Single-Molecule Magnetic Tweezers를 사용한 텔로머 단백질-DNA 상호 작용 분석

요약

이 프로토콜은 단일 분자 자기 핀셋을 사용하여 텔로미어 DNA 결합 단백질(텔로미어 반복 결합 인자 1[TRF1] 및 TRF2)과 인간 세포에서 추출한 긴 텔로미어 간의 상호 작용을 연구하는 방법을 보여줍니다. 텔로미어 및 텔로메릭 반복 결합 인자에 대한 준비 단계, 단일 분자 실험의 실행, 데이터 수집 및 분석 방법에 대해 설명합니다.

초록

염색체 끝에 있는 보호 구조인 텔로미어는 세포의 수명과 게놈 안정성을 유지하는 데 매우 중요합니다. 그들의 적절한 기능은 복제, 신장 및 손상 반응의 엄격하게 조절된 과정에 달려 있습니다. 쉘터린 복합체, 특히 텔로미어 반복결합인자 1(TRF1)과 TRF2는 텔로미어 보호에 중추적인 역할을 하며 신약 개발을 위한 잠재적인 항암 타겟으로 부상하고 있습니다. 이 단백질은 반복적인 텔로머 DNA 모티프 TTAGGG에 결합하여 보호 구조의 형성과 다른 텔로머 단백질의 모집을 촉진합니다. 구조적 방법과 고급 이미징 기술은 텔로머 단백질-DNA 상호 작용에 대한 통찰력을 제공했지만, 동적 과정을 조사하려면 단일 분자 접근 방식이 필요합니다. 자기 핀셋, 광학 핀셋 및 원자력 현미경(AFM)과 같은 도구를 사용하여 텔로머 단백질-DNA 상호 작용을 연구하여 TRF2 의존성 DNA 왜곡 및 텔로머라아제 촉매와 같은 중요한 세부 사항을 밝힙니다. 그러나 텔로메릭 반복 모티프를 가진 단일 분자 구조를 준비하는 것은 계속해서 어려운 작업이며, 잠재적으로 단일 분자 기계적 방법을 활용하는 연구의 폭을 제한할 수 있습니다. 이 문제를 해결하기 위해 우리는 자기 핀셋으로 전신 인간 텔로머 DNA를 사용하여 상호 작용을 연구하는 방법을 개발했습니다. 이 프로토콜은 TRF2를 발현 및 정제하고, 텔로머 DNA를 준비하고, 단일 분자 기계적 분석을 설정하고, 데이터를 분석하는 방법을 설명합니다. 이 자세한 가이드는 텔로미어 생물학 및 텔로미어 표적 약물 발견 연구자들에게 도움이 될 것입니다.

서문

텔로미어는 ^1,2,3번 염색체의 끝에 있는 보호 구조입니다. 세포 분열 중 텔로미어 침식은 세포 노화와 노화를 유발하며, 텔로미어의 비정상적인 신장은 암을 유발합니다 ^4,5. 텔로미어가 제대로 기능하기 위해서는 텔로미어의 복제, 신장 및 손상 반응이 고도로 조절되어야 합니다 ^6,7,8. 6개의 소단위로 구성된 쉘터린(Shelterin)은 텔로미어 보호에 중심적인 역할을 한다 ^9,10,11. 텔로미어에 대한 더 깊은 이해는 텔로미어 생물학에 대한 귀중한 통찰력을 제공할 것입니다.

쉘틴의....

프로토콜

1. 일반 재료 및 방법

1. 이 프로토콜에 사용된 염, 화학 물질, 항생제, 효소, 항체 및 수지 재료에 대해서는 Table of Materials 파일을 참조하십시오.
2. 콜드 스프링 하버 프로토콜 45,46,47,48,49,50,51,52,53의 조리법에 따라 Luria-Bertani(LB) 액체 매체, LB 한천 플레이트, HEPES 완충액, SDS 폴리아크릴아미드 겔 전기영동(SDS-PAGE), 인산염 완충 식염수(PBS), Tris-EDTA(TE) 완충액을 준비합니다.
3. 상용 소스를 통....

토론

이 프로토콜은 단일 분자 수준 57,58,59에서 TRF의 조작을 위해 자기 핀셋을 사용합니다. 우리는 게놈 DNA 단편에서 TRF를 분리하기 위해 자성 비드를 사용합니다. 제한 분해 후 TRF는 마그네틱 비드에 결합하여 게놈 DNA 단편에서 쉽게 분리할 수 있습니다. 이 접근 방식은 투명도 문제로 인해 제한되는 광학 ?.......

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anti-Digoxigenin	Roche	11214667001
BfaI	New England Biolab (NEB)	R0568S
BSA	Sigma-Aldrich	V900933
CMOS camera	Mikrotron	MC1362
CviAII	New England Biolab (NEB)	R0640S
DIG-11-dUTP	Jena Bioscience	NU-803-DIGXL
DNA extraction solution	G-CLONE	EX0108
Dnase I, Rnase-Free, Hc Ea	Thermo Fisher Scientific	EN0523
dNTP mixture	Nanjing Vazyme Biotech Co., Ltd (Vazyme)	P032-02
DTT	Solarbio	D1070
Dynabeads M-270  beads	Thermo Fisher Scientific	65305	Streptavidin beads
Dynabeads MyOne beads	Thermo Fisher Scientific	65001	Streptavidin beads
Ethanol	Tianjin No.6 Chemical Reagent Factory	1083
Glycerol	Beijing Hwrkchemical Co,. Ltd	SMG66258-1
Imidazole	Solarbio	II0070
IPTG	Solarbio	I8070
Isopropanol	Tianjin No.6 Chemical Reagent Factory	A1079
Kanamycin	Thermo Fisher Scientific	EN0523
Klenow fragment (3′-5′ exo-)	New England Biolab (NEB)	M0212S
LabView	National Instruments	https://www.ni.com/en-us/shop/product/labview.html	Graphical programming software
LiCl	Bide Pharmatech Co., Ltd (bidepharm)	BD136449
Lysozyme	Solarbio	L8120-5
MseI	New England Biolab (NEB)	R0525S
NaCl	Shanghai Aladdin	C111533
NanoDrop	Thermo Fisher Scientific		Spectrophotometer
NdeI	New England Biolab (NEB)	R0111S
Ni NTA Beads 6FF	Changzhou Smart-Lifesciences Biotechnology Co.,Ltd	SA005025
Nitrocellulose membrane	ABclonal	RM02801
PMSF	Solarbio	P8340
Proteinase K	Beyotime Biotech Inc (beyotime)	ST535-500mg
rCutSmart Buffer	New England Biolab (NEB)	B6004S
Rnase A	Sigma-Aldrich	R4875
Sodium acetate	SERVA Electrophoresis GmbH	2124902
Sumo protease	Beyotime Biotech Inc (beyotime)	P2312M