Analyse telomerer Protein-DNA-Wechselwirkungen mit einer magnetischen Einzelmolekülpinzette

Zusammenfassung

Dieses Protokoll demonstriert die Verwendung einer magnetischen Einzelmolekülpinzette zur Untersuchung der Wechselwirkungen zwischen telomeren DNA-bindenden Proteinen (Telomer-Repeat-Bindungsfaktor 1 [TRF1] und TRF2) und langen Telomeren, die aus menschlichen Zellen extrahiert wurden. Es beschreibt die Vorbereitungsschritte für Telomere und telomerische Repeat-Bindungsfaktoren, die Durchführung von Einzelmolekülexperimenten sowie die Methoden der Datenerhebung und -analyse.

Zusammenfassung

Telomere, die schützenden Strukturen an den Enden der Chromosomen, sind entscheidend für die Aufrechterhaltung der Langlebigkeit und der Stabilität des Genoms. Ihre ordnungsgemäße Funktion hängt von streng regulierten Prozessen der Replikation, der Verlängerung und der Schadensreaktion ab. Der Shelterin-Komplex, insbesondere der Telomer-Repeat-Bindungsfaktor 1 (TRF1) und TRF2, spielt eine zentrale Rolle beim Schutz der Telomere und hat sich als potenzielles Ziel für die Wirkstoffforschung gegen Krebs herausgestellt. Diese Proteine binden an das repetitive telomere DNA-Motiv TTAGGG und erleichtern so die Bildung von Schutzstrukturen und die Rekrutierung anderer telomerer Proteine. Strukturelle Methoden und fortschrittliche bildgebende Verfahren haben Einblicke in telomere Protein-DNA-Wechselwirkungen gegeben, aber die Untersuchung der dynamischen Prozesse erfordert Einzelmolekülansätze. Werkzeuge wie magnetische Pinzetten, optische Pinzetten und Rasterkraftmikroskopie (AFM) wurden eingesetzt, um telomere Protein-DNA-Wechselwirkungen zu untersuchen, wobei wichtige Details wie die TRF2-abhängige DNA-Verzerrung und die Telomerase-Katalyse enthüllt wurden. Die Herstellung von Einzelmolekülkonstrukten mit telomerischen repetitiven Motiven ist jedoch nach wie vor eine herausfordernde Aufgabe, die den Umfang der Studien mit mechanischen Einzelmolekülmethoden möglicherweise einschränkt. Um dies zu beheben, haben wir eine Methode entwickelt, um Wechselwirkungen mit menschlicher Telomer-DNA in voller Länge mit einer magnetischen Pinzette zu untersuchen. Dieses Protokoll beschreibt, wie TRF2 exprimiert und gereinigt, telomerer DNA präpariert, mechanische Einzelmolekül-Assays eingerichtet und Daten analysiert werden. Dieser detaillierte Leitfaden wird Forschern in der Telomerbiologie und der auf Telomere ausgerichteten Wirkstoffforschung zugute kommen.

Einleitung

Telomere sind schützende Strukturen an den Enden der Chromosomen ^1,2,3. Die Erosion der Telomere während der Zellteilung führt zu Zellalterung und Zellalterung, während eine abnormale Verlängerung der Telomere zu Krebs beiträgt ^4,5. Damit Telomere richtig funktionieren, müssen ihre Replikations-, Dehnungs- und Schadensreaktionen stark reguliert sein ^6,7,8. Shelterin, bestehend aus sechs Unter....

Protokoll

1. Allgemeine Materialien und Methoden

1. In der Materialtabelle finden Sie die in diesem Protokoll verwendeten Salze, Chemikalien, Antibiotika, Enzyme, Antikörper und Harzmaterialien.
2. Bereiten Sie Luria-Bertani (LB) Flüssigmedium, LB-Agarplatten, HEPES-Puffer, SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE), phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) und Tris-EDTA (TE)-Puffer gemäß den Rezepten aus den Protokollen 45,46,47,48,49,50,51,52,53 vor.

Diskussion

Dieses Protokoll verwendet eine magnetische Pinzette zur Manipulation von TRFs auf Einzelmolekülebene 57,58,59. Wir verwenden magnetische Kügelchen, um TRFs von genomischen DNA-Fragmenten zu trennen. Nach dem Restriktionsverdau binden TRFs an die magnetischen Kügelchen und ermöglichen so eine einfache Trennung von genomischen DNA-Fragmenten. Dieser Ansatz ermöglicht die Manipulation mit ein.......

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anti-Digoxigenin	Roche	11214667001
BfaI	New England Biolab (NEB)	R0568S
BSA	Sigma-Aldrich	V900933
CMOS camera	Mikrotron	MC1362
CviAII	New England Biolab (NEB)	R0640S
DIG-11-dUTP	Jena Bioscience	NU-803-DIGXL
DNA extraction solution	G-CLONE	EX0108
Dnase I, Rnase-Free, Hc Ea	Thermo Fisher Scientific	EN0523
dNTP mixture	Nanjing Vazyme Biotech Co., Ltd (Vazyme)	P032-02
DTT	Solarbio	D1070
Dynabeads M-270  beads	Thermo Fisher Scientific	65305	Streptavidin beads
Dynabeads MyOne beads	Thermo Fisher Scientific	65001	Streptavidin beads
Ethanol	Tianjin No.6 Chemical Reagent Factory	1083
Glycerol	Beijing Hwrkchemical Co,. Ltd	SMG66258-1
Imidazole	Solarbio	II0070
IPTG	Solarbio	I8070
Isopropanol	Tianjin No.6 Chemical Reagent Factory	A1079
Kanamycin	Thermo Fisher Scientific	EN0523
Klenow fragment (3′-5′ exo-)	New England Biolab (NEB)	M0212S
LabView	National Instruments	https://www.ni.com/en-us/shop/product/labview.html	Graphical programming software
LiCl	Bide Pharmatech Co., Ltd (bidepharm)	BD136449
Lysozyme	Solarbio	L8120-5
MseI	New England Biolab (NEB)	R0525S
NaCl	Shanghai Aladdin	C111533
NanoDrop	Thermo Fisher Scientific		Spectrophotometer
NdeI	New England Biolab (NEB)	R0111S
Ni NTA Beads 6FF	Changzhou Smart-Lifesciences Biotechnology Co.,Ltd	SA005025
Nitrocellulose membrane	ABclonal	RM02801
PMSF	Solarbio	P8340
Proteinase K	Beyotime Biotech Inc (beyotime)	ST535-500mg
rCutSmart Buffer	New England Biolab (NEB)	B6004S
Rnase A	Sigma-Aldrich	R4875
Sodium acetate	SERVA Electrophoresis GmbH	2124902
Sumo protease	Beyotime Biotech Inc (beyotime)	P2312M