حذف الجينات بوساطة CRISPR-Cas9 في الخلايا الجذعية البشرية متعددة القدرات المزروعة في ظروف خالية من المغذيات

Summary

تصف الطريقة المقدمة توليد ضربة قاضية جينية بوساطة كريسبر في خط الخلايا الجذعية الجنينية البشرية (hESC) H9 ، والذي يعبر بثبات عن sgRNAs التي تستهدف جين L2HGDH باستخدام نظام توصيل الجينات بوساطة الفيروسية عالية الكفاءة.

Abstract

أحدث نظام CRISPR-Cas9 لتحرير الجينوم ثورة في دراسات وظائف الجينات في خلايا الثدييات ، بما في ذلك الخلايا الجذعية. ومع ذلك ، فإن التطبيق العملي لهذه التقنية ، لا سيما في الخلايا الجذعية متعددة القدرات ، يمثل تحديات معينة ، مثل كونها كثيفة الوقت والعمالة وكفاءة التحرير المنخفضة. هنا ، نصف توليد ضربة قاضية جينية بوساطة كريسبر في خط الخلايا الجذعية الجنينية البشرية (hESC) الذي يعبر بثبات عن sgRNAs لجين L2HGDH ، باستخدام نظام توصيل جيني بوساطة فيروسات عدسية عالية الكفاءة ومستقرة. تم تصنيع sgRNAs التي تستهدف exon 1 من جين L2HGDH كيميائيا واستنساخها في ناقل lentiCRISPR v2-puro ، والذي يجمع بين التعبير التأسيسي ل sgRNAs مع Cas9 في نظام ناقل أحادي عالي الكفاءة لتحقيق عيار أعلى للفيروسات العدسية لعدوى hESC والاختيار المستقر باستخدام بورومايسين. تم توسيع الخلايا المختارة من بورومايسين بشكل أكبر ، وتم الحصول على استنساخ أحادي الخلية باستخدام طريقة التخفيف المحدود. تم توسيع المستنسخة المفردة ، وتم الحصول على العديد من المستنسخة بالضربة القاضية متماثلة اللواقح لجين L2HGDH ، كما تم تأكيده من خلال انخفاض بنسبة 100٪ في تعبير L2HGDH باستخدام تحليل اللطخة الغربية. علاوة على ذلك ، باستخدام MSBSP-PCR ، تم تعيين موقع طفرة CRISPR في المنبع من تسلسل التعرف على PAM ل Cas9 في المستنسخة متماثلة اللواقح المختارة. تم إجراء تسلسل Sanger لتحليل عمليات الإدراج / الحذف الدقيقة ، وتم إجراء التوصيف الوظيفي للنسخ. أنتجت هذه الطريقة نسبة أعلى بكثير من عمليات الحذف متماثلة اللواقح مقارنة بطرق توصيل الجينات غير الفيروسية التي تم الإبلاغ عنها سابقا. على الرغم من أن هذا التقرير يركز على جين L2HGDH ، إلا أنه يمكن استخدام هذا النهج القوي والفعال من حيث التكلفة لإنشاء ضربة قاضية متماثلة اللواقح للجينات الأخرى في الخلايا الجذعية متعددة القدرات لدراسات وظائف الجينات.

Introduction

الخلايا الجذعية الجنينية البشرية (hESCs) والخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات (iPSCs) هي خلايا جذعية لديها القدرة على التمايز إلى جميع أنواع الخلايا في الجسم. تعمل هذه الخلايا كأدوات قيمة لدراسة التنمية البشرية ، وكذلك لفهم الآليات الأساسية للأمراض المختلفة ، مما يوفر وعدا هائلا للطب التجديدي ونمذجة الأمراض واكتشاف الأدوية. تتضمن هذه الدراسات التحقيق في كيفية مساهمة جينات معينة في تطوير الكائنات الحية وعملها وتنظيمها^1،2.

يتم استخدام تقنيات وأساليب مختلفة لفك تشفير وظيفة الجينات ، بما في ذلك التلاعب الجيني ، مثل الضربة القاضية للجينات أو الإفراط في التعبير ، وتحرير الجينوم. من بين هؤلاء ، برزت تقنية CRISPR-Cas9 كأكثر الطرق فعالية لدراسات خروج المغلوب الجيني وتحرير الجينات^1،2،3. يعمل نظام CRISPR-Cas9 من خلال استخدام جزيء RNA واحد (sgRNA) مصمم خصيصا لتحديد تسلسل DNA معين ذي أهمية والارتباط به. يعمل sgRNA كدليل جزيئي ، ويوجه إنزيم Cas9 إلى الموقع الدقيق في الجينوم الذي يتطلب التعديل. بمجرد ربطه ، يبدأ Cas9 في كسر مزدوج الشريطة في الحمض النووي في الموقع المحدد. بعد انقسام الحمض النووي ، يتم تنشيط آليات الإصلاح المتأصلة في الخلية. وتشمل هذه مسارين رئيسيين للإصلاح: الانضمام النهائي غير المتماثل (NHEJ) والإصلاح الموجه بالتماثل (HDR). غالبا ما يؤدي NHEJ إلى عمليات إدخال أو حذف (indels) في موقع الكسر ، مما يؤدي إلى تعطيل الجينات أو تعطيلها. على العكس من ذلك ، يتيح HDR إدخال تسلسلات DNA جديدة في موقع الكسر ، مما يسهل إدخال التعديلات الجينية^{المستهدفة 4}.

نظرا لأهمية حذف الجينات في الخلايا الجذعية متعددة القدرات ، تم نشر العديد من البروتوكولات على الضربة القاضية الجينية بوساطة CRISPR-Cas9 في hESCs / iPSCs. ومع ذلك ، تواجه العديد من هذه البروتوكولات قيودا كبيرة ، مثل كونها تستغرق وقتا طويلا للغاية ، وكثيفة العمالة ، وذات كفاءة منخفضة بسبب استخدام طرق توصيل الجينات غير الفيروسية⁵. هذه التحديات أكثر وضوحا في hESCs / iPSCs ، حيث من المعروف أن هذه الخلايا تتمتع بكفاءة تحرير أقل مقارنة بأنواع الخلايا الأخرى⁵. يمكن معالجة بعض هذه القيود عن طريق زيادة كفاءة توصيل البلازميد الذي يحتوي على Cas9 و sgRNAs. يمكن تحقيق ذلك بنجاح باستخدام نظام ناقل الفيروسات ، والذي يمكن أن يحسن بشكل كبير نتائج تحرير الجينات. بروتوكولات تغليف الفيروسات العدسية راسخة ومباشرة ، مما يسمح باعتمادها السهل في المختبرات ، حتى من قبل الباحثين ذوي الخبرة المحدودة. تظهر فيروسات العدسات كفاءة عدوى عالية عبر أنواع مختلفة من الخلايا ، بما في ذلك hESCs و iPSCs. لذلك ، يعد استخدام نظام العدسي الفيروسي لتعبير Cas9-sgRNA مثاليا لتجارب التحرير الجيني الروتينية في hESCs / iPSCs لدراسات وظائف الجينات.

هنا ، نقدم طريقة بسيطة ومباشرة لعمليات حذف الجينات المستندة إلى CRISPR-Cas9 عالية الكفاءة في hESCs في فترة زمنية أقصر نسبيا من البروتوكولات التقليدية (الشكل 1). على الرغم من استخدام ناقل فيروسي عدسي مع تعبير تأسيسي ل Cas9 و sgRNA ، إلا أنه يمكن استبداله بسهولة بتعبير Cas9 المحفز عن الدواء لتعبير Cas9 الذي يمكن التحكم فيه.

Protocol

يتم سرد تفاصيل التسلسلات الجينية والكواشف والمعدات المستخدمة في هذه الدراسة في جدول المواد.

1. تصميم الحمض النووي الريبي الفردي (sgRNA) والاستنساخ وإنتاج نواقل الفيروسات العدسية

ملاحظة: يتم استخدام تسلسلين مختلفين من sgRNA يستهدفان exon 1 من L2HGDH الجين ، وكلاهما مقتبس من Qiu et ^al.6مع مواقع PAM ل AGG و TGG للتسلسلين 1 و 2 ، على التوالي. كان طول كل من sgRNAs 20 نقطة أساس ، وتم تعديل النهايات لإضافة تسلسلات رابط لإنزيم التقييد Bsmb1 ليتم استنساخه في المتجه المستهدف (LentiCRISPRv2) كما هو موضح في التقرير السابق⁶. تمت إضافة تسلسلات الرابط أثناء تصميم sgRNAs لأغراض الاستنساخ.

1. صلب sgRNAs المركبة كيميائيا⁶ واستنساخ في ناقل الفيروس العسسي أحادي القطع Bsmb1 ، LentiCRISPRv2 باستخدام بروتوكول محسن كما تم الإبلاغ عنه^{سابقا 7}.
2. استمر في تعبئة الفيروسات العدسية وتركيزها باستخدام بروتوكول موحد ومحسن⁷.
3. لإنتاج الفيروسات العدسية، HEK293T البذور الخلايا (1 × 10⁵ خلايا/سم²) باستخدام DMEM، و 10٪ FBS و 1x البنسلين/الستربتومايسين (P / S) وتحتضن طوال الليل في حاضنة زراعة الأنسجة عند 37 درجة مئوية في جو من 5٪ ثاني أكسيد الكربون₂ في ظروف رطبة.
4. عندما تكون 90٪ ملتقية ، فإن الخلايا HEK293T ذات ناقل الدخول (العمود الفقري الفارغ أو sgRNA الذي يعبر عن البلازميدات) وتعبئة البلازميدات باستخدام البوليمر الكاتيوني منخفض التكلفة PEI كما هو موضح^{سابقا 7}.
5. اجمع الوسائط المكيفة التي تحتوي على جزيئات الطافي الفيروسي (LVS) في 48 ساعة و 72 ساعة بعد التعدي والمضي قدما في الطرد المركزي الفائق باستخدام وسادة السكروز وقم بتدوير الأنابيب عند 1،25،000 × جم لمدة ساعتين عند 4 درجات مئوية.
6. استمر في تركيز جسيمات LVS إلى ما لا يقل عن 200 ضعف الحجم الأصلي في PBS ، aliquot ، وقم بتخزينه عند -80 درجة مئوية حتى الاستخدام.
7. حدد عيار جزيئات الفيروسات العدسية باستخدام مجموعة أدوات قياس المعايرة من الفيروسات العدسية qPCR باتباع تعليمات الشركة المصنعة (انظر جدول المواد).

2. الالتهابات الفيروسية وانتشار نسيلة خلية واحدة

1. بالنسبة للعدوى بجزيئات LVS ، تحتوي معلق خلية البذور hESC (H9) على 1 × 10⁵ خلايا / 0.5 مل من وسائط ثقافة hESC (الوسائط القاعدية + P / S + 10 ميكرومتر من مثبط الصخور) على ألواح بئر P24 مطلية بالكامل ب Matrigel (1:50) في 500 ميكرولتر من الوسائط وتحتضن طوال الليل للسماح للخلايا بالالتصاق. بذر الآبار الإضافية التي لن تصاب ب LVS ولكنها تعالج بالبورومايسين لتكون بمثابة مكافحة غير مصابة.
   ملاحظة: يمكن إجراء عد الخلايا باستخدام مقياس كثافة الدم اليدوي أو عداد الخلايا الآلي.
2. في اليوم التالي ، قم بإصابة الخلايا عند تعدد العدوى (MOI) من 10 جنبا إلى جنب مع 8 ميكروغرام / مل من البوليبرين واحتضانها عند 37 درجة مئوية لمدة 8 ساعات متبوعة باستبدال الوسائط بوسائط hESC جديدة + P / S بدون مثبط الصخور واستمر في الزراعة حتى تتلاقى الخلايا بنسبة 90٪.
3. ابدأ في اختيار البيرومايسين عن طريق استكمال الوسائط بتركيز 0.8 ميكروغرام / مل من بورومايسين عندما تصل الخلايا إلى 90٪ من التقاء ، والذي عادة ما يكون 48-72 ساعة بعد الإصابة ، واستمر في الانتقاء حتى تموت جميع الخلايا في الخلايا غير المصابة (المجموعة الضابطة).
4. بعد اكتمال الاختيار (عادة 4-6 أيام) ، قم بتقسيم الخلايا المستقرة (1: 4) وقم بالتوسع للحفظ بالتبريد وإجراء مزيد من التحليل.
5. قم بإجراء اختيار خلية واحدة وتمدد نسيلي باستخدام الخلايا التي تعبر عن L2HGDH-sgRNA-1⁶.
6. لهذا الغرض ، قم بإعداد معلق خلوي يعادل 500 خلية / 10 مل من وسائط النمو الكاملة وبذرة 100 ميكرولتر من هذا المعلق في كل بئر من صفيحة 96 بئرا.
7. اترك الخلايا دون إزعاج لمدة 3 أيام ثم راقب.
8. ضع علامة على الآبار التي تنتج نسخا مفردة وقم بتغيير الوسائط كل يومين حتى يتم تحقيق حجم كاف للمستعمرات (عادة أسبوعين) للتوسع أكثر ، والحفظ بالتبريد ، والتحليل.

3. استخراج gDNA ، MS-BSP PCR ، وتسلسل Sanger

1. عزل gDNA من الخلايا باستخدام مجموعة عزل الحمض النووي الجيني باتباع تعليمات الشركة المصنعة (انظر جدول المواد).
2. تابع رسم خرائط مواقع الطفرات في المنبع من تسلسلات التعرف على PAM باستخدام تحليل البادئات المحددة القائمة على مواقع الطفرات (MS-BSP)⁸.
3. لهذا الغرض ، تم تصميم التمهيدي الأيمن غير المتحيز L2H-UMSBSP-R1 لتضخيم المنطقة خارج Exon1 لتضخيم أي أهداف.
4. صمم برايمر أيسر متحيز L2H-BMSBSP-F1 بتسلسل مماثل ل sgRNA لتضخيم التسلسل المستهدف بالقرب من تسلسلات التعرف على PAM.
   ملاحظة: في الظروف الصارمة جدا لتفاعل البوليميراز المتسلسل ، سيتم ملاحظة المنتج على الجل في نسخ غير متحولة. لن يتم ملاحظة أي منتج في استنساخ CRISPR-knockout الذي يظهر طفرات قريبة من المنبع من تسلسلات التعرف على PAM.
5. من أجل تعيين طفرات زوج قاعدة واحدة ، يقوم تفاعل البوليميراز المتسلسل بتضخيم تسلسل 468 نقطة أساس يمتد على الإكسون 1 بأكمله من L2HGDH ويخضع لتسلسل سانجر متبوعا بتحليل محاذاة تسلسل متعدد باستخدام clustalw⁸.

4. مقايسة تكوين hESC وتكوين الجسم الجنيني (EB)

1. تابع التمايز الموجه للتحكم واستنساخ CRISPR المختلفة من hESCs (H9) نحو مصير الأديم الظاهر العصبي باتباع البروتوكولات المعمول بها كما هو موضح سابقا باستخدام طريقة تثبيط smad المزدوج^9،10،11.
2. عندما تكون عند التقاء 90٪ ، عالج الخلايا ب LDN193189 (200 نانومتر) و SB431542 (10 ميكرومتر) لمدة 24 ساعة أولية في وسائط KSR بنسبة 100٪ متبوعة بإضافة XAV939 (2 ميكرومتر) لمدة يومين إضافيين.
3. بعد 3 أيام ، قلل النسبة المئوية لوسائط KSR (Knockout DMEM مكمل ب 15٪ (v / v) KSR ، 1٪ (v / v) L-glutamine ، 1٪ (v / v) P / S ، 1٪ (v / v) 10 mM MEM ، و 0.1٪ (v / v) 2-mercaptoethanol (75٪ ، 50٪ ، 25٪) عن طريق الجمع مع وسائط N2 (DMEM / F12 مكمل بملحق 1x N2 ، 1x P / S ، ) إلى وسائط N2 بنسبة 100٪ على مدى 8 أيام.
4. في بداية اليوم 12 ، قم بإصلاح الخلايا للتلوين المناعي باستخدام PAX6 كعلامة للأديم الظاهر العصبي.
5. بالنسبة لدراسات تحديد مصير الأديم المتوسط والأديم الباطن ، استخدم نهجا صغيرا قائما على CHIR99021 الجزيء الموصوف في المنشورات السابقة^12،13.
6. لهذا ، عندما تصل الخلايا إلى 70٪ من التقاء ، عالج ب 3 ميكرومتر من CHIR99021 في وسائط الأديم الباطن النهائي (DE) لمدة 24 ساعة متبوعا بتثبيت التلوين المناعي باستخدام Brachuary كعلامة خاصة بالأديم المتوسط.
7. بالنسبة لمرحلة الأديم الباطن ، قم بزراعة الخلايا لمدة 24 ساعة إضافية في وسائط DE وحدها دون إضافة CHIR99021 قبل التثبيت للتلوين المناعي باستخدام FOXA2.
8. لمقايسة تكوين EB ، قم بزرع الخلايا على أسطح الخلايا منخفضة الارتباط دون استخدام Matrigel لزراعة الخلايا في ظروف التعليق لمدة 24 ساعة قبل أخذ الصور المجهرية.

5. تحليل اللطخة الغربية

1. اغسل الخلايا مرتين باستخدام PBS و lyse باستخدام 1x RIPA buffer يحتوي على 1٪ SDS و 1x كوكتيل مثبط البروتياز والفوسفاتيز.
2. قم بتنظيف المحللات عن طريق الطرد المركزي عند 16,000 × جم لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية متبوعا بجمع المواد الطافية.
3. حدد كمية بروتين الخلية الكلي باستخدام مجموعة فحص بروتين BCA باتباع تعليمات الشركة المصنعة. اضبط العينات على 2 ميكروغرام / ميكرولتر باستخدام 4× تحميل عينة الصبغة.
4. قم بتغيير طبيعة عينات البروتين عند 70 درجة مئوية لمدة 10 دقائق ، وقم بتحميل كميات متساوية من كل عينة ، وحلها باستخدام 4٪ -12٪ من المواد الهلامية SDS-PAGE^{المتدرجة 7} متبوعة بالنقل إلى غشاء PVDF بجهد ثابت يبلغ 100 فولت لمدة ساعة واحدة عند 4 درجات مئوية.
5. سد الأغشية باستخدام 5٪ حليب خالي الدسم واحتضان في تخفيفات الأجسام المضادة الأولية عند 4 درجات مئوية طوال الليل مع الدوران.
6. بعد ذلك ، اغسل الأغشية 5x باستخدام المخزن المؤقت PBST واحتضانه في الأجسام المضادة الثانوية المناسبة المترافقة ب HRP لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة.
7. اغسل الأغشية مرة أخرى باستخدام PBST 5x ، واحتضن بركيزة كيميائية ، وطورها باستخدام أفلام الأشعة السينية.

6. تلغيم المناعة

1. قم بزرع الخلايا على ألواح البئر P4 واحتضانها لمدة 24 ساعة على الأقل قبل التثبيت للسماح بالارتباط المناسب للخلايا بالأسطح.
2. اغسل الخلايا 3 مرات باستخدام PBS لإزالة أي خلايا ميتة بالإضافة إلى مكونات الوسائط ، متبوعا بالتثبيت باستخدام 4٪ PFA لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
3. قم باختراق الخلايا باستخدام 0.3٪ triton X-100 متبوعا بحجب الارتباط غير المحدد باستخدام 2٪ BSA في PBS لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة.
4. احتضان العينات بالأجسام المضادة الأولية (OCT4 ، NANOG ، SOX2 ، KI67 ، PAX6 ، Brachuary ، FOXA2) المخففة في 1٪ BSA بين عشية وضحاها عند 4 درجات مئوية.
5. اغسل الخلايا 3x باستخدام PBS واحتضانها بالأجسام المضادة الثانوية المناسبة (الماعز المضاد للفأر 488 ، الماعز المضاد للأرانب 488 ، الماعز المضاد للفأر 546 ، الماعز المضاد للأرانب 546) المخفف في 1٪ BSA لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة.
6. أخيرا ، اغسل العينات باستخدام PBS 3x وقم بمواضدتها باستخدام DAPI والصورة باستخدام مجهر فلوري.

النتائج

استنساخ L2HGDH sgRNAs في lentiCRISPRv2 puro
تم الحصول على ناقل lentiCRISPRv2 puro تجاريا (انظر جدول المواد) وهضمه باستخدام BsmB1 ، مما أدى إلى إطلاق جزء حشو 1.8 كيلو بايت. كما هو موضح في الشكل 2 أ ، لوحظ هضم كامل للناقل. لكل بناء ، تم فحص ستة نسخ لوجود أو عدم وجود إدر...

Discussion

قامت هذه الدراسة بتوحيد طريقة تتيح حذف الجينات عالية الكفاءة والفعالية من حيث التكلفة في hESCs من خلال تقنية CRISPR-Cas9. نجحت هذه الطريقة في الحذف المتماثل اللواقح لجين L2HGDH في hESCs في غضون 3-4 أسابيع ، بدءا من عدوى hESC إلى الانتقاء النسيلي أحادي الخلية وانتشاره (الجدول 1). ع...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
2-MERCAPTOETHANOL	Invitrogen	31350010
38.5 mL, Sterile + Certified Free Open-Top Thinwall Ultra-Clear Tubes	Beckman Coulter	C14292
Accutase	Stem cell technologies	7920
bFGF Recombinant human	Invitrogen	PHG0261
Brachyury Rabbit mAb	Abclonal	A5078
BsmBI-v2	NEB	R0739S
chir99021	Tocris	4423/10
Corning Matrigel Basement Membrane Matrix, LDEV-free	Corning	354234
Cyclopamine	Stem cell technologies	72074
DMEM media	Invitrogen	11995073
DMEM NUTRIENT MIX F12	Invitrogen	11320033
DPBS w/o: Ca and Mg	PAN Biotech	P04-36500
Fetal bovie serum	Invitrogen	10270106
FoxA2/HNF3β	CST	8186
GAPDH (14C10) Rabbit mAb Antibody	CST	2118S
Gentle Cell Dissociation Reagent	Stem cell technologies	7174
HyClone Non Essential Amino Acids (NEAA) 100x Solution	GE healthcare	SH30238.01
Ki-67 (D3B5) Rabbit mAb	CST	9129
KnockOut Serum Replacement	Invitrogen	10828028
L GLUTAMINE, 100x	Invitrogen	2924190090
L2H-BMSBSP-F1	Macrogen		CGTGCGGGTTCGCGTCTGGG
L2HGDH Polyclonal antibody	Proteintech	15707-1-AP
L2HGDH-SgRNA1-F	Macrogen		CACCGCGTGCGG GTTCGCGTCTGGG
L2HGDH-SgRNA1-R	Macrogen		AAACCCCAGACGC GAACCCGCACGC
L2HGDH-SgRNA2-F	Macrogen		CACCGCCCGCGG GCTTTTCGCCGG
L2HGDH-SgRNA2-R	Macrogen		AAACCCGGCGAA AAGCCCGCGGGC
L2H-SeqF1	Macrogen		GCTAAAGAGCGC GGGTCCTCGG
L2H-SeqR1	Macrogen		GTGGACGGGTTG TTCAAAGCCAGAG
L2H-UMSBSP-R1	Macrogen		GTGGACGGGTTG TTCAAAGCCAGAG
LentiCRISPRv2	Addgene	52961
mTesR1 complete media	Stem cell technologies	85850
Nanog Antibody	CST	3580
NEUROBASAL MEDIUM 1x CTS	Invitrogen	A1371201
Neuropan 2 Supplement 100x	PAN Biotech	P07-11050
Neuropan 27 Supplement 50x	PAN Biotech	P07-07200
Oct-4 Antibody	CST	2750
Pax6 (D3A9V) XP Rabbit mAb	CST	60433
PENICILLIN STREPTOMYCIN SOL	Invitrogen	15140122
pMD2.G	Addgene	12259
Polybrene infection reagent	Sigma	TR1003- G
Polyethylenimine, branched	Sigma	408727
psPAX2.0	Addgene	12260
Puromycin	Invitrogen	A1113802
qPCR Lentivirus Titer Kit	Abm	LV900
Rock inhibitor Y-27632 dihydrochloride	Tocris	1254
SB 431542	Tocris	1614/10
Sox2 Antibody	CST	2748
Sucrose	Sigma	57-50-1
TRYPSIN .05% EDTA	Invitrogen	25300062
U6-459F	Macrogen		GAGGGCCTATT TCCCATGATTC
Wizard Genomic DNA Purification Kit	Promega	A1120
XAV 939	Tocris	3748/10