Analisando interações proteína-DNA telomérico usando pinças magnéticas de molécula única

Resumo

Este protocolo demonstra o uso de pinças magnéticas de molécula única para estudar as interações entre proteínas teloméricas de ligação ao DNA (Telomere Repeat-binding Factor 1 [TRF1] e TRF2) e telômeros longos extraídos de células humanas. Ele descreve as etapas preparatórias para telômeros e fatores de ligação de repetição teloméricos, a execução de experimentos de molécula única e os métodos de coleta e análise de dados.

Resumo

Os telômeros, as estruturas protetoras nas extremidades dos cromossomos, são cruciais para manter a longevidade celular e a estabilidade do genoma. Sua função adequada depende de processos rigidamente regulados de replicação, alongamento e resposta a danos. O complexo shelterina, especialmente o fator de ligação à repetição dos telômeros 1 (TRF1) e TRF2, desempenha um papel fundamental na proteção dos telômeros e emergiu como um potencial alvo anticâncer para a descoberta de medicamentos. Essas proteínas se ligam ao motivo repetitivo do DNA telomérico TTAGGG, facilitando a formação de estruturas protetoras e o recrutamento de outras proteínas teloméricas. Métodos estruturais e técnicas avançadas de imagem forneceram insights sobre as interações proteína-DNA telomérica, mas sondar os processos dinâmicos requer abordagens de molécula única. Ferramentas como pinças magnéticas, pinças ópticas e microscopia de força atômica (AFM) têm sido empregadas para estudar as interações proteína-DNA telomérico, revelando detalhes importantes, como distorção do DNA dependente de TRF2 e catálise da telomerase. No entanto, a preparação de construções de molécula única com motivos repetitivos teloméricos continua a ser uma tarefa desafiadora, potencialmente limitando a amplitude de estudos que utilizam métodos mecânicos de molécula única. Para resolver isso, desenvolvemos um método para estudar interações usando DNA telomérico humano de comprimento total com pinças magnéticas. Este protocolo descreve como expressar e purificar o TRF2, preparar o DNA telomérico, configurar ensaios mecânicos de molécula única e analisar dados. Este guia detalhado beneficiará pesquisadores em biologia de telômeros e descoberta de medicamentos direcionados a telômeros.

Introdução

Os telômeros são estruturas protetoras nas extremidades dos cromossomos ^1,2,3. A erosão dos telômeros durante a divisão celular leva à senescência e envelhecimento celular, enquanto o alongamento anormal dos telômeros contribui para o câncer ^4,5. Para que os telômeros funcionem adequadamente, sua replicação, alongamento e respostas a danos devem ser altamente regulados ^6,7,8. A shelterina, co....

Protocolo

1. Materiais e métodos gerais

1. Consulte o arquivo Tabela de Materiais para obter os sais, produtos químicos, antibióticos, enzimas, anticorpos e materiais de resina usados neste protocolo.
2. Prepare o meio líquido Luria-Bertani (LB), placas de ágar LB, tampão HEPES, eletroforese em gel de poliacrilamida SDS (SDS-PAGE), solução salina tamponada com fosfato (PBS), tampão Tris-EDTA (TE) de acordo com as receitas dos protocolos de porto de primavera fria 45,46,47,48,49,50,51,52,53.

Discussão

Este protocolo emprega pinças magnéticas para a manipulação de TRFs no nível de molécula única 57,58,59. Utilizamos esferas magnéticas para separar TRFs de fragmentos de DNA genômico. Após a digestão por restrição, os TRFs se ligam às esferas magnéticas, permitindo sua fácil separação dos fragmentos de DNA genômico. Essa abordagem permite a manipulação usando pinças magnét.......

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anti-Digoxigenin	Roche	11214667001
BfaI	New England Biolab (NEB)	R0568S
BSA	Sigma-Aldrich	V900933
CMOS camera	Mikrotron	MC1362
CviAII	New England Biolab (NEB)	R0640S
DIG-11-dUTP	Jena Bioscience	NU-803-DIGXL
DNA extraction solution	G-CLONE	EX0108
Dnase I, Rnase-Free, Hc Ea	Thermo Fisher Scientific	EN0523
dNTP mixture	Nanjing Vazyme Biotech Co., Ltd (Vazyme)	P032-02
DTT	Solarbio	D1070
Dynabeads M-270  beads	Thermo Fisher Scientific	65305	Streptavidin beads
Dynabeads MyOne beads	Thermo Fisher Scientific	65001	Streptavidin beads
Ethanol	Tianjin No.6 Chemical Reagent Factory	1083
Glycerol	Beijing Hwrkchemical Co,. Ltd	SMG66258-1
Imidazole	Solarbio	II0070
IPTG	Solarbio	I8070
Isopropanol	Tianjin No.6 Chemical Reagent Factory	A1079
Kanamycin	Thermo Fisher Scientific	EN0523
Klenow fragment (3′-5′ exo-)	New England Biolab (NEB)	M0212S
LabView	National Instruments	https://www.ni.com/en-us/shop/product/labview.html	Graphical programming software
LiCl	Bide Pharmatech Co., Ltd (bidepharm)	BD136449
Lysozyme	Solarbio	L8120-5
MseI	New England Biolab (NEB)	R0525S
NaCl	Shanghai Aladdin	C111533
NanoDrop	Thermo Fisher Scientific		Spectrophotometer
NdeI	New England Biolab (NEB)	R0111S
Ni NTA Beads 6FF	Changzhou Smart-Lifesciences Biotechnology Co.,Ltd	SA005025
Nitrocellulose membrane	ABclonal	RM02801
PMSF	Solarbio	P8340
Proteinase K	Beyotime Biotech Inc (beyotime)	ST535-500mg
rCutSmart Buffer	New England Biolab (NEB)	B6004S
Rnase A	Sigma-Aldrich	R4875
Sodium acetate	SERVA Electrophoresis GmbH	2124902
Sumo protease	Beyotime Biotech Inc (beyotime)	P2312M