Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Bu protokol, telomerik DNA bağlayıcı proteinler (Telomer Tekrar Bağlama Faktörü 1 [TRF1] ve TRF2) ile insan hücrelerinden ekstrakte edilen uzun telomerler arasındaki etkileşimleri incelemek için tek moleküllü manyetik cımbızların kullanılmasını göstermektedir. Telomerler ve telomerik tekrar bağlama faktörleri için hazırlık adımlarını, tek moleküllü deneylerin yürütülmesini ve veri toplama ve analiz yöntemlerini açıklar.

Özet

Kromozomların uçlarındaki koruyucu yapılar olan telomerler, hücresel uzun ömürlülüğü ve genom stabilitesini korumak için çok önemlidir. Düzgün işlevleri, sıkı bir şekilde düzenlenmiş çoğaltma, uzama ve hasar tepkisi süreçlerine bağlıdır. Shelterin kompleksi, özellikle Telomer Tekrar Bağlama Faktörü 1 (TRF1) ve TRF2, telomer korumasında çok önemli bir rol oynar ve ilaç keşfi için potansiyel bir anti-kanser hedefi olarak ortaya çıkmıştır. Bu proteinler, tekrarlayan telomerik DNA motifi TTAGGG'ye bağlanarak koruyucu yapıların oluşumunu ve diğer telomerik proteinlerin toplanmasını kolaylaştırır. Yapısal yöntemler ve ileri görüntüleme teknikleri, telomerik protein-DNA etkileşimleri hakkında bilgi sağlamıştır, ancak dinamik süreçleri araştırmak tek moleküllü yaklaşımlar gerektirir. Telomerik protein-DNA etkileşimlerini incelemek için manyetik cımbız, optik cımbız ve atomik kuvvet mikroskobu (AFM) gibi araçlar kullanılmış ve TRF2'ye bağlı DNA distorsiyonu ve telomeraz katalizi gibi önemli ayrıntıları ortaya çıkarmıştır. Bununla birlikte, telomerik tekrarlayan motiflerle tek moleküllü yapıların hazırlanması, tek moleküllü mekanik yöntemleri kullanan çalışmaların genişliğini potansiyel olarak sınırlayan zorlu bir görev olmaya devam etmektedir. Bunu ele almak için, manyetik cımbızla tam uzunlukta insan telomerik DNA'sını kullanarak etkileşimleri incelemek için bir yöntem geliştirdik. Bu protokol, TRF2'nin nasıl eksprese edileceğini ve saflaştırılacağını, telomerik DNA'nın nasıl hazırlanacağını, tek moleküllü mekanik tahlillerin nasıl kurulacağını ve verilerin nasıl analiz edileceğini açıklar. Bu ayrıntılı kılavuz, telomer biyolojisi ve telomer hedefli ilaç keşfi konusunda araştırmacılara fayda sağlayacaktır.

Giriş

Telomerler,kromozom 1,2,3'ün uçlarındaki koruyucu yapılardır. Hücre bölünmesi sırasında telomer erozyonu hücre yaşlanmasına ve yaşlanmaya yol açarken, telomerlerin anormal uzaması kansere katkıda bulunur 4,5. Telomerlerin düzgün çalışması için replikasyonları, uzamaları ve hasar tepkileri yüksek düzeyde düzenlenmelidir 6,7,8. Altı alt birimden oluşan shelterin, telomer korumasında merkezi bir rol oynar 9,10,11. Telomerlerin daha derin bir şekilde anlaşılması, telomer biyolojisi hakkında değerli bilgiler sağlayacaktır.

Shelterinin temel alt birimleri olan TRF1 ve TRF2, telomerik bağlayıcı proteinlerdir12,13. Hem TRF1 hem de TRF2, Myb alanları14 aracılığıyla telomerlerdeki tekrarlayan DNA motifi TTAGGG'ye bağlanır. Telomerik çift sarmallı DNA'yı çevrelemelerine ve telomerik proteinleritoplamalarına izin veren ortak TRFH alanları aracılığıyla dimerler oluştururlar 15,16,17,18,19. TRF2, telomerik D-döngülerinin ve T-döngülerinin oluşumu için özellikle önemlidir20,21. Telomer korumasındaki önemli rolleri nedeniyle, TRF1 ve TRF2 potansiyel anti-kanser ilaç hedefleri olarak ortaya çıkmıştır 22,23,24,25.

Telomerlerdeki protein-DNA etkileşimlerini araştırmak için önemli çabalar sarf edilmiştir. Bağlanma afinitelerini incelemek için Elektroforetik Hareketlilik Kaydırma Testi (EMSA) ve Yüzey Plazmon Rezonansı (SPR) gibi biyokimyasal yöntemler kullanılmıştır20,26. DNA ile kompleks oluşturan telomerik bağlayıcı proteinlerin çok sayıda yapısı, kriyo-elektron mikroskobu (kriyo-EM), X-ışını kristalografisi ve nükleer manyetik rezonans (NMR) kullanılarak aydınlatılmıştır27,28,29. Stokastik optik rekonstrüksiyon mikroskobu (STORM) gibi süper çözünürlüklü görüntüleme teknikleri, TRF2'ye bağlı T-döngü oluşumunu ortaya çıkarmıştır21. Son zamanlarda, telomerik dizileri 4,30,31 profillemek için nanopor dizilimi geliştirilmiştir. Bu yapısal içgörüler, telomerik protein-DNA etkileşimleri hakkındaki anlayışımızı büyük ölçüde geliştirmiştir. Telomerik protein-DNA etkileşimlerinin dinamiklerini daha fazla araştırmak için yeni teknolojilerin geliştirilmesi esastır.

Tek moleküllü araçlar, telomer32,33,34'teki protein-DNA etkileşimlerini keşfetmek için güçlü tekniklerdir. Manyetik cımbız, optik cımbız ve AFM gibi tek moleküllü mekanik yöntemler, TRF2'ye bağımlı DNA distorsiyonunu araştırmak, insan telomerik kromatininin TRF2 aracılı sütunlu istiflenmesini ortaya çıkarmak ve diğer uygulamaların yanı sıra işlemsel telomeraz katalizini gözlemlemek için kullanılmıştır 35,36,37,38,39,40. Bu yöntemler özellikle topolojik konformasyonları ve protein-DNA birleşmesi ve ayrışma kinetiğini araştırmak için kullanışlıdır.

Bununla birlikte, telomerik tekrarlayan motiflerle tek moleküllü yapıların hazırlanması, tek moleküllü mekanik yöntemler kullanan çalışmaları sınırlayan zorluklar ortaya çıkarmaktadır. Bu sınırlamayı ele almak için, tam uzunlukta insan telomerleri41 üzerindeki küresel protein-DNA etkileşimlerini incelemek için tek moleküllü bir mekanik yöntem geliştirdik. Bu yöntem, yapay telomerik DNA'nın zahmetli hazırlanmasını atlatarak insan hücrelerinden doğrudan telomerik DNA'yı çıkarır. Birkaç kilobaza yayılan uzun doğal telomerler üzerindeki kinetik süreçlerin araştırılmasını kolaylaştırır.

Bu protokolde, popüler bir tek moleküllü mekanik aletolan manyetik cımbız kullanarak telomerik protein-DNA etkileşimlerini araştırmak için adımların ayrıntılı bir açıklamasını sunuyoruz 42,43,44. Örnek olarak TRF2 kullanarak telomerik proteinlerin nasıl ifade edileceğini ve saflaştırılacağını ve insan hücrelerinden telomerik DNA'nın nasıl hazırlanacağını gösteriyoruz. Ek olarak, telomerik protein-DNA etkileşimlerini incelemek için manyetik cımbız üzerinde tek moleküllü bir testin nasıl kurulacağını gösteriyoruz ve tek moleküllü deneylerin sonraki veri analizini ele alıyoruz. Bu protokol, telomer biyolojisi ve telomer hedefli ilaç keşfi alanındaki araştırmacılara fayda sağlayacaktır.

Protokol

1. Genel materyal ve yöntemler

  1. Bu protokolde kullanılan tuzlar, kimyasallar, antibiyotikler, enzimler, antikorlar ve reçine malzemeleri için Malzeme Tablosu dosyasına bakın.
  2. Luria-Bertani (LB) sıvı ortamı, LB agar plakaları, HEPES tamponu, SDS poliakrilamid jel elektroforezi (SDS-PAGE), Fosfat tamponlu salin (PBS), Tris-EDTA (TE) tamponunu soğuk kaplıca limanı protokolleri 45,46,47,48,49,50,51,52,53.
  3. Ticari kaynaklardan pET28a vektörünü (Addgene), prokaryotik ve ökaryotik hücre hatlarını (ATCC) edinin. Daha sonra bunları sürekli olarak kültürleyin ve laboratuvarda geçirin.
  4. Büyük hacimli sıvılar için 120 °C'de 20 dakika otoklavlayın. Küçük hacimler için 0,22 μm gözenek boyutuna sahip steril bir filtre kullanın.
  5. Çözeltileri nihai hacimlerine getirmeden önce HCl veya NaOH kullanarak pH'ı istenen seviyeye ayarlayın.
    NOT: Manyetik cımbızlar özel olarak üretilmiştir ve LabVIEW 2017 ortamında çalıştırılır, tek moleküllü veri analizi ise MATLAB 2017 2,54,55'te gerçekleştirilir.
  6. Güvenlik nedeniyle, uzun kollu laboratuvar önlükleri, nitril eldivenler (veya geçirimsiz ve maddeye dayanıklı bir malzemeden yapılmış eldivenler), koruyucu gözlükler veya gözlükler ve kapalı burunlu ayakkabılar giyin.

2. Protein ekspresyonu ve telomerik DNA bağlayıcı proteinlerin saflaştırılması

  1. Hücre kültürü yapın ve protein ekspresyonunu indükleyin.
    1. Telomerik DNA bağlayıcı proteinler için kodlama dizisini (Şekil 1A), bu durumda örnek olarak TRF2'yi, bir füzyon etiketi olarak SUMO ile enzim sindirimi ve ligasyonu yoluyla pET28a vektörüne yerleştirin. BamHI ve HindIII'ün kısıtlama bölgeleri arasına yerleştirin ve pET28a-SUMO-TRF2'nin plazmidini verin (Şekil 1B).
    2. BL21(DE3) hücrelerini pET28a-SUMO-TRF2 plazmidi ile dönüştürün.
      1. 50 μL'lik bir yetkin BL21 (DE3) hücresi alikotunu buz üzerinde çözün.
      2. Yetkili hücrelere pET28a-SUMO-TRF2 plazmidinin (50 ng DNA içeren) 1 μL DNA'sını ekleyin. Yukarı ve aşağı pipetlemeden karıştırmak için hafifçe döndürün.
        NOT: Girdap yapmayın.
      3. Karışımı buz üzerinde 30 dakika inkübe edin.
      4. Isı şoku için, hücre karışımını bir su banyosunda tam olarak 45 s boyunca 42 °C'de ısıtın. Dönüştürülmüş hücreleri stabilize etmek için hücreleri hemen 2 dakika buza geri koyun.
      5. İyileşmeyi kolaylaştırmak için hücrelere 950 μL oda sıcaklığında (RT) LB ortamı ekleyin.
      6. Dönüştürülmüş hücreleri 220 rpm'de çalkalarken 37 ° C'de 1 saat inkübe edin.
      7. 50 μg/mL kanamisin (85.8 μM) içeren bir LB agar plakasına 100 μL dönüşüm karışımını yayın.
      8. Kaplanmış hücreleri gece boyunca 37 °C'de inkübe edin. İnkübasyonun ardından, başlangıç kültürlerinin aşılanmasında kullanılmak üzere farklı koloniler seçin.
        NOT: Plakalardaki koloniler 4 °C'de 2 haftaya kadar saklanabilir.
    3. Dönüştürülmüş BL21 (DE3) hücrelerinin bir kolonisini alın ve 50 μg / mL kanamisin (85.8 μM) ile desteklenmiş 5 mL LB ortamında kültürleyin. 220 rpm'de çalkalanarak 37 °C'de 18 saat inkübe edin.
    4. Ölçeği büyütmek için, gece boyunca 2 mL kültürü 50 μg / mL kanamisin (85.8 μM) içeren 200 mL LB ortamına aktarın. 600 nm'deki (OD 600) optik yoğunluk 0,6-0,8'e ulaşana kadar 220 rpm'de çalkalanarak 37 °C'de inkübe etmeye devam edin.
    5. İndüklenmemiş bir kontrol numunesi olarak kültürün 1 mL'sini alın.
    6. Kalan kültürü İzopropil β-d-1-tiyogalaktopiranosid (IPTG) ile 1 mM'lik bir nihai konsantrasyona indükleyin ve protein ekspresyonunu teşvik etmek için 20 ° C'de 17 saat inkübe edin.
    7. %5 istifleme jeli ve %10 ayırma jeli kullanarak SDS-PAGE gerçekleştirin. Numuneleri SDS-PAGE yükleme tamponu ile yükleyin ve SDS-PAGE'i başlangıçta 30 dakika boyunca 100 V'ta, ardından bir Tris-Glisin tamponunda 50 dakika boyunca 120 V'ta çalıştırın. Protein ekspresyonunu görselleştirmek için Coomassie mavisi ile boyayın ( Ek Tablo 1'deki tariflere bakın) (Şekil 1C).
      NOT: İfade gözlenmezse sorun giderme için Tartışmaya bakın.
  2. Proteini saflaştırın.
    1. Hücreleri 10 dakika boyunca 4 ° C'de, 8500 x g'da santrifüjleme ile hasat edin. Süpernatanı atın ve peleti 200 mL PBS'de yıkayın. Tekrar santrifüjleyin, süpernatanı atın ve hücre peletini 25 mL lizis tamponunda (20 mM HEPES, 300 mM NaCl, 20 mM imidazol,% 10 gliserol, 0.5 mM DTT, 1 mM fenilmetilsülfonil florür [PMSF]) yeniden süspanse edin.
      DİKKAT: PMSF aşındırıcı ve toksiktir ve yanıklara neden olur. Uygun koruyucu giysi, eldiven ve göz/yüz koruması kullanın.
      NOT: Hemen devam etmiyorsanız -80 °C'de dondurun.
    2. Yeniden süspanse edilen hücrelere 5 μL 100 mg / mL lizozim, 5 μL 1 U / μL DNaz I ve 5 μL 10 mg / mL RNaz A ekleyin.
    3. 250 W'ta 1 s'lik patlamalar ve ardından 2 s'lik bir duraklama ile toplam 30 dakika boyunca buz üzerinde sonikasyon gerçekleştirin.
    4. 38.000 x g'da, 4 ° C'de 40 dakika (30-60 dakika kabul edilebilir) santrifüjleyin ve süpernatanı 0,22 μm'lik bir şırınga filtresinden süzün.
    5. 8.76 g NaCl (son konsantrasyon 300 mM) ve 0.68 g imidazol (son konsantrasyon 20 mM) 20 mM HEPES (pH 8.0) içinde çözerek 500 mL Ni-sütun bağlama tamponu hazırlayın. Çözeltiyi 0.22 μm'lik bir filtreden süzün.
      DİKKAT: İmidazol tehlikelidir ve cilt ve göz tahrişine neden olabilir. Ayrıca doğmamış bir çocuğa da zarar verebilir. Göz, cilt ve giysilerle temasından kaçının. Yutmayın veya solumayın. Yüz koruması da dahil olmak üzere kişisel koruyucu ekipman kullanın.
    6. Kademeli elüsyon için artan imidazol konsantrasyonları (100 mM, 200 mM, 300 mM ve 500 mM) ile Ni sütunlu elüsyon tamponları (20 mM HEPES (pH 8.0), 300 mM NaCl) hazırlayın ve tüm tamponların uygun şekilde filtrelendiğinden emin olun.
    7. Filtrelenmiş süpernatanı, bağlayıcı tamponda (20 mM HEPES (pH 8.0),300 mM NaCl,20 mM imidazol) önceden dengelenmiş Ni sütununa yükleyin. Bağlayıcı tampon ile yıkayın ve proteini hazırlanan imidazol gradyanı ile elüte edin, her biri 1 mL olan 12 fraksiyon toplayın (Şekil 1C). Fraksiyonları %>95 saflıkta birleştirin.
    8. Alüte edilmiş 6xHis-sumo-TRF2 füzyon proteininin konsantrasyonunu bir spektrofotometrede A280 ile ölçün.
    9. Tek moleküllü tahlillerde kullanılan protein için, üreticinin talimatlarına göre sumo proteaz ekleyin (tipik olarak 2 μg füzyon proteini başına 0,125 U proteaz) ve 4 °C'de gece boyunca sindirime izin verin.
    10. Sumo proteaz işleminden sonra, herhangi bir sindirilmemiş füzyon proteinini ve His etiketli sumoyu bağlamak için karışımı bir Ni-sütununa geri yükleyin ve etiketsiz TRF2 proteininin akmasına izin verin. Akışı toplayın.
  3. Protein konsantrasyonunu belirleyin ve proteini saklayın.
    1. Saflaştırılmış TRF2 proteinini 30 kDa'lık bir kesme santrifüj filtre ünitesi kullanarak konsantre edin ve imidazol konsantrasyonunu 150 mM'nin altına düşürmek için 20 mM HEPES (pH 8.0), 150 mM NaCl, 0.5 mM DTT içeren bir depolama tamponuna değiştirin.
    2. Hacim 1 mL'nin altına düşene kadar konsantrasyon işlemini tekrarlayın.
    3. Proteinin saflığını ve bütünlüğünü değerlendirmek için her saflaştırma adımından numuneleri SDS-PAGE ile analiz edin (Şekil 1C).
      NOT: Afinite kromatografisi, proteinleri saflaştırmak, ayrıştırılmış numuneleri toplamak ve yıkamak ve protein bütünlüğünü değerlendirmek ve kalite kontrolünü sağlamak için SDS-PAGE yürütmek için kullanılır. Afinite kromatografisi tek başına saflık gereksinimlerini karşılamadığında, protein saflığını daha da artırmak için boyut dışlama kromatografisi kullanılır. UV absorbans eğrileri, elüsyon fraksiyonlarının değerlendirilmesine yardımcı olur ve SDS-PAGE, protein bütünlüğünü doğrulayarak süreç boyunca sıkı kalite kontrolü sağlar.
    4. Depolama için konsantre ve tampon değişimli proteine% 50'lik bir nihai konsantrasyona gliserol ekleyin.
    5. Proteini -80 °C'de saklayın.

3. İnsan telomerik kısıtlama fragmanlarının hazırlanması

  1. Genomik DNA'yı çıkarın.
    1. Akış şemasını takip ederek (Şekil 2A), 1 x 107 hücreyi 1000 x g'da 3 dakika santrifüjleyin ve süpernatanı atın. Yıkamak için, hücreleri 200 μL PBS'de yeniden süspanse edin, 3 dakika boyunca 1000 x g'da tekrar santrifüjleyin ve süpernatanı atın.
    2. 50 mM Tris-HCl (pH 8.0), 100 mM NaCl, 100 mM EDTA ve %1 SDS içeren 760 μL tamponu 1 x 107 hücre içeren tüpe ekleyin ve hava kabarcıklarını önlemek için pipetleme ile nazikçe yeniden süspanse edin.
      NOT: Girdap yapmayın.
    3. Proteinlerin sindirimi ve numunedeki DNazların ve RNazların elimine edilmesi için, 10 mg/mL'lik bir stok çözeltisinin 40 μL'sine karşılık gelen 0.5 mg/mL'lik bir nihai konsantrasyona Proteinaz K ekleyin. Karıştırmak için tüpün altına hafifçe vurun (girdap yapmayın).
    4. Gece boyunca 37 °C'de inkübe edin.
    5. 265 μL 5.4 M NaCl ekleyin. Tüpü dakikada beş kez ters çevirerek 5 dakika karıştırın, ardından 20 dakika buzun üzerine koyun.
    6. RT'de 10 dakika boyunca maksimum hızda (örn. 16.900 x g) santrifüjleyin.
    7. Süpernatanı bir santrifüj tüpüne aktarın ve yüzen lipitlerden veya tortulardan kaçınarak eşit hacimde izopropanol (yaklaşık 750 μL) ekleyin. DNA süpernatantın içindedir.
    8. Karıştırmak için tüpü beş kez ters çevirin. Santrifüj tüpünde çökelen bir DNA peletinin varlığını görsel olarak onaylayın.
    9. RT'de maksimum hızda 10 dakika santrifüjleyin.
    10. Süpernatanı atın. Santrifüj tüpünü beş kez ters çevirerek DNA peletini 500 μL %70 etanol ile yıkayın.
      NOT: Pelet DNA'dır.
    11. RT'de maksimum hızda (örn. 16.900 x g) 10 dakika santrifüjleyin.
    12. DNA peletini bırakarak tüm süpernatanı dikkatlice çıkarın. Pelet havasının RT'de 5 dakika kurumasını bekleyin.
      NOT: Genomik DNA'nın çözülmesi zorlaşabileceğinden aşırı kurutmadan kaçının.
    13. DNA peletini 475 μL TE tamponunda (10 mM Tris-HCl [pH 8.0], 1 mM EDTA) yeniden süspanse edin. Tüpün altına hafifçe vurarak yavaşça karıştırın. DNA hazırlığı sırasında RNA'nın sindirimi için 25 μL 10 mg/mL RNaz A (son konsantrasyon 0.5 mg/mL) ekleyin ve DNA peleti tamamen eriyene kadar hafifçe vurarak karıştırın.
      NOT: DNA kesilmesini önlemek için girdaptan kaçının.
    14. DNA örneğini gece boyunca 4 °C'de inkübe edin.
    15. Eşit hacimde Tris-doymuş fenol ekstraksiyonu gerçekleştirin: santrifüj tüpüne 500 μL fenol ekleyin, bir pipetle hafifçe karıştırın ve 4 ° C'de 10 dakika boyunca maksimum hızda santrifüjleyin.
      DİKKAT: Fenole maruz kalmak ciltte, gözlerde, burunda, boğazda ve sinir sisteminde tahrişe neden olabilir. Göz, cilt ve giysilerle temasından kaçının. Yutmayın veya solumayın. Yüz koruması da dahil olmak üzere kişisel koruyucu ekipman kullanın.
      NOT: DNA üst sulu fazdadır, proteinler interfazdadır ve organik faz alttadır.
    16. Üç kez tekrarlayın. DNA'nın süpernatantını alın (yaklaşık 280 μL).
    17. DNA örneğinin hacmine göre 1/10 hacim (28 μL) 3 M sodyum asetat (nihai konsantrasyon 0.3 M, pH 5.2) ve 2 hacim (616 μL) soğuk %100 etanol ekleyin. Santrifüj tüpünü -80 °C'de 2-3 saat yerleştirin.
    18. Maksimum hızda (örn. 16.900 x g) 4 °C'de 10 dakika santrifüjleyin. Santrifüjlemeden önce donmuşsa çözeltiyi buz üzerinde çözdürün.
    19. Süpernatanı atın ve santrifüj tüpünü ters çevirerek 3-4 kez% 70 etanol ile yıkayın. 4 °C'de 5 dakika maksimum hızda santrifüjleyin.
    20. Etanolü çıkarın ve peletin RT'de 5 dakika kurumasını bekleyin.
    21. 100 μL TE tamponu ekleyin, karıştırmak için tüpe hafifçe vurun ve tamamen çözünmesi için 2 saat boyunca 4 ° C'de bekletin.
      NOT: Genomik DNA'nın bütünlüğünü %1'lik bir agaroz jel üzerinde inceleyin (Şekil 2B).
    22. DNA'yı -20 °C'de dondurucuda saklayın. En az 1 yıl boyunca stabil kalacaktır.
  2. Genomik DNA sindirimi ve modifikasyonu gerçekleştirin.
    1. 4 μg genomik DNA alın ve 1 μL CviAII (10 U), 2 μL 10x sindirim tamponu ile birleştirin (tarifler için Ek Tablo 1'e bakın) ve toplam 20 μL hacme ulaşmak için su ekleyin. Karışımı 25 ° C'de 12 saat inkübe edin.
      NOT: FatI, artık NEB tarafından durdurulan CviAII'nin yerini alabilir.
    2. Önceki karışımı (20 μL) içeren aynı tüpe 1 μL NdeI (20 U), 1 μL MseI (10 U) ve 1 μL BfaI (10 U) ekleyin. Ayrıca, toplam 40 μL'lik bir hacim elde etmek için 2 μL 10x sindirim tamponu ve 15 μL su ekleyin. 37 ° C'de 12 saat inkübe edin, ardından tüm enzimleri 80 ° C'de 20 dakika boyunca ısıyla inaktive edin.
      NOT: Genomik DNA'nın sindirimi, Terminal Kısıtlama Fragmanı (TRF) yöntemi kullanılarak incelenebilir (Şekil 2C). Dört kısıtlama enziminin (CviAII, NdeI, MseI ve BfaI) kombinasyonu, genomik DNA'yı yaklaşık 800 bp'lik parçalara sindirir ve minimum subtelomerik DNA kontaminasyonu ile TRF'leri verir.
    3. Digoxigenin modifikasyonu için, sindirilmiş genomik DNA'nın 40 μL'sini alın ve 4 μL 1 mM dATP (son konsantrasyon 0.08 mM), 4 μL 1 mM digoksigenin-11-dUTP (son konsantrasyon 0.08 mM), 1 μL Klenow Fragmanı (5 U), 0.5 μL 100 mM DTT (son konsantrasyon 1 mM) ve 1 μL 10x sindirim tamponu. 37 ° C'de 12 saat inkübe edin, ardından Klenow Parçasını etkisiz hale getirmek için 75 ° C'de 20 dakika ısıtın.
    4. Biyotin etiketlemesi için, 12.5 μL Digoksigenin ile modifiye edilmiş genomik DNA (1 μg) alın ve 1 μL 1 μM biyotinile telomerik telomerik prob (ör., 1 pmol) telomerik tek sarmallı çıkıntıya tamamlayıcı olan. 50 mM K iyonlarını 1 mM'ye seyreltmek için 611.5 μL TE Li tamponu (10 mM Tris-HCl (pH 8.0), 1 mM EDTA, 50 mM LiCl) ekleyin, toplam 625 μL'lik bir hacim elde edin, bu da her biri 39 μL'lik 16 tüpe bölünebilir.
    5. Bir termal döngüleyicide 3 dakika boyunca 75 °C'de ısıtın, ardından sıcaklığı 0.1 °C'ye ulaşana kadar her 30 saniyede bir 25 °C azaltın.
    6. DNA örneklerini en az bir yıl boyunca -20 °C'de saklayın.

4. Manyetik cımbızda telomerik DNA örneği için bir akış hücresi kurma

  1. Tek moleküllü tahliller için bir akış hücresi yapın.
    1. Üst lamellerde giriş ve çıkış olarak delikler açmak için bir elektrikli taşlama makinesi kullanın (# 2 0,2 mm kalınlığında kapak camı).
    2. Lamelleri deterjanda 30 dakika boyunca sonikasyon ile temizleyin.
    3. Kapak fişlerini 3 kez ultra saf su ile yıkayın.
    4. İzopropanoldeki lamelleri 30 dakika boyunca sonikasyon ile temizleyin.
    5. Lamelleri 3 kez ultra saf su ile yıkayın.
    6. Lamelleri 15-30 dakika boyunca sonikasyon ile ultra saf olarak temizleyin.
    7. Lamelleri nitrojenle kurulayın.
      NOT: Protokol burada durdurulabilir ve temizlenen lameller daha sonra kullanılmak üzere saklanabilir.
    8. Alt lamelleri (deliksiz) 20 μL %0,1 nitroselüloz ile kaplayın ve referans boncukları (20x seyreltme, 3 μm çap) ekleyin. 100 °C'de 4 dakika pişirin.
    9. Çift katmanlı parafilm ara parçalarını metal bir kalıba göre kesmek için bir neşter kullanın. Kalıp, lamel ile aynı boyutlara sahip dikdörtgen bir alüminyum alaşımlı parçadır ve kanal kesmeyi kolaylaştırmak için içi boş bir merkeze sahiptir.
    10. Akış hücreli sandviçi monte edin (Şekil 3A). 85 ° C'de ısıtın ve parafilm kanalı kapatana kadar masaj yapmak için iki çubukla masaj yapın.
    11. Akış hücresini bir antikorla kaplayın. 70 μL anti-digoksijenenin antikorunu (0.1 mg / mL) doğrudan akış hücresine enjekte edin. RT'de 1 saat bekletin.
    12. Akış hücresini pasifleştirin. Anti-digoxigenin antikorunun yerini almak için 70 μL 10 mg / mL BSA enjekte edin. RT'de 12 saat bekletin. Bağlanmamış anti-digoksigenin antikorları, titiz bir yıkama ile aşağıdaki adımlarda yıkanacaktır.
      NOT: Akış hücresini 4 °C'de 1-2 hafta saklayın.
    13. DNA olmadan 5 μL yıkanmış MyOne (10 mg / mL) (veya 5 μL yıkanmış M270 (10 mg / mL)) boncukları akış hücresine yıkayarak spesifik olmayan bağlanmayı test edin. 10 dakika bekletin, ardından bir çalışma tamponu (20 mM HEPES (pH 7.5), 100 mM NaCl, 1 mM EDTA) kullanarak boncukları yıkayın. Bir görüş alanında yüzeye yapışan boncukların sayısını sayın. İyi işlenmiş bir yüzey sıfır veya sadece birkaç boncuk göstermelidir.
  2. Bir akış hücresinde telomerik DNA bağlarını izole edin ve hareketsiz hale getirin.
    1. 10 μL M270 boncuk (10 mg / mL) veya 5 μL 10 mg / mL MyOne alın ve bunları 50 μL çalışma tamponu (20 mM HEPES [pH 7.5], 100 mM NaCl, 1 mM EDTA) ile beş kez yıkayın.
    2. 500 ng sindirilmiş genomik DNA alın ve 1.5 mL'lik bir santrifüj tüpüne koyun. Tüm boncukları (50 μL) DNA örneğinin üzerine ekleyin.
    3. Pipetleme yapmadan, boncukları ve DNA örneğini karıştırmak için santrifüj tüpünü birkaç kez hafifçe vurun. Karışımı 1 saat buz üzerinde bırakın. Boncukları aşağı çekmek için bir mıknatıs kullanarak 500 μL çalışma tamponu ile üç kez, yıkamalar arasında 10 dakikalık aralıklarla yıkayın.
    4. 30 μL çalışma tamponu kullanarak numuneyi yeniden süspanse edin ve karışımı akış hücresine yükleyin. 30 dakika bekletin. Bağlanmamış manyetik boncukları yıkayın.
      NOT: Telomerik DNA, digoksijenenin-antikor ve biotin-streptavidinin aracılık ettiği afinite etkileşimleri yoluyla alt kapak kayması ile manyetik boncuk arasına bağlanır (Şekil 3B).
  3. Manyetik cımbızda bir akış hücresi kurun
    1. Akış hücresini %70 etanol ile temizleyin ve lens dokusu kullanarak yüzeyi kurulayın. Temizlenmiş akış hücresini alt numune tutucuya yerleştirin ve üst numune rafını bir tornavida kullanarak nazikçe monte edin.
    2. Akış hücresinin alt yüzeyine, objektif mercekle hizalandığı yere bir damla mercek yağı sürün. Ardından, numune tutucuyu objektif merceğin üzerine yerleştirin ve bir tornavida kullanarak sabitleyin.
    3. Dikey konfigürasyonda düzenlenmiş bir çift 5 mm kübik mıknatıs seçin. Görüntüleme için mıknatıs tutucuyu manyetik cımbızın ışık yolunun X ekseni ile hizalayın.
      NOT: Bu kritik bir adımdır. Manyetik alanın yönü hizalanır ve böylece mıknatıs tutucunun yönü ile belirlenir.
    4. Grafik programlama yazılımını başlatın ve manyetik cımbız için denetleyicileri bağlayın. Akış hücresinin altındaki bir referans boncuğu bulmak için görüş alanını ayarlayın ve referans boncuğu net kırınım halkaları gösterecek şekilde objektif merceğini hafifçe ayarlayın.
    5. Mıknatısları akış hücresinin üst kısmına doğru hareket ettirin.
      NOT: Bu kritik bir adımdır. Boncuk kırınım modelindeki ani değişiklikler, mıknatısların akış hücresinin yüzeyine yeni temas ettiğini gösterir. Bu konum, ölçüm sıfır noktası için ofset olarak kabul edilir.
      NOT: Mıknatısları dikkatlice indirin, daha büyük adımlarla başlayın ve yavaş yavaş daha küçük adımlara geçin. Akış hücresine yaklaşırken akış hücresine zarar vermemek için 0,1 mm'lik artışlarla hareket edin.
    6. Mıknatısları en yüksek konumlarına kaldırın ve mıknatıs tutucuyu çıkarın.
    7. Atık şişesine bağlı peristaltik pompayı açın ve sıvıyı atın. Girişe 100 μL çalışma tamponu ekleyin ve akış hücresini tamponla doldurmak için peristaltik pompa akış hızını 100 μL/dk'ya ayarlayın.

5. Tek moleküllü manyetik cımbız kullanılarak bir telomer ölçümü

  1. Kamerayı ayarlayın.
    1. Parlaklık ayarıyla tamamlayıcı metal oksit yarı iletken (CMOS) kameranın gri tonlamasını 150 seviyeye ayarlayın.
    2. İlgilenilen bölgenin boyutunu (ROI) tanımlayın.
    3. Kare hızını 5000 μs pozlama süresiyle 200 Hz'e ayarlayın.
      NOT: Bu kritik bir adımdır. Deklanşör ölü süresinin sıfıra ayarlandığından emin olun.
    4. Mıknatıs konumunu 3 cm'ye (yaklaşık 8 pN) getirin ve boncuklar üzerindeki objektif odağını ayarlayın.
  2. Arama tablosunu (LUT) oluşturun.
    1. DNA'ya bağlı manyetik boncuğu sıkıca germek için mıknatısları 8 pN'ye karşılık gelen bir konuma getirin.
    2. LUT'u 0,05 μm'lik bir adım boyutuyla 200 adıma ayarlayın.
    3. LUT'u oluşturmak için farklı konumlardaki manyetik boncukların profillerini yakalamak için bir CMOS kamera kullanın.
      NOT: Bu kritik bir adımdır. Akış hücresine sabitlenen polistiren boncuklar, ilgilenilen boncuklar için kaymayı ortadan kaldırmak için referans boncuklar olarak işlev görür.
  3. Tek moleküllü bir mekanik deney tasarlayın.
    1. Kuvvet rampası veya kuvvet atlama tahlilleri için motor hareketlerini kontrol etmek için MATLAB'da bir komut dosyası yazın.
      NOT: Bu kritik bir adımdır. Bu komut dosyası, mıknatıs hareketleri için komutları kodlar. Kuvvet yükleme hızı, bir kuvvet rampası tahlili için bu adımda ayarlanır. Kuvvet sıçrama deneylerinin seviyeleri ve süreleri de burada belirlenir (Şekil 4, Ek Dosya 1, Ek Dosya 2 ve Ek Dosya 3).
    2. Tek moleküllü deneyleri test etmek için komut dosyasını grafik programlama yazılımına aktarın.
    3. Tek moleküllü deneyi çalıştırmak için gereken toplam kareleri kontrol edin ve kullanılabilir belleğin bu gereksinimi aştığından emin olun.
      NOT: Verilerin kaydedilmesi zaman aldığından, ayrılan bellek gerekenden daha azsa veriler kaybolacaktır.
    4. Aynı anda izlenebilecek maksimum boncuk sayısını belirlemek için maksimum görüntüleme hızını doğrulayın.
      NOT: Görüntüleme hızı sınırı aşılırsa deney sonlandırılır.
    5. Örnek olarak bir kuvvet sıçrama testi kullanarak, tek moleküllü mekanik deneyi çalıştırın. Manyetik boncuğa aniden kuvvetler uygulanır, bu da bu kuvvetleri DNA molekülüne iletir ve hemen yukarı doğru gerer.

6. Manyetik cımbız kullanılarak bir telomer üzerinde TRF1/2 ölçümleri

  1. Kuvvet rampası tahlili
    1. Örnek olarak TRF1'i kullanarak, 200 μL 10 nM TRF1'i akış hücresine yavaş bir akış hızında (örn., 30 μL/dak) yükleyin. TRF1'in telomerik DNA'ya bağlanması için 30 dakika bekleyin.
    2. ±1 pN/sn kuvvet yükleme hızına sahip bir kuvvet rampası deneyi için bir komut dosyası seçin.
    3. Veri dosyalarını uygun şekilde adlandırın ve denemeyi çalıştırın. Veriler, analiz için belirtilen hedefe kaydedilecektir (Şekil 5).
      NOT: Bu deney sırasında, kuvvet 0 pN ile 17 pN arasında doğrusal olarak arttırılır ve azaltılır, bu da telomerik DNA'yı gerer ve gevşetir ve TRF1/2'nin aracılık ettiği DNA döngülerini kırar.
  2. Kuvvet Atlama testi
    1. Kuvvet atlama tahlili çalıştırmak için bir komut dosyası seçin.
      NOT: Telomerik DNA'yı germek için çeşitli kuvvetler uygulanır, örneğin, 0 s boyunca 40 pN'de "Dinlenme kuvveti" (Frest), 2 s için 8-60 pN arasında değişen "Test kuvveti" (Ftest), "Yüksek kuvvet" (Fhigh) 30 s için 10 pN'de ve "Maksimum kuvvet" (Fmax) 30 s boyunca 20 pN'de.
    2. Veri dosyalarını uygun şekilde adlandırın ve denemeyi çalıştırın. Veriler, analiz için belirtilen hedefe kaydedilecektir (Şekil 5).

Sonuçlar

Şekil 1A, prokaryotik hücrelerde eksprese edilebilen sırasıyla 439 ve 542 amino asitten oluşan TRF1 ve TRF2'nin şematik alanlarını ve yapılarını göstermektedir. TRF1'in hazırlanması daha önce literatürdetanımlanmıştır 41. Burada, TRF2'nin hazırlanmasının kapsamlı bir tanımını ve temsili sonuçlarını sunuyoruz. Şekil 1B, E. coli'de TRF2'yi eksprese etmek için kullan?...

Tartışmalar

Bu protokol, TRF'lerin tek molekül seviyesi57,58,59'da manipülasyonu için manyetik cımbız kullanır. TRF'leri genomik DNA parçalarından ayırmak için manyetik boncuklar kullanıyoruz. Kısıtlama sindirimini takiben, TRF'ler manyetik boncuklara bağlanarak genomik DNA parçalarından kolayca ayrılmalarını sağlar. Bu yaklaşım, şeffaflık sorunlarıyla sınırlı optik cımbızları...

Açıklamalar

Yazarlar, rekabet eden finansal çıkarlar veya diğer çıkar çatışmaları olmadığını beyan ederler.

Teşekkürler

Bu çalışma, Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı [Z.Y.'ye 32071227 Hibe Başvurusu], Çin Tianjin Belediye Doğa Bilimleri Vakfı (22JCYBJC01070 - ZY) ve Hassas Ölçüm Teknolojisi ve Aletleri Devlet Anahtar Laboratuvarı (Tianjin Üniversitesi) tarafından desteklenmiştir.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
Anti-DigoxigeninRoche11214667001
BfaINew England Biolab (NEB)R0568S
BSASigma-AldrichV900933
CMOS camera MikrotronMC1362
CviAIINew England Biolab (NEB)R0640S
DIG-11-dUTPJena BioscienceNU-803-DIGXL
DNA extraction solutionG-CLONEEX0108
Dnase I, Rnase-Free, Hc EaThermo Fisher ScientificEN0523
dNTP mixtureNanjing Vazyme Biotech Co., Ltd (Vazyme)P032-02
DTTSolarbioD1070
Dynabeads M-270  beadsThermo Fisher Scientific65305Streptavidin beads
Dynabeads MyOne beadsThermo Fisher Scientific65001Streptavidin beads
EthanolTianjin No.6 Chemical Reagent Factory1083
GlycerolBeijing Hwrkchemical Co,. LtdSMG66258-1
ImidazoleSolarbioII0070
IPTGSolarbioI8070
IsopropanolTianjin No.6 Chemical Reagent FactoryA1079
KanamycinThermo Fisher ScientificEN0523
Klenow fragment (3′-5′ exo-)New England Biolab (NEB)M0212S
LabViewNational Instrumentshttps://www.ni.com/en-us/shop/product/labview.htmlGraphical programming software 
LiClBide Pharmatech Co., Ltd (bidepharm)BD136449
LysozymeSolarbioL8120-5
MseINew England Biolab (NEB)R0525S
NaClShanghai AladdinC111533
NanoDropThermo Fisher ScientificSpectrophotometer
NdeINew England Biolab (NEB)R0111S
Ni NTA Beads 6FFChangzhou Smart-Lifesciences Biotechnology Co.,LtdSA005025
Nitrocellulose membraneABclonalRM02801
PMSFSolarbioP8340
Proteinase KBeyotime Biotech Inc (beyotime)ST535-500mg
rCutSmart BufferNew England Biolab (NEB)B6004S
Rnase ASigma-AldrichR4875
Sodium acetateSERVA Electrophoresis GmbH2124902
Sumo proteaseBeyotime Biotech Inc (beyotime)P2312M

Referanslar

  1. Blackburn, E. H., Epel, E. S., Lin, J. Human telomere biology: A contributory and interactive factor in aging, disease risks, and protection. Science. 350 (6265), 1193-1198 (2015).
  2. Li, N., et al. The dynamics of forming a triplex in an artificial telomere inferred by DNA mechanics. Nucleic Acids Res. 47 (15), e86 (2019).
  3. Yu, Z., et al. Click chemistry assisted single-molecule fingerprinting reveals a 3d biomolecular folding funnel. J Am Chem Soc. 134 (30), 12338-12341 (2012).
  4. Karimian, K., et al. Human telomere length is chromosome end-specific and conserved across individuals. Science. 384 (6695), 533-539 (2024).
  5. Maciejowski, J., De Lange, T. Telomeres in cancer: Tumour suppression and genome instability. Nat Rev Mol Cell Biol. 18 (3), 175-186 (2017).
  6. Kinzig, C. G., Zakusilo, G., Takai, K. K., Myler, L. R., De Lange, T. Atr blocks telomerase from converting DNA breaks into telomeres. Science. 383 (6684), 763-770 (2024).
  7. Takai, H., Aria, V., Borges, P., Yeeles, J. T. P., De Lange, T. Cst-polymerase α-primase solves a second telomere end-replication problem. Nature. 627 (8004), 664-670 (2024).
  8. De Lange, T. How telomeres solve the end-protection problem. Science. 326 (5955), 948-952 (2009).
  9. De Lange, T. Shelterin-mediated telomere protection. Annual Review of Genetics. 52 (1), 223-247 (2018).
  10. Liu, B., et al. Structure of active human telomerase with telomere shelterin protein TPP1. Nature. 604 (7906), 578-583 (2022).
  11. Sfeir, A., De Lange, T. Removal of shelterin reveals the telomere end-protection problem. Science. 336 (6081), 593-597 (2012).
  12. Sarek, G., et al. Cdk phosphorylation of trf2 controls t-loop dynamics during the cell cycle. Nature. 575 (7783), 523-527 (2019).
  13. Myler, L. R., et al. DNA-PK and the TRF2 IDDR inhibit MRN-initiated resection at leading-end telomeres. Nat Struct Mol Biol. 30 (9), 1346-1356 (2023).
  14. Hanaoka, S., Nagadoi, A., Nishimura, Y. Comparison between TRF2 and TRF1 of their telomeric DNA-bound structures and DNA-binding activities. Protein Sci. 14 (1), 119-130 (2005).
  15. Chen, Y., et al. A shared docking motif in TRF1 and TRF2 used for differential recruitment of telomeric proteins. Science. 319 (5866), 1092-1096 (2008).
  16. Wan, B., et al. SLX4 assembles a telomere maintenance toolkit by bridging multiple endonucleases with telomeres. Cell Reports. 4 (5), 861-869 (2013).
  17. Rai, R., et al. NBS1 phosphorylation status dictates repair choice of dysfunctional telomeres. Molecular Cell. 65 (5), 801-817.e4 (2017).
  18. Benarroch-Popivker, D., et al. Trf2-mediated control of telomere DNA topology as a mechanism for chromosome-end protection. Mol Cell. 61 (2), 274-286 (2016).
  19. Poulet, A., et al. The n-terminal domains of TRF1 and TRF2 regulate their ability to condense telomeric DNA. Nucleic Acids Res. 40 (6), 2566-2576 (2012).
  20. Schmutz, I., Timashev, L., Xie, W., Patel, D. J., De Lange, T. TRF2 binds branched DNA to safeguard telomere integrity. Nat Struct Mol Biol. 24 (9), 734-742 (2017).
  21. Doksani, Y., Wu, J. Y., De Lange, T., Zhuang, X. Super-resolution fluorescence imaging of telomeres reveals TRF2-dependent t-loop formation. Cell. 155 (2), 345-356 (2013).
  22. Di Maro, S., et al. Shading the TRF2 recruiting function: A new horizon in drug development. J Am Chem Soc. 136 (48), 16708-16711 (2014).
  23. Gao, J., Pickett, H. A. Targeting telomeres: Advances in telomere maintenance mechanism-specific cancer therapies. Nat Rev Cancer. 22 (9), 515-532 (2022).
  24. Bejarano, L., et al. Inhibition of TRF1 telomere protein impairs tumor initiation and progression in glioblastoma mouse models and patient-derived xenografts. Cancer Cell. 32 (5), 590-607.e4 (2017).
  25. Chen, X., et al. Cyclic peptidic mimetics of apollo peptides targeting telomeric repeat binding factor 2 (TRF2) and apollo interaction. ACS Med Chem Lett. 9 (5), 507-511 (2018).
  26. Erdel, F., et al. Telomere recognition and assembly mechanism of mammalian shelterin. Cell Rep. 18 (1), 41-53 (2017).
  27. Pendlebury, D. F., et al. Dissecting the telomere-inner nuclear membrane interface formed in meiosis. Nat Struct Mol Biol. 24 (12), 1064-1072 (2017).
  28. Court, R., Chapman, L., Fairall, L., Rhodes, D. How the human telomeric proteins trf1 and trf2 recognize telomeric DNA: A view from high-resolution crystal structures. EMBO Rep. 6 (1), 39-45 (2005).
  29. Hu, H., et al. Structural basis of telomeric nucleosome recognition by shelterin factor trf1. Sci Adv. 9 (34), eadi4148 (2023).
  30. Nurk, S., et al. The complete sequence of a human genome. Science. 376 (6588), 44-53 (2022).
  31. Rhie, A., et al. The complete sequence of a human y chromosome. Nature. 621 (7978), 344-354 (2023).
  32. Chang, T. R., Long, X., Shastry, S., Parks, J. W., Stone, M. D. Single-molecule mechanical analysis of strand invasion in human telomere DNA. Biochemistry. 61 (15), 1554-1560 (2022).
  33. Kaur, P., et al. TIN2 is an architectural protein that facilitates TRF2-mediated trans- and cis-interactions on telomeric DNA. Nucleic Acids Res. 49 (22), 13000-13018 (2021).
  34. Parks, J. W., Stone, M. D. Single-molecule studies of telomeres and telomerase. Annu Rev Biophys. 46, 357-377 (2017).
  35. Zhao, X., et al. Exploring TRF2-dependent DNA distortion through single-DNA manipulation studies. Commun Biol. 7 (1), 148 (2024).
  36. Patrick, E. M., Slivka, J. D., Payne, B., Comstock, M. J., Schmidt, J. C. Observation of processive telomerase catalysis using high-resolution optical tweezers. Nat Chem Biol. 16 (7), 801-809 (2020).
  37. Soman, A., et al. Columnar structure of human telomeric chromatin. Nature. 609 (7929), 1048-1055 (2022).
  38. Jansson, L. I., et al. Telomere DNA G-quadruplex folding within actively extending human telomerase. Proc Natl Acad Sci U S A. 116 (19), 9350-9359 (2019).
  39. Soranno, A., et al. Shelterin components modulate nucleic acids condensation and phase separation in the context of telomeric DNA. J Mol Biol. 434 (16), 167685 (2022).
  40. Wong, S. Y., et al. The shelterin component TRF2 mediates columnar stacking of human telomeric chromatin. EMBO J. 43 (1), 87-111 (2024).
  41. Li, X., et al. Dynamics of TRF1 organizing a single human telomere. Nucleic Acids Res. 49 (2), 760-775 (2021).
  42. You, H., Le, S., Chen, H., Qin, L., Yan, J. Single-molecule manipulation of g-quadruplexes by magnetic tweezers. J Vis Exp. (127), e56328 (2017).
  43. Lipfert, J., Lee, M., Ordu, O., Kerssemakers, J. W., Dekker, N. H. Magnetic tweezers for the measurement of twist and torque. J Vis Exp. (87), e51503 (2014).
  44. Ma, K., et al. A DNA force circuit for exploring protein-protein interactions at the single-molecule level. Chinese Journal of Chemistry. 42 (13), 1456-1464 (2024).
  45. . LB liquid medium. Cold Spring Harb Protoc. 2016 (9), (2016).
  46. . LB agar plates. Cold Spring Harb Protoc. 2024 (4), (2024).
  47. . HEPES buffer. Cold Spring Harb Protoc. 2010 (7), (2010).
  48. . SDS-PAGE gel. Cold Spring Harb Protoc. 2015 (7), (2015).
  49. . 10x PBS. Cold Spring Harb Protoc. 2007 (4), (2007).
  50. . TE buffer (1x). Cold Spring Harb Protoc. 2016 (5), (2016).
  51. Green, M. R., Sambrook, J. Buffers. Cold Spring Harb Protoc. 2018 (2), (2018).
  52. . Tris buffer (1 M, pH 7.5). Cold Spring Harbor Protocols. 2011 (2), (2011).
  53. . EDTA. Cold Spring Harbor Protocols. 2006 (1), (2006).
  54. Yu, Z., et al. A force calibration standard for magnetic tweezers. Rev Sci Instrum. 85 (12), 123114 (2014).
  55. Wang, Z., et al. Reading time and DNA sequence preference of TET3 CXXC domain revealed by single-molecule profiling. Chinese J Chem. 41 (10), 1177-1184 (2023).
  56. Kimura, M., et al. Measurement of telomere length by the southern blot analysis of terminal restriction fragment lengths. Nat Protoc. 5 (9), 1596-1607 (2010).
  57. Dulin, D., et al. High spatiotemporal-resolution magnetic tweezers: Calibration and applications for DNA dynamics. Biophys J. 109 (10), 2113-2125 (2015).
  58. Lipfert, J., Hao, X., Dekker, N. H. Quantitative modeling and optimization of magnetic tweezers. Biophys J. 96 (12), 5040-5049 (2009).
  59. Te Velthuis, A. J., Kerssemakers, J. W., Lipfert, J., Dekker, N. H. Quantitative guidelines for force calibration through spectral analysis of magnetic tweezers data. Biophys J. 99 (4), 1292-1302 (2010).
  60. Cnossen, J. P., Dulin, D., Dekker, N. H. An optimized software framework for real-time, high-throughput tracking of spherical beads. Rev Sci Instrum. 85 (10), 103712 (2014).
  61. Green, M. R., Sambrook, J. Cloning and transformation with plasmid vectors. Cold Spring Harb Protoc. 2021 (11), (2021).
  62. Haneskog, L. Purification of histidine-tagged proteins using stepwise elution with imidazole. Cold Spring Harb Protoc. 2006 (1), (2006).

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

BiyokimyaSay 210

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır