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In diesem Artikel

  • Zusammenfassung
  • Zusammenfassung
  • Einleitung
  • Protokoll
  • Ergebnisse
  • Diskussion
  • Offenlegungen
  • Danksagungen
  • Materialien
  • Referenzen
  • Nachdrucke und Genehmigungen

Zusammenfassung

Dieses Protokoll demonstriert die Verwendung einer magnetischen Einzelmolekülpinzette zur Untersuchung der Wechselwirkungen zwischen telomeren DNA-bindenden Proteinen (Telomer-Repeat-Bindungsfaktor 1 [TRF1] und TRF2) und langen Telomeren, die aus menschlichen Zellen extrahiert wurden. Es beschreibt die Vorbereitungsschritte für Telomere und telomerische Repeat-Bindungsfaktoren, die Durchführung von Einzelmolekülexperimenten sowie die Methoden der Datenerhebung und -analyse.

Zusammenfassung

Telomere, die schützenden Strukturen an den Enden der Chromosomen, sind entscheidend für die Aufrechterhaltung der Langlebigkeit und der Stabilität des Genoms. Ihre ordnungsgemäße Funktion hängt von streng regulierten Prozessen der Replikation, der Verlängerung und der Schadensreaktion ab. Der Shelterin-Komplex, insbesondere der Telomer-Repeat-Bindungsfaktor 1 (TRF1) und TRF2, spielt eine zentrale Rolle beim Schutz der Telomere und hat sich als potenzielles Ziel für die Wirkstoffforschung gegen Krebs herausgestellt. Diese Proteine binden an das repetitive telomere DNA-Motiv TTAGGG und erleichtern so die Bildung von Schutzstrukturen und die Rekrutierung anderer telomerer Proteine. Strukturelle Methoden und fortschrittliche bildgebende Verfahren haben Einblicke in telomere Protein-DNA-Wechselwirkungen gegeben, aber die Untersuchung der dynamischen Prozesse erfordert Einzelmolekülansätze. Werkzeuge wie magnetische Pinzetten, optische Pinzetten und Rasterkraftmikroskopie (AFM) wurden eingesetzt, um telomere Protein-DNA-Wechselwirkungen zu untersuchen, wobei wichtige Details wie die TRF2-abhängige DNA-Verzerrung und die Telomerase-Katalyse enthüllt wurden. Die Herstellung von Einzelmolekülkonstrukten mit telomerischen repetitiven Motiven ist jedoch nach wie vor eine herausfordernde Aufgabe, die den Umfang der Studien mit mechanischen Einzelmolekülmethoden möglicherweise einschränkt. Um dies zu beheben, haben wir eine Methode entwickelt, um Wechselwirkungen mit menschlicher Telomer-DNA in voller Länge mit einer magnetischen Pinzette zu untersuchen. Dieses Protokoll beschreibt, wie TRF2 exprimiert und gereinigt, telomerer DNA präpariert, mechanische Einzelmolekül-Assays eingerichtet und Daten analysiert werden. Dieser detaillierte Leitfaden wird Forschern in der Telomerbiologie und der auf Telomere ausgerichteten Wirkstoffforschung zugute kommen.

Einleitung

Telomere sind schützende Strukturen an den Enden der Chromosomen 1,2,3. Die Erosion der Telomere während der Zellteilung führt zu Zellalterung und Zellalterung, während eine abnormale Verlängerung der Telomere zu Krebs beiträgt 4,5. Damit Telomere richtig funktionieren, müssen ihre Replikations-, Dehnungs- und Schadensreaktionen stark reguliert sein 6,7,8. Shelterin, bestehend aus sechs Untereinheiten, spielt eine zentrale Rolle beim Schutz der Telomere 9,10,11. Ein tieferes Verständnis der Telomere wird wertvolle Einblicke in die Biologie der Telomere liefern.

TRF1 und TRF2, die Kernuntereinheiten von Shelterin, sind telomerische Bindungsproteine12,13. Sowohl TRF1 als auch TRF2 binden über ihre Myb-Domänen an das repetitive DNA-Motiv TTAGGG in Telomeren14. Sie bilden durch ihre gemeinsamen TRFH-Domänen Dimere, die es ihnen ermöglichen, telomerische doppelsträngige DNA einzuschließen und die telomeren Proteine 15,16,17,18,19 zu rekrutieren. TRF2 ist besonders wichtig für die Bildung von telomeren D-Schleifen und T-Schleifen20,21. Aufgrund ihrer entscheidenden Rolle beim Telomerschutz haben sich TRF1 und TRF2 als potenzielle Angriffspunkte für Krebsmedikamente herausgestellt 22,23,24,25.

Es wurden erhebliche Anstrengungen unternommen, um die Protein-DNA-Wechselwirkungen an den Telomeren zu untersuchen. Biochemische Methoden wie der Electrophoretic Mobility Shift Assay (EMSA) und die Oberflächenplasmonenresonanz (SPR) wurden verwendet, um die Bindungsaffinitäten zu untersuchen20,26. Zahlreiche Strukturen von telomerischen Bindungsproteinen, die mit DNA komplexiert sind, wurden mittels Kryo-Elektronenmikroskopie (Kryo-EM), Röntgenkristallographie und Kernspinresonanz (NMR) aufgeklärt27,28,29. Superauflösende bildgebende Verfahren wie die stochastische optische Rekonstruktionsmikroskopie (STORM) haben die TRF2-abhängige T-Schleifenbildung nachgewiesen21. In jüngster Zeit wurde die Nanoporensequenzierung entwickelt, um die Telomersequenzen 4,30,31 zu profilieren. Diese strukturellen Erkenntnisse haben unser Verständnis der telomeren Protein-DNA-Wechselwirkungen erheblich verbessert. Um die Dynamik der telomeren Protein-DNA-Wechselwirkungen weiter zu erforschen, ist die Entwicklung neuer Technologien unerlässlich.

Einzelmolekülwerkzeuge sind leistungsfähige Techniken zur Erforschung von Protein-DNA-Wechselwirkungen am Telomer 32,33,34. Mechanische Einzelmolekülmethoden, wie z.B. magnetische Pinzetten, optische Pinzetten und AFM, wurden unter anderem eingesetzt, um die TRF2-abhängige DNA-Verzerrung zu untersuchen, die TRF2-vermittelte säulenförmige Stapelung von humanem Telomerenchromatin aufzudecken und die prozessive Telomerase-Katalyse zu beobachten 35,36,37,38,39,40. Diese Methoden sind besonders nützlich für die Untersuchung topologischer Konformationen und der Kinetik der Protein-DNA-Assoziation und -Dissoziation.

Die Herstellung von Einzelmolekül-Konstrukten mit telomeren repetitiven Motiven stellt jedoch nach wie vor Herausforderungen dar, was Studien mit einzelmolekularen mechanischen Methoden einschränkt. Um diese Einschränkung zu beheben, haben wir eine mechanische Einzelmolekülmethode entwickelt, um globale Protein-DNA-Wechselwirkungen auf menschlichen Telomeren in voller Längezu untersuchen 41. Bei dieser Methode wird telomere DNA direkt aus menschlichen Zellen extrahiert, wodurch die aufwendige Präparation künstlicher telomerer DNA umgangen wird. Es ermöglicht die Untersuchung kinetischer Prozesse an langen nativen Telomeren, die sich über mehrere Kilobasen erstrecken.

In diesem Protokoll geben wir eine detaillierte Beschreibung der Schritte zur Untersuchung von telomerischen Protein-DNA-Wechselwirkungen mit Hilfe einer magnetischen Pinzette, einem beliebten mechanischen Werkzeug für Einzelmoleküle 42,43,44. Wir zeigen am Beispiel von TRF2, wie man telomere Proteine exprimiert und aufreinigt und wie man telomere DNA aus menschlichen Zellen präpariert. Darüber hinaus zeigen wir, wie man einen Einzelmolekül-Assay auf einer magnetischen Pinzette aufbaut, um telomere Protein-DNA-Wechselwirkungen zu untersuchen, und wir behandeln die anschließende Datenanalyse von Einzelmolekül-Experimenten. Dieses Protokoll wird Forschern auf dem Gebiet der Telomerbiologie und der auf Telomere ausgerichteten Wirkstoffforschung zugute kommen.

Protokoll

1. Allgemeine Materialien und Methoden

  1. In der Materialtabelle finden Sie die in diesem Protokoll verwendeten Salze, Chemikalien, Antibiotika, Enzyme, Antikörper und Harzmaterialien.
  2. Bereiten Sie Luria-Bertani (LB) Flüssigmedium, LB-Agarplatten, HEPES-Puffer, SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE), phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) und Tris-EDTA (TE)-Puffer gemäß den Rezepten aus den Protokollen 45,46,47,48,49,50,51,52,53 vor.
  3. Erwerben Sie den pET28a-Vektor (Addgen), prokaryotische und eukaryotische Zelllinien (ATCC) über kommerzielle Quellen. Kultivieren Sie sie dann kontinuierlich und lassen Sie sie im Labor passieren.
  4. Für große Flüssigkeitsmengen 20 Minuten bei 120 °C autoklavieren. Für kleine Volumina verwenden Sie einen Sterilfilter mit einer Porengröße von 0,22 μm.
  5. Stellen Sie den pH-Wert der Lösungen mit HCl oder NaOH auf das gewünschte Niveau ein, bevor Sie sie auf ihr Endvolumen bringen.
    HINWEIS: Die magnetische Pinzette wird speziell angefertigt und in einer Umgebung von LabVIEW 2017 ausgeführt, während die Einzelmolekül-Datenanalyse in MATLAB 2017 2,54,55 durchgeführt wird.
  6. Tragen Sie aus Sicherheitsgründen langärmelige Laborkittel, Nitrilhandschuhe (oder Handschuhe aus einem Material, das undurchlässig und widerstandsfähig gegen die Substanz ist), eine Schutzbrille oder eine Schutzbrille und geschlossene Schuhe.

2. Proteinexpression und Reinigung von telomeren DNA-bindenden Proteinen

  1. Führen Sie eine Zellkultur durch und induzieren Sie die Proteinexpression.
    1. Die kodierende Sequenz für die telomeren DNA-bindenden Proteine (Abbildung 1A), TRF2 als Beispiel in diesem Fall, wird durch Enzymverdau und Ligation in den pET28a-Vektor eingefügt, wobei SUMO als Fusionsmarkierung verwendet wird. Insertion zwischen den Restriktionsstellen von BamHI und HindIII, wodurch das Plasmid von pET28a-SUMO-TRF2 entsteht (Abbildung 1B).
    2. Transformieren Sie BL21(DE3)-Zellen mit dem pET28a-SUMO-TRF2-Plasmid.
      1. Tauen Sie ein 50 μL Aliquot von kompetenten BL21(DE3)-Zellen auf Eis auf.
      2. 1 μl DNA des pET28a-SUMO-TRF2-Plasmids (enthält 50 ng DNA) wird den zuständigen Zellen zugegeben. Zum Mischen vorsichtig schwenken, ohne auf und ab zu pipettieren.
        HINWEIS: Nicht wirbeln.
      3. Die Mischung 30 min auf Eis inkubieren.
      4. Für einen Hitzeschock erhitzen Sie das Zellgemisch bei 42 °C genau 45 s lang in einem Wasserbad. Bringen Sie die Zellen sofort für 2 Minuten auf Eis, um die transformierten Zellen zu stabilisieren.
      5. Geben Sie 950 μl LB-Medium bei Raumtemperatur (RT) in die Zellen, um die Genesung zu erleichtern.
      6. Inkubieren Sie die transformierten Zellen 1 h lang bei 37 °C und schütteln Sie sie bei 220 U/min.
      7. 100 μl der Transformationsmischung auf eine LB-Agarplatte mit 50 μg/ml Kanamycin (85,8 μM) verteilen.
      8. Inkubieren Sie die plattierten Zellen über Nacht bei 37 °C. Nach der Inkubation werden unterschiedliche Kolonien für die Beimpfung von Starterkulturen ausgewählt.
        HINWEIS: Kolonien auf Platten können bis zu 2 Wochen bei 4 °C gelagert werden.
    3. Entnehmen Sie eine Kolonie der transformierten BL21(DE3)-Zellen und kultivieren Sie sie in 5 mL LB-Medium, das mit 50 μg/mL Kanamycin (85,8 μM) ergänzt wird. 18 h bei 37 °C inkubieren und bei 220 U/min schütteln.
    4. Um zu skalieren, übertragen Sie 2 mL der Übernachtkultur auf 200 mL LB-Medium mit 50 μg/mL Kanamycin (85,8 μM). Die Inkubation bei 37 °C und Schütteln bei 220 U/min fortsetzen, bis die optische Dichte bei 600 nm (OD 600) 0,6-0,8 erreicht.
    5. Entnehmen Sie 1 ml der Kultur als nicht induzierte Kontrollprobe.
    6. Die verbleibende Kultur mit Isopropyl β-d-1-thiogalactopyranosid (IPTG) auf eine Endkonzentration von 1 mM induzieren und 17 Stunden lang bei 20 °C inkubieren, um die Proteinexpression zu fördern.
    7. Führen Sie SDS-PAGE mit einem 5%igen Stapelgel und einem 10%igen Trenngel durch. Laden Sie die Proben mit SDS-PAGE-Ladepuffer und führen Sie SDS-PAGE zunächst 30 Minuten lang bei 100 V und anschließend 50 Minuten lang bei 120 V in einem Tris-Glycin-Puffer aus. Färben Sie sich mit Coomassie-Blau, um die Proteinexpression zu visualisieren (siehe Rezepte in der ergänzenden Tabelle 1) (Abbildung 1C).
      HINWEIS: Siehe Diskussion zur Fehlerbehebung, wenn der Ausdruck nicht beachtet wird.
  2. Reinigen Sie das Protein.
    1. Ernten Sie die Zellen durch Zentrifugation bei 4 °C, 8500 x g für 10 min. Entsorgen Sie den Überstand und waschen Sie das Pellet in 200 ml PBS. Zentrifugieren Sie erneut, verwerfen Sie den Überstand und resuspendieren Sie das Zellpellet in 25 ml Lysepuffer (20 mM HEPES, 300 mM NaCl, 20 mM Imidazol, 10 % Glycerin, 0,5 mM DTT, 1 mM Phenylmethylsulfonylfluorid [PMSF]).
      ACHTUNG: PMSF ist ätzend und giftig und verursacht Verbrennungen. Tragen Sie geeignete Schutzkleidung, Handschuhe und Augen-/Gesichtsschutz.
      HINWEIS: Bei -80 °C einfrieren, wenn nicht sofort fortgefahren wird.
    2. Geben Sie 5 μl 100 mg/ml Lysozym, 5 μl 1 μl DNase I und 5 μl 10 mg/ml RNase A zu den resuspendierten Zellen.
    3. Führen Sie die Beschallung auf Eis durch, mit 1 s Stößen bei 250 W, gefolgt von einer Pause von 2 s, für insgesamt 30 Minuten.
    4. Zentrifugieren Sie bei 38.000 x g, 4 °C für 40 min (30-60 min ist akzeptabel) und filtrieren Sie den Überstand durch einen 0,22 μm Spritzenvorsatzfilter.
    5. Bereiten Sie 500 ml Ni-Säulen-Bindungspuffer vor, indem Sie 8,76 g NaCl (Endkonzentration 300 mM) und 0,68 g Imidazol (Endkonzentration 20 mM) in 20 mM HEPES (pH 8,0) lösen. Die Lösung durch einen 0,22 μm Filter filtrieren.
      ACHTUNG: Imidazol ist gefährlich und kann Haut- und Augenreizungen verursachen. Es kann auch einem ungeborenen Kind schaden. Vermeiden Sie den Kontakt mit Augen, Haut und Kleidung. Nicht einnehmen oder einatmen. Tragen Sie persönliche Schutzausrüstung, einschließlich Gesichtsschutz.
    6. Bereiten Sie Ni-Säulen-Elutionspuffer (20 mM HEPES (pH 8,0), 300 mM NaCl) mit steigenden Konzentrationen von Imidazol (100 mM, 200 mM, 300 mM und 500 mM) für die schrittweise Elution vor, wobei sichergestellt wird, dass alle Puffer angemessen filtriert werden.
    7. Der filtrierte Überstand wird in Bindungspuffer (20 mM HEPES (pH 8,0), 300 mM NaCl, 20 mM Imidazol auf die voräquilibrierte Ni-Säule geladen. Waschen Sie das Protein mit Bindungspuffer und eluieren Sie das Protein mit dem vorbereiteten Imidazol-Gradienten, wobei Sie 12 Fraktionen mit jeweils 1 ml sammeln (Abbildung 1C). Kombinieren Sie Fraktionen mit einer Reinheit von >95 %.
    8. Die Konzentration des eluierten 6xHis-Sumo-TRF2-Fusionsproteins wird mit A280 in einem Spektralphotometer gemessen.
    9. Für das Protein, das in Einzelmolekül-Assays verwendet wird, fügen Sie Sumo-Protease gemäß den Anweisungen des Herstellers hinzu (typischerweise 0,125 U Protease pro 2 μg Fusionsprotein) und lassen Sie es über Nacht bei 4 °C verdauen.
    10. Nach der Sumo-Protease-Behandlung laden Sie die Mischung zurück auf eine Ni-Säule, um unverdautes Fusionsprotein und den mit His markierten Sumo zu binden, so dass das tag-freie TRF2-Protein durchfließen kann. Sammeln Sie den Durchfluss.
  3. Bestimmen Sie die Proteinkonzentration und lagern Sie das Protein.
    1. Konzentrieren Sie das gereinigte TRF2-Protein mit einer 30-kDa-Zentrifugalfiltereinheit und tauschen Sie es in einen Lagerpuffer mit 20 mM HEPES (pH 8,0), 150 mM NaCl und 0,5 mM DTT aus, um die Imidazolkonzentration auf unter 150 mM zu senken.
    2. Wiederholen Sie den Konzentrationsvorgang, bis das Volumen auf weniger als 1 ml reduziert ist.
    3. Analysieren Sie Proben aus jedem Aufreinigungsschritt mit SDS-PAGE, um die Reinheit und Integrität des Proteins zu beurteilen (Abbildung 1C).
      HINWEIS: Die Affinitätschromatographie wird verwendet, um Proteine zu reinigen, eluierte Proben zu sammeln und zu waschen und SDS-PAGE durchzuführen, um die Integrität von Proteinen zu beurteilen und die Qualitätskontrolle sicherzustellen. Wenn die Affinitätschromatographie allein die Reinheitsanforderungen nicht erfüllt, wird die Größenausschlusschromatographie eingesetzt, um die Proteinreinheit weiter zu verbessern. UV-Absorptionskurven helfen bei der Bewertung von Elutionsfraktionen, und SDS-PAGE überprüft die Proteinintegrität und gewährleistet so eine strenge Qualitätskontrolle während des gesamten Prozesses.
    4. Geben Sie Glycerin in einer Endkonzentration von 50 % zu dem konzentrierten und pufferausgetauschten Protein zur Lagerung.
    5. Lagern Sie das Protein bei -80 °C.

3. Präparation von humanen Telomerrestriktionsfragmenten

  1. Extrahieren Sie genomische DNA.
    1. Gemäß dem Flussdiagramm (Abbildung 2A) werden 1 x 107 Zellen bei 1000 x g für 3 min zentrifugiert und der Überstand verworfen. Zum Waschen werden die Zellen in 200 μl PBS resuspendiert, erneut bei 1000 x g für 3 min zentrifugiert und der Überstand verworfen.
    2. Geben Sie 760 μl Puffer mit 50 mM Tris-HCl (pH 8,0), 100 mM NaCl, 100 mM EDTA und 1 % SDS in das Röhrchen mit 1 x 107 Zellen und resuspendieren Sie es vorsichtig durch Pipettieren, um Luftblasen zu vermeiden.
      HINWEIS: Nicht wirbeln.
    3. Für den Verdau von Proteinen und die Eliminierung von DNasen und RNasen in der Probe ist Proteinase K in einer Endkonzentration von 0,5 mg/ml zuzugeben, was 40 μl einer 10 mg/ml-Stammlösung entspricht. Klopfen Sie zum Mischen auf den Boden des Rohrs (nicht verwirbeln).
    4. Über Nacht bei 37 °C inkubieren.
    5. Fügen Sie 265 μl 5,4 M NaCl hinzu. 5 Minuten lang mischen, indem Sie die Tube fünfmal pro Minute umdrehen, dann 20 Minuten auf Eis legen.
    6. Zentrifugieren Sie bei maximaler Drehzahl (z. B. 16.900 x g) für 10 Minuten bei RT.
    7. Übertragen Sie den Überstand in ein Zentrifugenröhrchen und fügen Sie ein gleiches Volumen Isopropanol (ca. 750 μl) hinzu, wobei schwimmende Lipide oder Sedimente vermieden werden. Die DNA befindet sich im Überstand.
    8. Drehen Sie das Rohr zum Mischen fünfmal um. Bestätigen Sie visuell das Vorhandensein eines DNA-Pellets, das sich im Zentrifugenröhrchen ausfällt.
    9. Zentrifugieren Sie bei RT bei maximaler Drehzahl für 10 Minuten.
    10. Entsorgen Sie den Überstand. Waschen Sie das DNA-Pellet mit 500 μl 70%igem Ethanol, indem Sie das Zentrifugenröhrchen fünfmal umdrehen.
      HINWEIS: Das Pellet ist DNA.
    11. Zentrifugieren Sie bei RT bei maximaler Drehzahl (z. B. 16.900 x g) für 10 min.
    12. Entfernen Sie vorsichtig den gesamten Überstand und lassen Sie das DNA-Kügelchen zurück. Lassen Sie das Pellet 5 min bei RT an der Luft trocknen.
      HINWEIS: Vermeiden Sie eine Übertrocknung, da sich genomische DNA nur schwer auflösen lässt.
    13. Resuspendieren Sie das DNA-Pellet in 475 μl TE-Puffer (10 mM Tris-HCl [pH 8,0], 1 mM EDTA). Mischen Sie vorsichtig, indem Sie auf den Boden der Tube klopfen. Für den Verdau der RNA während der DNA-Aufbereitung fügen Sie 25 μl 10 mg/ml RNase A (Endkonzentration 0,5 mg/ml) hinzu und mischen Sie durch leichtes Klopfen, bis sich das DNA-Pellet vollständig aufgelöst hat.
      HINWEIS: Vermeiden Sie Vortexing, um DNA-Scherungen zu verhindern.
    14. Inkubieren Sie die DNA-Probe über Nacht bei 4 °C.
    15. Führen Sie eine Extraktion aus Tris-gesättigtem Phenol mit gleichem Volumen durch: Geben Sie 500 μl Phenol in das Zentrifugenröhrchen, mischen Sie es vorsichtig mit einer Pipette und zentrifugieren Sie es 10 Minuten lang bei maximaler Geschwindigkeit bei 4 °C.
      ACHTUNG: Der Kontakt mit Phenol kann zu Reizungen der Haut, der Augen, der Nase, des Rachens und des Nervensystems führen. Vermeiden Sie den Kontakt mit Augen, Haut und Kleidung. Nicht einnehmen oder einatmen. Tragen Sie persönliche Schutzausrüstung, einschließlich Gesichtsschutz.
      HINWEIS: Die DNA befindet sich in der oberen wässrigen Phase, die Proteine in der Interphase und die organische Phase in der unteren Phase.
    16. Wiederholen Sie dies dreimal. Nehmen Sie den DNA-Überstand (ca. 280 μl).
    17. Je nach Volumen der DNA-Probe werden 1/10 Volumen (28 μl) 3 M Natriumacetat (Endkonzentration 0,3 M, pH 5,2) und 2 Volumen (616 μl) kaltes 100%iges Ethanol zugegeben. Stellen Sie das Zentrifugenröhrchen 2-3 h lang auf -80 °C.
    18. Zentrifugieren Sie bei maximaler Drehzahl (z. B. 16.900 x g) für 10 min bei 4 °C. Tauen Sie die Lösung vor der Zentrifugation auf Eis auf, wenn sie gefroren ist.
    19. Entsorgen Sie den Überstand und waschen Sie ihn 3-4 Mal mit 70% Ethanol, indem Sie das Zentrifugenröhrchen umdrehen. Zentrifugieren Sie 5 Minuten lang bei maximaler Drehzahl bei 4 °C.
    20. Entfernen Sie das Ethanol und lassen Sie das Pellet 5 Minuten lang bei RT an der Luft trocknen.
    21. Fügen Sie 100 μl TE-Puffer hinzu, klopfen Sie zum Mischen auf das Röhrchen und lassen Sie es 2 Stunden lang bei 4 °C ruhen, damit es sich vollständig auflöst.
      HINWEIS: Untersuchen Sie die Integrität der genomischen DNA auf einem 1%igen Agarosegel (Abbildung 2B).
    22. Lagern Sie die DNA bei -20 °C im Gefrierschrank. Er bleibt mindestens 1 Jahr lang stabil.
  2. Führen Sie den Verdau und die Modifikation der genomischen DNA durch.
    1. Nehmen Sie 4 μg genomische DNA und kombinieren Sie sie mit 1 μl CviAII (10 U), 2 μl 10x Verdauungspuffer (siehe Ergänzende Tabelle 1 für Rezepte) und fügen Sie Wasser hinzu, um ein Gesamtvolumen von 20 μl zu erreichen. Inkubieren Sie die Mischung bei 25 °C für 12 h.
      HINWEIS: FatI kann CviAII ersetzen, das jetzt von NEB eingestellt wird.
    2. Geben Sie 1 μl NdeI (20 U), 1 μl MseI (10 U) und 1 μl BfaI (10 U) in dasselbe Röhrchen, das die vorherige Mischung (20 μl) enthält. Fügen Sie außerdem 2 μl 10x Aufschlusspuffer und 15 μl Wasser hinzu, um ein Gesamtvolumen von 40 μl zu erreichen. Inkubieren Sie 12 h lang bei 37 °C und inaktivieren Sie dann alle Enzyme 20 Minuten lang bei 80 °C.
      HINWEIS: Der Verdau genomischer DNA kann mit der Methode des terminalen Restriktionsfragments (TRF) untersucht werden (Abbildung 2C). Die Kombination der vier Restriktionsenzyme (CviAII, NdeI, MseI und BfaI) verdaut die genomische DNA in Fragmente von etwa 800 bp und liefert die TRFs mit minimaler subtelomerer DNA-Kontamination.
    3. Für die Digoxigenin-Modifikation nehmen Sie 40 μl der verdauten genomischen DNA und fügen Sie 4 μl 1 mM dATP (Endkonzentration 0,08 mM), 4 μl 1 mM Digoxigenin-11-dUTP (Endkonzentration 0,08 mM), 1 μl Klenow-Fragment (5 U), 0,5 μl 100 mM DTT (Endkonzentration 1 mM) und 1 μl 10x Aufschlusspuffer hinzu. Inkubieren Sie 12 Stunden lang bei 37 °C und erhitzen Sie es 20 Minuten lang bei 75 °C, um das Klenow-Fragment zu inaktivieren.
    4. Für die Biotinmarkierung nehmen Sie 12,5 μl der Digoxigenin-modifizierten genomischen DNA (1 μg) und fügen Sie 1 μl einer 1 μM biotinylierten Telomersonde (d. h. 1 pmol) hinzu, die zum telomerischen einzelsträngigen Überhang komplementär ist. Fügen Sie 611,5 μl TE Li-Puffer (10 mM Tris-HCl (pH 8,0), 1 mM EDTA, 50 mM LiCl hinzu, um die 50 mM K-Ionen auf 1 mM zu verdünnen, wodurch ein Gesamtvolumen von 625 μl entsteht, das in 16 Röhrchen mit je 39 μl aufgeteilt werden kann.
    5. In einem Thermocycler 3 min lang auf 75 °C erhitzen, dann die Temperatur alle 30 s um 0,1 °C senken, bis sie 25 °C erreicht.
    6. Lagern Sie die DNA-Proben mindestens ein Jahr lang bei -20 °C.

4. Einrichten einer Durchflusszelle für telomere DNA-Proben auf einer magnetischen Pinzette

  1. Stellen Sie eine Durchflusszelle für Einzelmolekül-Assays her.
    1. Mit einer elektrischen Schleifmaschine Löcher als Ein- und Auslass in die oberen Deckgläser bohren (# 2 Deckglas mit einer Dicke von 0,2 mm).
    2. Reinigen Sie die Deckgläser 30 Minuten lang mit Reinigungsmittel durch Ultraschall.
    3. Waschen Sie die Eindeckeinlagen 3 Mal mit Reinstwasser.
    4. Reinigen Sie die Deckgläser 30 Minuten lang mit Isopropanol durch Ultraschall.
    5. Waschen Sie die Deckgläser 3 Mal mit Reinstwasser.
    6. Reinigen Sie die Deckgläser in ultrareinem Ultraschall für 15-30 Minuten.
    7. Trocknen Sie die Deckgläser mit Stickstoff.
      HINWEIS: Hier kann das Protokoll gestoppt werden und die gereinigten Deckgläser können für die spätere Verwendung aufbewahrt werden.
    8. Die unteren Deckgläser (ohne Löcher) mit 20 μl 0,1 % Nitrocellulose beschichten und Referenzkügelchen (20-fache Verdünnung, 3 μm Durchmesser) hinzufügen. Bei 100 °C 4 Min. backen.
    9. Verwenden Sie ein Skalpell, um doppellagige Parafilm-Abstandshalter nach einer Metallform zu schneiden. Die Form ist ein rechteckiges Stück aus Aluminiumlegierung mit den gleichen Abmessungen wie das Deckglas und mit einer ausgehöhlten Mitte, um das Schneiden von Kanälen zu erleichtern.
    10. Montieren Sie das Durchflusszellen-Sandwich (Abbildung 3A). Auf 85 °C erhitzen und mit zwei Tupfern einmassieren, bis der Parafilm den Kanal versiegelt.
    11. Beschichten Sie die Durchflusszelle mit einem Antikörper. Injizieren Sie 70 μl Anti-Digoxigenin-Antikörper (0,1 mg/ml) direkt in die Durchflusszelle. Lassen Sie das Restaurant für 1 Stunde bei RT stehen.
    12. Passivieren Sie die Durchflusszelle. Injizieren Sie 70 μl 10 mg/ml BSA, um den Anti-Digoxigenin-Antikörper zu verdrängen. Abfahrt bei RT für 12 Stunden. Ungebundene Anti-Digoxigenin-Antikörper werden in den folgenden Schritten durch rigoroses Spülen weggespült.
      HINWEIS: Lagern Sie die Durchflusszelle 1-2 Wochen lang bei 4 °C.
    13. Test auf unspezifische Bindung, indem 5 μl gewaschene MyOne (10 mg/ml) (oder 5 μl gewaschene M270 (10 mg/ml)) Kügelchen ohne DNA in die Durchflusszelle gespült werden. 10 Minuten einwirken lassen, dann die Kügelchen mit einem Arbeitspuffer (20 mM HEPES (pH 7,5), 100 mM NaCl, 1 mM EDTA) wegspülen. Zählen Sie die Anzahl der Perlen, die in einem Sichtfeld an der Oberfläche haften. Eine gut behandelte Oberfläche sollte null oder nur wenige Kügelchen aufweisen.
  2. Isolierung und Immobilisierung von telomerischen DNA-Fesseln in einer Durchflusszelle.
    1. Nehmen Sie 10 μl M270-Kügelchen (10 mg/ml) oder 5 μl 10 mg/ml MyOne und waschen Sie sie fünfmal mit 50 μl Arbeitspuffer (20 mM HEPES [pH 7,5], 100 mM NaCl, 1 mM EDTA) mit einem Magneten.
    2. Nehmen Sie 500 ng verdaute genomische DNA und geben Sie sie in ein 1,5-ml-Zentrifugenröhrchen. Geben Sie alle Kügelchen (50 μl) auf die DNA-Probe.
    3. Bewegen Sie das Zentrifugenröhrchen ohne Pipettieren einige Male vorsichtig, um die Kügelchen und die DNA-Probe zu mischen. Lassen Sie die Mischung 1 h auf Eis. Waschen Sie dreimal mit 500 μl Arbeitspuffer mit einem Magneten, um die Kügelchen nach unten zu ziehen, in Abständen von 10 Minuten zwischen den Wäschen.
    4. Resuspendieren Sie die Probe mit 30 μl Arbeitspuffer und laden Sie die Mischung in die Durchflusszelle. 30 Min. ziehen lassen. Bündige ungebundene Magnetperlen.
      HINWEIS: Telomere DNA ist zwischen dem unteren Deckglas und der magnetischen Perle durch Affinitätswechselwirkungen gebunden, die durch Digoxigenin-Antikörper und Biotin-Streptavidin vermittelt werden (Abbildung 3B).
  3. Richten Sie eine Durchflusszelle an einer magnetischen Pinzette ein
    1. Reinigen Sie die Durchflusszelle mit 70% Ethanol und trocknen Sie die Oberfläche mit einem Linsentuch. Setzen Sie die gereinigte Durchflusszelle auf den unteren Probenhalter und montieren Sie das obere Probenrack vorsichtig mit einem Schraubendreher.
    2. Tragen Sie einen Tropfen Linsenöl auf die Unterseite der Durchflusszelle auf, wo es mit der Objektivlinse ausgerichtet ist. Setzen Sie dann den Probenhalter auf die Objektivlinse und befestigen Sie ihn mit einem Schraubendreher.
    3. Wählen Sie ein Paar kubischer 5-mm-Magnete, die in einer vertikalen Konfiguration angeordnet sind. Richten Sie den Magnethalter für die Bildgebung an der X-Achse des Strahlengangs der magnetischen Pinzette aus.
      HINWEIS: Dies ist ein kritischer Schritt. Die Richtung des Magnetfeldes wird ausgerichtet und somit durch die Ausrichtung des Magnethalters bestimmt.
    4. Starten Sie die grafische Programmiersoftware und schließen Sie die Controller für die magnetische Pinzette an. Passen Sie das Sichtfeld so an, dass sich eine Referenzperle am unteren Rand der Durchflusszelle befindet, und stellen Sie die Objektivlinse leicht so ein, dass die Referenzperle klare Beugungsringe zeigt.
    5. Bewegen Sie die Magnete nach unten an die Oberseite der Durchflusszelle.
      HINWEIS: Dies ist ein kritischer Schritt. Plötzliche Veränderungen des Beugungsmusters der Beads deuten darauf hin, dass die Magnete gerade die Oberfläche der Durchflusszelle berührt haben. Diese Position gilt als Versatz für den Messnullpunkt.
      HINWEIS: Senken Sie die Magnete vorsichtig ab, beginnen Sie mit größeren Schritten und gehen Sie allmählich zu kleineren Schritten über. In Schritten von 0,1 mm bewegen, um eine Beschädigung der Durchflusszelle zu vermeiden, wenn Sie sich der Durchflusszelle nähern.
    6. Heben Sie die Magnete in ihre höchste Position und entfernen Sie den Magnethalter.
    7. Schalten Sie die an die Abfallflasche angeschlossene Schlauchpumpe ein und entsorgen Sie die Flüssigkeit. Geben Sie 100 μl Arbeitspuffer in den Einlass und stellen Sie die Durchflussrate der Schlauchpumpe auf 100 μl/min ein, um die Durchflusszelle mit Puffer zu füllen.

5. Messungen eines Telomers mit einer magnetischen Einzelmolekülpinzette

  1. Richten Sie die Kamera ein.
    1. Stellen Sie die Graustufen der CMOS-Kamera (Complementary Metal-Oxide Semiconductor) mit einer Helligkeitsanpassung auf 150 Stufen ein.
    2. Definieren Sie die Größe des Interessenbereichs (ROI).
    3. Stellen Sie die Bildrate auf 200 Hz mit einer Belichtungszeit von 5000 μs ein.
      HINWEIS: Dies ist ein kritischer Schritt. Stellen Sie sicher, dass die Totzeit des Verschlusses auf Null eingestellt ist.
    4. Verschieben Sie die Magnetposition auf 3 cm (ca. 8 pN) und stellen Sie den Objektivfokus auf die Perlen ein.
  2. Richten Sie die Nachschlagetabelle (LUT) ein.
    1. Bewegen Sie die Magnete in eine Position, die 8 pN entspricht, um die DNA-gebundene Magnetkugel fest zu dehnen.
    2. Stellen Sie die LUT auf 200 Schritte mit einer Schrittweite von 0,05 μm ein.
    3. Verwenden Sie eine CMOS-Kamera, um die Profile der magnetischen Kügelchen an verschiedenen Positionen zu erfassen und so die LUT zu ermitteln.
      HINWEIS: Dies ist ein kritischer Schritt. In der Durchflusszelle fixierte Polystyrolkügelchen dienen als Referenzkügelchen, um die Abdrift der interessierenden Kügelchen zu verhindern.
  3. Entwerfen Sie ein mechanisches Experiment mit einem einzelnen Molekül.
    1. Schreiben Sie ein Skript in MATLAB, um Motorbewegungen für Kraftrampen- oder Kraftsprung-Assays zu steuern.
      HINWEIS: Dies ist ein kritischer Schritt. Dieses Skript codiert die Befehle für Magnetbewegungen. In diesem Schritt wird die Kraftbelastungsrate für einen Kraftrampen-Assay festgelegt. Hier werden auch die Höhe und Dauer der Kraftsprungproben bestimmt (Abbildung 4, Zusatzdatei 1, Zusatzdatei 2 und Zusatzdatei 3).
    2. Importieren Sie das Skript in eine grafische Programmiersoftware, um die Einzelmolekülexperimente zu testen.
    3. Überprüfen Sie die Gesamtzahl der Frames, die für die Ausführung des Einzelmolekülexperiments erforderlich sind, und stellen Sie sicher, dass der verfügbare Speicher diese Anforderung überschreitet.
      HINWEIS: Daten gehen verloren, wenn der zugewiesene Speicher geringer ist als erforderlich, da das Speichern von Daten einige Zeit in Anspruch nimmt.
    4. Überprüfen Sie die maximale Bildgebungsgeschwindigkeit, um die maximale Anzahl von Beads zu bestimmen, die gleichzeitig überwacht werden können.
      HINWEIS: Das Experiment wird beendet, wenn die Geschwindigkeitsbegrenzung für die Bildgebung überschritten wird.
    5. Führen Sie am Beispiel eines Kraftsprung-Assays das mechanische Einzelmolekül-Experiment durch. Auf die magnetische Kugel werden schlagartig Kräfte ausgeübt, die diese Kräfte auf das DNA-Molekül übertragen und es sofort nach oben dehnen.

6. Messungen von TRF1/2 an einem Telomer mit einer magnetischen Pinzette

  1. Kraftrampen-Assay
    1. Laden Sie am Beispiel von TRF1 200 μl 10 nM TRF1 mit einer langsamen Durchflussrate (z. B. 30 μl/min) in die Durchflusszelle. Warten Sie 30 Minuten, bis TRF1 an die Telomer-DNA gebunden ist.
    2. Wählen Sie ein Skript für ein Kraftrampenexperiment mit einer Kraftbelastungsrate von ±1 pN/s aus.
    3. Benennen Sie die Datendateien entsprechend, und führen Sie das Experiment aus. Die Daten werden zur Analyse an dem angegebenen Ziel gespeichert (Abbildung 5).
      HINWEIS: Während dieses Experiments wird die Kraft linear zwischen 0 pN und 17 pN erhöht und verringert, wodurch die telomerische DNA gedehnt und entspannt und die durch TRF1/2 vermittelten DNA-Schleifen aufgebrochen werden.
  2. Force Jump-Assay
    1. Wählen Sie ein Skript aus, um einen Force-Jump-Assay auszuführen.
      HINWEIS: Um die Telomer-DNA zu dehnen, werden verschiedene Kräfte angewendet, z. B. die "Ruhekraft" (Frest) bei 0 pN für 40 s, die "Testkraft" (Ftest) im Bereich von 2-8 pN für 60 s, die "Hohe Kraft" (Fhigh) bei 10 pN für 30 s und die "Maximale Kraft" (Fmax) bei 20 pN für 30 s.
    2. Benennen Sie die Datendateien entsprechend, und führen Sie das Experiment aus. Die Daten werden zur Analyse an dem angegebenen Ziel gespeichert (Abbildung 5).

Ergebnisse

Abbildung 1A zeigt die schematischen Domänen und Strukturen von TRF1 und TRF2, bestehend aus 439 bzw. 542 Aminosäuren, die in prokaryotischen Zellen exprimiert werden können. Die Herstellung von TRF1 wurde bereits in der Literatur beschrieben41. Im Folgenden finden Sie eine umfassende Beschreibung und repräsentative Ergebnisse der Aufbereitung von TRF2. Abbildung 1B zeigt die Plasmidkarte, die für di...

Diskussion

Dieses Protokoll verwendet eine magnetische Pinzette zur Manipulation von TRFs auf Einzelmolekülebene 57,58,59. Wir verwenden magnetische Kügelchen, um TRFs von genomischen DNA-Fragmenten zu trennen. Nach dem Restriktionsverdau binden TRFs an die magnetischen Kügelchen und ermöglichen so eine einfache Trennung von genomischen DNA-Fragmenten. Dieser Ansatz ermöglicht die Manipulation mit ein...

Offenlegungen

Die Autoren erklären, dass keine konkurrierenden finanziellen Interessen oder sonstige Interessenkonflikte bestehen.

Danksagungen

Diese Arbeit wurde unterstützt von der National Natural Science Foundation of China [Grant 32071227 to Z.Y.], der Tianjin Municipal Natural Science Foundation of China (22JCYBJC01070 bis Z.Y.) und dem State Key Laboratory of Precision Measuring Technology and Instruments (Tianjin University) [Grant pilab2210 to Z.Y.].

Materialien

NameCompanyCatalog NumberComments
Anti-DigoxigeninRoche11214667001
BfaINew England Biolab (NEB)R0568S
BSASigma-AldrichV900933
CMOS camera MikrotronMC1362
CviAIINew England Biolab (NEB)R0640S
DIG-11-dUTPJena BioscienceNU-803-DIGXL
DNA extraction solutionG-CLONEEX0108
Dnase I, Rnase-Free, Hc EaThermo Fisher ScientificEN0523
dNTP mixtureNanjing Vazyme Biotech Co., Ltd (Vazyme)P032-02
DTTSolarbioD1070
Dynabeads M-270  beadsThermo Fisher Scientific65305Streptavidin beads
Dynabeads MyOne beadsThermo Fisher Scientific65001Streptavidin beads
EthanolTianjin No.6 Chemical Reagent Factory1083
GlycerolBeijing Hwrkchemical Co,. LtdSMG66258-1
ImidazoleSolarbioII0070
IPTGSolarbioI8070
IsopropanolTianjin No.6 Chemical Reagent FactoryA1079
KanamycinThermo Fisher ScientificEN0523
Klenow fragment (3′-5′ exo-)New England Biolab (NEB)M0212S
LabViewNational Instrumentshttps://www.ni.com/en-us/shop/product/labview.htmlGraphical programming software 
LiClBide Pharmatech Co., Ltd (bidepharm)BD136449
LysozymeSolarbioL8120-5
MseINew England Biolab (NEB)R0525S
NaClShanghai AladdinC111533
NanoDropThermo Fisher ScientificSpectrophotometer
NdeINew England Biolab (NEB)R0111S
Ni NTA Beads 6FFChangzhou Smart-Lifesciences Biotechnology Co.,LtdSA005025
Nitrocellulose membraneABclonalRM02801
PMSFSolarbioP8340
Proteinase KBeyotime Biotech Inc (beyotime)ST535-500mg
rCutSmart BufferNew England Biolab (NEB)B6004S
Rnase ASigma-AldrichR4875
Sodium acetateSERVA Electrophoresis GmbH2124902
Sumo proteaseBeyotime Biotech Inc (beyotime)P2312M

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