mM de íons K para 1 mM, perfazendo um volume total de 625 μL, que pode ser dividido em 16 tubos com 39 μL cada.
    5. Aqueça a 75 °C por 3 min em um termociclador e, em seguida, diminua a temperatura em 0,1 °C a cada 30 s até atingir 25 °C.
    6. Conservar as amostras de ADN a -20 °C durante, pelo menos, um ano.

4. Configurando uma célula de fluxo para amostra de DNA telomérico em pinças magnéticas

  1. Faça uma célula de fluxo para ensaios de molécula única.
    1. Use um moedor elétrico para fazer furos como entrada e saída nas lamínulas superiores (# 2 vidro de cobertura com espessura de 0,2 mm).
    2. Limpe as lamínulas em detergente por sonicação por 30 min.
    3. Lave as lamínulas com água ultrapura 3 vezes.
    4. Limpe as lamínulas em isopropanol por sonicação por 30 min.
    5. Lave as lamínulas com água ultrapura 3 vezes.
    6. Limpe as lamínulas em ultrapura por sonicação por 15-30 min.
    7. Seque as lamínulas com nitrogênio.
      NOTA: O protocolo pode ser interrompido aqui e as lamínulas limpas podem ser armazenadas para uso posterior.
    8. Cubra as lamínulas inferiores (sem furos) com 20 μL de nitrocelulose a 0,1% e adicione esferas de referência (diluição de 20x, diâmetro de 3 μm). Asse a 100 °C por 4 min.
    9. Use um bisturi para cortar espaçadores de parafilme de camada dupla de acordo com um molde de metal. O molde é uma peça retangular de liga de alumínio com as mesmas dimensões da lamínula, apresentando um centro oco para facilitar o corte do canal.
    10. Monte o sanduíche de célula de fluxo (Figura 3A). Aquecer a 85 °C e massajar com dois cotonetes até que o parafilme sele o canal.
    11. Cubra a célula de fluxo com um anticorpo. Injete 70 μL de anticorpo anti-digoxigenina (0,1 mg/mL) diretamente na célula de fluxo. Deixe em RT por 1 h.
    12. Passivize a célula de fluxo. Injete 70 μL de 10 mg / mL de BSA para deslocar o anticorpo anti-digoxigenina. Deixe em RT por 12 h. Os anticorpos antidigoxigenina não ligados serão eliminados nas etapas seguintes com lavagem rigorosa.
      NOTA: Armazene a célula de fluxo a 4 ° C por 1-2 semanas.
    13. Teste de ligação não específica lavando 5 μL de grânulos MyOne lavados (10 mg / mL) (ou 5 μL de M270 lavado (10 mg / mL)) sem DNA na célula de fluxo. Deixe por 10 min e, em seguida, lave as esferas usando um tampão de trabalho (20 mM HEPES (pH 7,5), 100 mM NaCl, 1 mM EDTA). Conte o número de contas presas à superfície em um campo de visão. Uma superfície bem tratada deve mostrar zero ou apenas alguns grânulos.
  2. Isole e imobilize as amarras de DNA telomérico em uma célula de fluxo.
    1. Pegue 10 μL de grânulos M270 (10 mg / mL) ou 5 μL de 10 mg / mL MyOne e lave-os cinco vezes com 50 μL de tampão de trabalho (20 mM HEPES [pH 7,5], 100 mM NaCl, 1 mM EDTA) usando um ímã.
    2. Pegue 500 ng de DNA genômico digerido e coloque-o em um tubo de centrífuga de 1,5 mL. Adicione todas as esferas (50 μL) em cima da amostra de DNA.
    3. Sem pipetar, agite suavemente o tubo da centrífuga algumas vezes para misturar as esferas e a amostra de DNA. Deixe a mistura no gelo por 1 h. Lave com 500 μL de tampão de trabalho três vezes usando um ímã para puxar os grânulos para baixo, com intervalos de 10 minutos entre as lavagens.
    4. Ressuspenda a amostra usando 30 μL de tampão de trabalho e carregue a mistura na célula de fluxo. Deixe por 30 min. Lave as contas magnéticas não encadernadas.
      NOTA: O DNA telomérico está amarrado entre a lamínula inferior e o cordão magnético por meio de interações de afinidade mediadas por anticorpo digoxigenina e biotina-estreptavidina ( Figura 3B ).
  3. Configure uma célula de fluxo em pinças magnéticas
    1. Limpe a célula de fluxo com etanol a 70% e seque a superfície usando lenço de lente. Coloque a célula de fluxo limpa no suporte de amostra inferior e monte cuidadosamente o suporte de amostra superior usando uma chave de fenda.
    2. Aplique uma gota de óleo de lente na superfície inferior da célula de fluxo, onde ela se alinha com a lente objetiva. Em seguida, coloque o porta-amostras em cima da lente objetiva e prenda-o com uma chave de fenda.
    3. Selecione um par de ímãs cúbicos de 5 mm dispostos em uma configuração vertical. Alinhe o suporte magnético com o eixo X do caminho de luz da pinça magnética para obter imagens.
      NOTA: Esta é uma etapa crítica. A direção do campo magnético é alinhada e, portanto, determinada pela orientação do suporte magnético.
    4. Inicie o software de programação gráfica e conecte os controladores para as pinças magnéticas. Ajuste o campo de view para localizar um cordão de referência na parte inferior da célula de fluxo e ajuste a lente objetiva ligeiramente para que o cordão de referência mostre anéis de difração claros.
    5. Mova os ímãs para o topo da célula de fluxo.
      NOTA: Esta é uma etapa crítica. Mudanças repentinas no padrão de difração do grânulo indicam que os ímãs acabaram de tocar a superfície da célula de fluxo. Esta posição é considerada o deslocamento para o ponto zero de medição.
      NOTA: Abaixe os ímãs com cuidado, começando com passos maiores e mudando gradualmente para passos menores. Mova em incrementos de 0,1 mm para evitar danificar a célula de fluxo ao se aproximar da célula de fluxo.
    6. Levante os ímãs para a posição mais alta e remova o suporte do ímã.
    7. Ligue a bomba peristáltica conectada ao frasco de resíduos e descarte o líquido. Adicione 100 μL de tampão de trabalho à entrada e defina a vazão da bomba peristáltica para 100 μL/min para encher a célula de fluxo com tampão.

5. Medições de um telômero usando pinças magnéticas de molécula única

  1. Configure a câmera.
    1. Defina a escala de cinza da câmera CMOS (semicondutor de óxido metálico complementar) com um ajuste de brilho para 150 níveis.
    2. Defina o tamanho da região de interesse (ROI).
    3. Defina a taxa de quadros para 200 Hz com um tempo de exposição de 5000 μs.
      NOTA: Esta é uma etapa crítica. Certifique-se de que o tempo morto do obturador esteja definido como zero.
    4. Mova a posição do ímã para 3 cm (aproximadamente 8 pN) e ajuste o foco da objetiva nas contas.
  2. Estabeleça a tabela de pesquisa (LUT).
    1. Mova os ímãs para uma posição correspondente a 8 pN para esticar firmemente o grânulo magnético amarrado ao DNA.
    2. Defina a LUT para 200 passos com um tamanho de passo de 0,05 μm.
    3. Use uma câmera CMOS para capturar os perfis das esferas magnéticas em diferentes posições para estabelecer a LUT.
      NOTA: Esta é uma etapa crítica. Os grânulos de poliestireno fixados na célula de fluxo servem como grânulos de referência para eliminar a deriva dos grânulos de interesse.
  3. Projete um experimento mecânico de molécula única.
    1. Escreva um script no MATLAB para controlar os movimentos motores para ensaios de rampa de força ou salto de força.
      NOTA: Esta é uma etapa crítica. Este script codifica os comandos para movimentos magnéticos. A taxa de carga de força é definida nesta etapa para um ensaio de rampa de força. Os níveis e durações dos ensaios de salto de força também são determinados aqui (Figura 4, Arquivo Suplementar 1, Arquivo Suplementar 2 e Arquivo Suplementar 3).
    2. Importe o script para o software de programação gráfica para testar os experimentos de molécula única.
    3. Verifique o total de quadros necessários para executar o experimento de molécula única e certifique-se de que a memória disponível exceda esse requisito.
      NOTA: Os dados serão perdidos se a memória alocada for menor do que o necessário, pois o salvamento de dados leva tempo.
    4. Verifique a velocidade máxima de imagem para determinar o número máximo de esferas que podem ser monitoradas simultaneamente.
      NOTA: O experimento será encerrado se o limite de velocidade de imagem for excedido.
    5. Usando um ensaio de salto de força como exemplo, execute o experimento mecânico de molécula única. As forças são aplicadas abruptamente ao grânulo magnético, que transmite essas forças à molécula de DNA, esticando-a imediatamente para cima.

6. Medições de TRF1/2 em um telômero usando pinças magnéticas

  1. Ensaio de rampa de força
    1. Usando TRF1 como exemplo, carregue 200 μL de TRF1 de 10 nM na célula de fluxo a uma taxa de fluxo lenta (por exemplo, 30 μL / min). Aguarde 30 minutos para que o TRF1 se ligue ao DNA telomérico.
    2. Escolha um script para um experimento de rampa de força com uma taxa de carregamento de força de ±1 pN/s.
    3. Nomeie os arquivos de dados adequadamente e execute o experimento. Os dados serão salvos no destino especificado para análise (Figura 5).
      NOTA: Durante este experimento, a força é linearmente aumentada e diminuída entre 0 pN e 17 pN, o que estica e relaxa o DNA telomérico e quebra as alças de DNA mediadas por TRF1/2.
  2. Ensaio de salto forçado
    1. Selecione um script para executar um ensaio de salto de força.
      NOTA: Várias forças são aplicadas para esticar o DNA telomérico, por exemplo, "Força de repouso" (Frest) a 0 pN por 40 s, "Força de teste" (Ftest) variando de 2-8 pN por 60 s, "Força alta" (Fhigh) a 10 pN por 30 s e "Força máxima" (Fmax) a 20 pN por 30 s.
    2. Nomeie os arquivos de dados adequadamente e execute o experimento. Os dados serão salvos no destino especificado para análise (Figura 5).

Resultados

A Figura 1A ilustra os domínios e estruturas esquemáticos de TRF1 e TRF2, consistindo de 439 e 542 aminoácidos, respectivamente, que podem ser expressos em células procarióticas. A preparação do TRF1 foi descrita anteriormente na literatura41. Aqui, fornecemos uma descrição abrangente e resultados representativos da preparação do TRF2. A Figura 1B mostra o mapa de plasmídeo usado para expressa...

Discussão

Este protocolo emprega pinças magnéticas para a manipulação de TRFs no nível de molécula única 57,58,59. Utilizamos esferas magnéticas para separar TRFs de fragmentos de DNA genômico. Após a digestão por restrição, os TRFs se ligam às esferas magnéticas, permitindo sua fácil separação dos fragmentos de DNA genômico. Essa abordagem permite a manipulação usando pinças magnét...

Divulgações

Os autores declaram não haver interesses financeiros concorrentes ou outros conflitos de interesse.

Agradecimentos

Este trabalho foi apoiado pela Fundação Nacional de Ciências Naturais da China [Grant 32071227 to Z.Y.], Fundação Municipal de Ciências Naturais de Tianjin da China (22JCYBJC01070 a Z.Y.) e State Key Laboratory of Precision Measuring Technology and Instruments (Universidade de Tianjin) [Grant pilab2210 to Z.Y.].

Materiais

NameCompanyCatalog NumberComments
Anti-DigoxigeninRoche11214667001
BfaINew England Biolab (NEB)R0568S
BSASigma-AldrichV900933
CMOS camera MikrotronMC1362
CviAIINew England Biolab (NEB)R0640S
DIG-11-dUTPJena BioscienceNU-803-DIGXL
DNA extraction solutionG-CLONEEX0108
Dnase I, Rnase-Free, Hc EaThermo Fisher ScientificEN0523
dNTP mixtureNanjing Vazyme Biotech Co., Ltd (Vazyme)P032-02
DTTSolarbioD1070
Dynabeads M-270  beadsThermo Fisher Scientific65305Streptavidin beads
Dynabeads MyOne beadsThermo Fisher Scientific65001Streptavidin beads
EthanolTianjin No.6 Chemical Reagent Factory1083
GlycerolBeijing Hwrkchemical Co,. LtdSMG66258-1
ImidazoleSolarbioII0070
IPTGSolarbioI8070
IsopropanolTianjin No.6 Chemical Reagent FactoryA1079
KanamycinThermo Fisher ScientificEN0523
Klenow fragment (3′-5′ exo-)New England Biolab (NEB)M0212S
LabViewNational Instrumentshttps://www.ni.com/en-us/shop/product/labview.htmlGraphical programming software 
LiClBide Pharmatech Co., Ltd (bidepharm)BD136449
LysozymeSolarbioL8120-5
MseINew England Biolab (NEB)R0525S
NaClShanghai AladdinC111533
NanoDropThermo Fisher ScientificSpectrophotometer
NdeINew England Biolab (NEB)R0111S
Ni NTA Beads 6FFChangzhou Smart-Lifesciences Biotechnology Co.,LtdSA005025
Nitrocellulose membraneABclonalRM02801
PMSFSolarbioP8340
Proteinase KBeyotime Biotech Inc (beyotime)ST535-500mg
rCutSmart BufferNew England Biolab (NEB)B6004S
Rnase ASigma-AldrichR4875
Sodium acetateSERVA Electrophoresis GmbH2124902
Sumo proteaseBeyotime Biotech Inc (beyotime)P2312M

Referências

  1. Blackburn, E. H., Epel, E. S., Lin, J. Human telomere biology: A contributory and interactive factor in aging, disease risks, and protection. Science. 350 (6265), 1193-1198 (2015).
  2. Li, N., et al. The dynamics of forming a triplex in an artificial telomere inferred by DNA mechanics. Nucleic Acids Res. 47 (15), e86 (2019).
  3. Yu, Z., et al. Click chemistry assisted single-molecule fingerprinting reveals a 3d biomolecular folding funnel. J Am Chem Soc. 134 (30), 12338-12341 (2012).
  4. Karimian, K., et al. Human telomere length is chromosome end-specific and conserved across individuals. Science. 384 (6695), 533-539 (2024).
  5. Maciejowski, J., De Lange, T. Telomeres in cancer: Tumour suppression and genome instability. Nat Rev Mol Cell Biol. 18 (3), 175-186 (2017).
  6. Kinzig, C. G., Zakusilo, G., Takai, K. K., Myler, L. R., De Lange, T. Atr blocks telomerase from converting DNA breaks into telomeres. Science. 383 (6684), 763-770 (2024).
  7. Takai, H., Aria, V., Borges, P., Yeeles, J. T. P., De Lange, T. Cst-polymerase α-primase solves a second telomere end-replication problem. Nature. 627 (8004), 664-670 (2024).
  8. De Lange, T. How telomeres solve the end-protection problem. Science. 326 (5955), 948-952 (2009).
  9. De Lange, T. Shelterin-mediated telomere protection. Annual Review of Genetics. 52 (1), 223-247 (2018).
  10. Liu, B., et al. Structure of active human telomerase with telomere shelterin protein TPP1. Nature. 604 (7906), 578-583 (2022).
  11. Sfeir, A., De Lange, T. Removal of shelterin reveals the telomere end-protection problem. Science. 336 (6081), 593-597 (2012).
  12. Sarek, G., et al. Cdk phosphorylation of trf2 controls t-loop dynamics during the cell cycle. Nature. 575 (7783), 523-527 (2019).
  13. Myler, L. R., et al. DNA-PK and the TRF2 IDDR inhibit MRN-initiated resection at leading-end telomeres. Nat Struct Mol Biol. 30 (9), 1346-1356 (2023).
  14. Hanaoka, S., Nagadoi, A., Nishimura, Y. Comparison between TRF2 and TRF1 of their telomeric DNA-bound structures and DNA-binding activities. Protein Sci. 14 (1), 119-130 (2005).
  15. Chen, Y., et al. A shared docking motif in TRF1 and TRF2 used for differential recruitment of telomeric proteins. Science. 319 (5866), 1092-1096 (2008).
  16. Wan, B., et al. SLX4 assembles a telomere maintenance toolkit by bridging multiple endonucleases with telomeres. Cell Reports. 4 (5), 861-869 (2013).
  17. Rai, R., et al. NBS1 phosphorylation status dictates repair choice of dysfunctional telomeres. Molecular Cell. 65 (5), 801-817.e4 (2017).
  18. Benarroch-Popivker, D., et al. Trf2-mediated control of telomere DNA topology as a mechanism for chromosome-end protection. Mol Cell. 61 (2), 274-286 (2016).
  19. Poulet, A., et al. The n-terminal domains of TRF1 and TRF2 regulate their ability to condense telomeric DNA. Nucleic Acids Res. 40 (6), 2566-2576 (2012).
  20. Schmutz, I., Timashev, L., Xie, W., Patel, D. J., De Lange, T. TRF2 binds branched DNA to safeguard telomere integrity. Nat Struct Mol Biol. 24 (9), 734-742 (2017).
  21. Doksani, Y., Wu, J. Y., De Lange, T., Zhuang, X. Super-resolution fluorescence imaging of telomeres reveals TRF2-dependent t-loop formation. Cell. 155 (2), 345-356 (2013).
  22. Di Maro, S., et al. Shading the TRF2 recruiting function: A new horizon in drug development. J Am Chem Soc. 136 (48), 16708-16711 (2014).
  23. Gao, J., Pickett, H. A. Targeting telomeres: Advances in telomere maintenance mechanism-specific cancer therapies. Nat Rev Cancer. 22 (9), 515-532 (2022).
  24. Bejarano, L., et al. Inhibition of TRF1 telomere protein impairs tumor initiation and progression in glioblastoma mouse models and patient-derived xenografts. Cancer Cell. 32 (5), 590-607.e4 (2017).
  25. Chen, X., et al. Cyclic peptidic mimetics of apollo peptides targeting telomeric repeat binding factor 2 (TRF2) and apollo interaction. ACS Med Chem Lett. 9 (5), 507-511 (2018).
  26. Erdel, F., et al. Telomere recognition and assembly mechanism of mammalian shelterin. Cell Rep. 18 (1), 41-53 (2017).
  27. Pendlebury, D. F., et al. Dissecting the telomere-inner nuclear membrane interface formed in meiosis. Nat Struct Mol Biol. 24 (12), 1064-1072 (2017).
  28. Court, R., Chapman, L., Fairall, L., Rhodes, D. How the human telomeric proteins trf1 and trf2 recognize telomeric DNA: A view from high-resolution crystal structures. EMBO Rep. 6 (1), 39-45 (2005).
  29. Hu, H., et al. Structural basis of telomeric nucleosome recognition by shelterin factor trf1. Sci Adv. 9 (34), eadi4148 (2023).
  30. Nurk, S., et al. The complete sequence of a human genome. Science. 376 (6588), 44-53 (2022).
  31. Rhie, A., et al. The complete sequence of a human y chromosome. Nature. 621 (7978), 344-354 (2023).
  32. Chang, T. R., Long, X., Shastry, S., Parks, J. W., Stone, M. D. Single-molecule mechanical analysis of strand invasion in human telomere DNA. Biochemistry. 61 (15), 1554-1560 (2022).
  33. Kaur, P., et al. TIN2 is an architectural protein that facilitates TRF2-mediated trans- and cis-interactions on telomeric DNA. Nucleic Acids Res. 49 (22), 13000-13018 (2021).
  34. Parks, J. W., Stone, M. D. Single-molecule studies of telomeres and telomerase. Annu Rev Biophys. 46, 357-377 (2017).
  35. Zhao, X., et al. Exploring TRF2-dependent DNA distortion through single-DNA manipulation studies. Commun Biol. 7 (1), 148 (2024).
  36. Patrick, E. M., Slivka, J. D., Payne, B., Comstock, M. J., Schmidt, J. C. Observation of processive telomerase catalysis using high-resolution optical tweezers. Nat Chem Biol. 16 (7), 801-809 (2020).
  37. Soman, A., et al. Columnar structure of human telomeric chromatin. Nature. 609 (7929), 1048-1055 (2022).
  38. Jansson, L. I., et al. Telomere DNA G-quadruplex folding within actively extending human telomerase. Proc Natl Acad Sci U S A. 116 (19), 9350-9359 (2019).
  39. Soranno, A., et al. Shelterin components modulate nucleic acids condensation and phase separation in the context of telomeric DNA. J Mol Biol. 434 (16), 167685 (2022).
  40. Wong, S. Y., et al. The shelterin component TRF2 mediates columnar stacking of human telomeric chromatin. EMBO J. 43 (1), 87-111 (2024).
  41. Li, X., et al. Dynamics of TRF1 organizing a single human telomere. Nucleic Acids Res. 49 (2), 760-775 (2021).
  42. You, H., Le, S., Chen, H., Qin, L., Yan, J. Single-molecule manipulation of g-quadruplexes by magnetic tweezers. J Vis Exp. (127), e56328 (2017).
  43. Lipfert, J., Lee, M., Ordu, O., Kerssemakers, J. W., Dekker, N. H. Magnetic tweezers for the measurement of twist and torque. J Vis Exp. (87), e51503 (2014).
  44. Ma, K., et al. A DNA force circuit for exploring protein-protein interactions at the single-molecule level. Chinese Journal of Chemistry. 42 (13), 1456-1464 (2024).
  45. . LB liquid medium. Cold Spring Harb Protoc. 2016 (9), (2016).
  46. . LB agar plates. Cold Spring Harb Protoc. 2024 (4), (2024).
  47. . HEPES buffer. Cold Spring Harb Protoc. 2010 (7), (2010).
  48. . SDS-PAGE gel. Cold Spring Harb Protoc. 2015 (7), (2015).
  49. . 10x PBS. Cold Spring Harb Protoc. 2007 (4), (2007).
  50. . TE buffer (1x). Cold Spring Harb Protoc. 2016 (5), (2016).
  51. Green, M. R., Sambrook, J. Buffers. Cold Spring Harb Protoc. 2018 (2), (2018).
  52. . Tris buffer (1 M, pH 7.5). Cold Spring Harbor Protocols. 2011 (2), (2011).
  53. . EDTA. Cold Spring Harbor Protocols. 2006 (1), (2006).
  54. Yu, Z., et al. A force calibration standard for magnetic tweezers. Rev Sci Instrum. 85 (12), 123114 (2014).
  55. Wang, Z., et al. Reading time and DNA sequence preference of TET3 CXXC domain revealed by single-molecule profiling. Chinese J Chem. 41 (10), 1177-1184 (2023).
  56. Kimura, M., et al. Measurement of telomere length by the southern blot analysis of terminal restriction fragment lengths. Nat Protoc. 5 (9), 1596-1607 (2010).
  57. Dulin, D., et al. High spatiotemporal-resolution magnetic tweezers: Calibration and applications for DNA dynamics. Biophys J. 109 (10), 2113-2125 (2015).
  58. Lipfert, J., Hao, X., Dekker, N. H. Quantitative modeling and optimization of magnetic tweezers. Biophys J. 96 (12), 5040-5049 (2009).
  59. Te Velthuis, A. J., Kerssemakers, J. W., Lipfert, J., Dekker, N. H. Quantitative guidelines for force calibration through spectral analysis of magnetic tweezers data. Biophys J. 99 (4), 1292-1302 (2010).
  60. Cnossen, J. P., Dulin, D., Dekker, N. H. An optimized software framework for real-time, high-throughput tracking of spherical beads. Rev Sci Instrum. 85 (10), 103712 (2014).
  61. Green, M. R., Sambrook, J. Cloning and transformation with plasmid vectors. Cold Spring Harb Protoc. 2021 (11), (2021).
  62. Haneskog, L. Purification of histidine-tagged proteins using stepwise elution with imidazole. Cold Spring Harb Protoc. 2006 (1), (2006).

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