Delezione genica mediata da CRISPR-Cas9 in cellule staminali pluripotenti umane coltivate in condizioni prive di alimentatore

Riepilogo

Il metodo presentato descrive la generazione di un knockout genico mediato da CRISPR nella linea H9 di cellule staminali embrionali umane (hESC), che esprime stabilmente sgRNA che hanno come bersaglio il gene L2HGDH utilizzando un sistema di rilascio genico lentivirale mediato altamente efficiente.

Abstract

Il sistema CRISPR-Cas9 per l'editing del genoma ha rivoluzionato gli studi sulla funzione genica nelle cellule di mammifero, comprese le cellule staminali. Tuttavia, l'applicazione pratica di questa tecnica, in particolare nelle cellule staminali pluripotenti, presenta alcune sfide, come l'essere dispendiosa in termini di tempo e lavoro e la bassa efficienza di editing. Qui, descriviamo la generazione di un knockout genico mediato da CRISPR in una linea di cellule staminali embrionali umane (hESC) che esprime stabilmente sgRNA per il gene L2HGDH, utilizzando un sistema di rilascio genico lentivirale mediato altamente efficiente e stabile. Gli sgRNA che hanno come bersaglio l'esone 1 del gene L2HGDH sono stati sintetizzati chimicamente e clonati nel vettore lentiCRISPR v2-puro, che combina l'espressione costitutiva degli sgRNA con Cas9 in un sistema a vettore singolo altamente efficiente per ottenere titoli lentivirali più elevati per l'infezione da hESC e una selezione stabile utilizzando la puromicina. Le cellule selezionate con puromicina sono state ulteriormente espanse e sono stati ottenuti cloni di singole cellule utilizzando il metodo di diluizione limitata. I singoli cloni sono stati espansi e sono stati ottenuti diversi cloni knockout omozigoti per il gene L2HGDH, come confermato da una riduzione del 100% dell'espressione di L2HGDH utilizzando l'analisi Western blot. Inoltre, utilizzando MSBSP-PCR, il sito di mutazione CRISPR è stato mappato a monte della sequenza di riconoscimento PAM di Cas9 nei cloni omozigoti selezionati. È stato eseguito il sequenziamento Sanger per analizzare le esatte inserzioni/delezioni ed è stata condotta la caratterizzazione funzionale dei cloni. Questo metodo ha prodotto una percentuale significativamente più alta di delezioni omozigoti rispetto ai metodi di somministrazione genica non virale precedentemente riportati. Sebbene questo rapporto si concentri sul gene L2HGDH, questo approccio robusto ed economico può essere utilizzato per creare knockout omozigoti per altri geni in cellule staminali pluripotenti per studi sulla funzione genica.

Introduzione

Le cellule staminali embrionali umane (hESC) e le cellule staminali pluripotenti indotte (iPSC) sono cellule staminali con il potenziale di differenziarsi in tutti i tipi di cellule del corpo. Queste cellule fungono da strumenti preziosi per lo studio dello sviluppo umano, nonché per la comprensione dei meccanismi alla base di varie malattie, offrendo così un'enorme promessa per la medicina rigenerativa, la modellazione delle malattie e la scoperta di farmaci. Tali studi implicano l'indagine su come geni specifici contribuiscono allo sviluppo, al funzionamento e alla regolazione degli organismi ^1,2.

Vengono impiegate varie tecniche e approcci per decifrare la funzione genica, tra cui la manipolazione genetica, come il knockout o la sovraespressione genica, e l'editing del genoma. Tra questi, la tecnologia CRISPR-Cas9 è emersa come l'approccio più efficiente per gli studi di knockout genico e di editing genetico ^1,2,3. Il sistema CRISPR-Cas9 funziona utilizzando una singola molecola di RNA guida (sgRNA) specificamente progettata per identificare e legarsi a una particolare sequenza di DNA di interesse. Agendo come guida molecolare, l'sgRNA dirige l'enzima Cas9 verso la posizione precisa nel genoma che richiede la modifica. Una volta legato, Cas9 avvia una rottura a doppio filamento nel DNA nel sito designato. Dopo la scissione del DNA, vengono attivati i meccanismi di riparazione intrinseci della cellula. Questi includono due principali percorsi di riparazione: l'unione delle estremità non omologa (NHEJ) e la riparazione diretta dall'omologia (HDR). L'NHEJ spesso provoca inserzioni o delezioni (indel) nel sito di rottura, portando alla distruzione o all'inattivazione del gene. Al contrario, l'HDR consente l'inserimento di nuove sequenze di DNA nel sito di rottura, facilitando l'introduzione di alterazioni genetiche mirate⁴.

Data l'importanza delle delezioni geniche nelle cellule staminali pluripotenti, sono stati pubblicati diversi protocolli sui knockout genici mediati da CRISPR-Cas9 nelle hESC/iPSC. Tuttavia, molti di questi protocolli devono affrontare limitazioni significative, come essere estremamente dispendiosi in termini di tempo, laboriosi e avere una bassa efficienza a causa dell'uso di metodi di consegna genica non virali⁵. Queste sfide sono ancora più pronunciate nelle hESC/iPSC, poiché è noto che queste cellule hanno un'efficienza di editing inferiore rispetto ad altri tipi di cellule⁵. Alcune di queste limitazioni possono essere affrontate aumentando l'efficienza della somministrazione di plasmidi contenenti Cas9 e sgRNA. Questo può essere ottenuto con successo utilizzando un sistema di vettori lentivirali, che può migliorare significativamente i risultati dell'editing genetico. I protocolli di confezionamento dei lentivirus sono consolidati e semplici, consentendo una facile adozione nei laboratori, anche da parte di ricercatori con esperienza limitata. I lentivirus mostrano un'elevata efficienza di infezione in vari tipi di cellule, tra cui hESC e iPSC. Pertanto, l'utilizzo di un sistema lentivirale per l'espressione di Cas9-sgRNA è ideale per esperimenti di editing genico di routine in hESC/iPSC per studi di funzione genica.

Qui, forniamo un metodo semplice e diretto per delezioni geniche altamente efficienti basate su CRISPR-Cas9 nelle hESC in una durata di tempo relativamente più breve rispetto ai protocolli convenzionali (Figura 1). Sebbene sia stato utilizzato un vettore lentivirale con espressione costitutiva di Cas9 e sgRNA, potrebbe essere facilmente sostituito con l'espressione di Cas9 inducibile da farmaci per l'espressione controllabile di Cas9.

Protocollo

I dettagli delle sequenze geniche, dei reagenti e delle attrezzature utilizzate in questo studio sono elencati nella Tabella dei materiali.

1. Progettazione di RNA guida singola (sgRNA), clonazione e produzione di vettori lentivirali

NOTA: Vengono utilizzate due diverse sequenze di sgRNA che hanno come bersaglio l'esone 1 del gene L2HGDH , entrambe adattate da Qiu et ^al.6con i siti PAM di AGG e TGG rispettivamente per le sequenze 1 e 2. Entrambi gli sgRNA erano lunghi 20 bp e le estremità sono state modificate per aggiungere sequenze linker per l'enzima di restrizione Bsmb1 da clonare nel vettore bersaglio (LentiCRISPRv2) come descritto nel precedente rapporto⁶. Le sequenze linker sono state aggiunte durante la progettazione di sgRNA a scopo di clonazione.

1. Ricottura chimicamente sintetizzato sgRNA⁶ e clonazione nel vettore lentivirale a taglio singolo Bsmb1, LentiCRISPRv2 utilizzando un protocollo ottimizzato come precedentemente riportato⁷.
2. Procedere con il confezionamento e la concentrazione dei lentivirali utilizzando il protocollo^{standardizzato} e ottimizzato 7.
3. Per la produzione di lentivirus, seminare HEK293T cellule (1 × 10⁵ cellule/cm²) utilizzando DMEM, FBS al 10% e 1x penicillina/streptomicina (P/S) e incubare per una notte in incubatore di coltura tissutale a 37 °C in un'atmosfera di CO₂ al 5% in condizioni umide.
4. Quando il 90% è confluente, co-trasfetta HEK293T cellule con vettore di ingresso (spina dorsale vuota o plasmidi che esprimono sgRNA) e impacchetta i plasmidi utilizzando il polimero cationico a basso costo PEI come descritto in precedenza⁷.
5. Raccogliere il terreno condizionato contenente particelle di surnatante lentivirale (LVS) a 48 ore e 72 ore dopo la trasfezione e procedere con l'ultracentrifugazione utilizzando un cuscino di saccarosio e centrifugare le provette a 1,25.000 x g per 2 ore a 4 °C.
6. Procedere con la concentrazione di particelle LVS ad almeno 200 volte il volume originale in PBS, aliquotare e conservare a -80 °C fino al momento dell'uso.
7. Determinare il titolo delle particelle lentivirali utilizzando il kit per il titolo qPCR Lentivirus seguendo le istruzioni del produttore (vedere la tabella dei materiali).

2. Infezioni lentivirali e propagazione clonale unicellulare

1. Per le infezioni da particelle LVS, seminare una sospensione cellulare hESC (H9) avente 1 × 10⁵ cellule/0,5 mL di terreno di coltura hESC (terreno basale + P/S + 10 μM di Rock Inhibitor) su piastre complete a pozzetti Matrigel (1:50) rivestite in P24 in 500 μL di terreno e incubare durante la notte per consentire alle cellule di attaccarsi. Seminare pozzetti extra che non sarebbero stati infettati da LVS ma trattati con puromicina per fungere da controllo non infetto.
   NOTA: Il conteggio delle cellule può essere eseguito utilizzando un emocitometro manuale o un contatore di cellule automatizzato.
2. Il giorno seguente, infettare le cellule con una molteplicità di infezione (MOI) di 10 insieme a 8 μg/mL di polibrene e incubare a 37 °C per 8 ore, seguita dalla sostituzione del terreno con terreno hESC fresco + P/S senza Rock Inhibitor e continuare la coltura fino a quando le cellule non sono confluenti al 90%.
3. Iniziare la selezione della puromicina integrando il terreno con una concentrazione di 0,8 μg/mL di puromicina quando le cellule raggiungono il 90% di confluenza, che di solito è 48-72 ore dopo l'infezione, e continuare la selezione fino a quando tutte le cellule muoiono nelle cellule non infette (gruppo di controllo).
4. Al termine della selezione (di solito 4-6 giorni), dividere le celle stabili (1:4) ed espanderle per la crioconservazione e ulteriori analisi.
5. Eseguire la selezione di singole cellule e l'espansione clonale utilizzando cellule che esprimono L2HGDH-sgRNA-1⁶.
6. A tale scopo, preparare una sospensione cellulare equivalente a 500 cellule/10 mL di terreno di coltura completo e seminare 100 μL di questa sospensione in ciascun pozzetto di una piastra a 96 pozzetti.
7. Lasciare le cellule indisturbate per 3 giorni e poi osservare.
8. Contrassegnare i pozzetti che producono singoli cloni e cambiare il terreno a giorni alterni fino a raggiungere una dimensione sufficiente per consentire alle colonie (di solito 2 settimane) di espandersi ulteriormente, crioconservare e analizzare.

3. Estrazione del gDNA, MS-BSP PCR e sequenziamento Sanger

1. Isolare il gDNA dalle cellule utilizzando il kit di isolamento del DNA genomico seguendo le istruzioni del produttore (vedere la tabella dei materiali).
2. Procedere con la mappatura dei siti di mutazione a monte delle sequenze di riconoscimento PAM utilizzando l'analisi MS-BSP (Mutation Sites Based Specific Primers)⁸.
3. Per questo, un primer destro imparziale L2H-UMSBSP-R1 è progettato per amplificare la regione al di fuori dell'esone1 per amplificare qualsiasi bersaglio.
4. Progettare un primer sinistro polarizzato L2H-BMSBSP-F1 con una sequenza identica a sgRNA per amplificare la sequenza bersaglio vicino alle sequenze di riconoscimento PAM.
   NOTA: In condizioni molto rigorose di PCR, il prodotto sarà osservato sul gel in cloni non mutati. Nessun prodotto sarebbe stato osservato nei cloni knockout per CRISPR che presentavano mutazioni vicine a monte delle sequenze di riconoscimento PAM.
5. Al fine di mappare le mutazioni di una singola coppia di basi, la PCR amplifica una sequenza di 468 bp che copre l'intero esone 1 di L2HGDH e la sottopone a sequenziamento Sanger seguito da analisi di allineamento di sequenze multiple utilizzando clustalw⁸.

4. Saggio di differenziazione delle hESC e di formazione di corpi embrioidi (EB)

1. Procedere con la differenziazione diretta del controllo e dei diversi cloni CRISPR di hESC (H9) verso il destino del neuro-ectoderma seguendo protocolli stabiliti come precedentemente descritto utilizzando il metodo di inibizione dual smad ^9,10,11.
2. Quando si raggiunge la confluenza del 90%, trattare le cellule con LDN193189 (200 nM) e SB431542 (10 μM) per le prime 24 ore in terreno KSR al 100%, seguite dall'aggiunta di XAV939 (2 μM) per altri 2 giorni.
3. Dopo 3 giorni, ridurre la percentuale di terreni KSR (Knockout DMEM integrato con 15% (v/v) KSR, 1% (v/v) L-glutammina, 1% (v/v) P/S, 1% (v/v) 10 mM MEM e 0,1% (v/v) 2-mercaptoetanolo (75%, 50%, 25%) combinandolo con terreni N2 (DMEM/F12 integrato con 1x integratore di N2, 1x P/S, ) al 100% di N2 per un periodo di 8 giorni.
4. All'inizio del 12° giorno, fissare le cellule per l'immunocolorazione utilizzando PAX6 come marcatore del neuro-ectoderma.
5. Per gli studi sul mesoderma e sulla determinazione del destino endodermico, utilizzare un approccio basato sulla CHIR99021 di piccole molecole descritto in pubblicazioni precedenti^12,13.
6. Per questo, quando le cellule raggiungono il 70% di confluenza, trattare con 3 μM di CHIR99021 in terreno di comunicazione dell'endoderma definitivo (DE) per 24 ore, seguito da fissazione per l'immunocolorazione utilizzando Brachuary come marcatore specifico del mesoderma.
7. Per la fase endodermica, coltivare le cellule per ulteriori 24 ore nel solo terreno DE senza l'aggiunta di CHIR99021 prima di fissare per l'immunocolorazione utilizzando FOXA2.
8. Per il saggio di formazione di EB, seminare le cellule su superfici cellulari a basso attaccamento senza utilizzare Matrigel per coltivare cellule in condizioni di sospensione per 24 ore prima di eseguire micrografie.

5. Analisi del Western blot

1. Lavare le cellule due volte con PBS e lisare con 1 tampone RIPA contenente l'1% di SDS e 1 cocktail di inibitori della proteasi e della fosfatasi.
2. Eliminare i lisati mediante centrifugazione a 16.000 x g per 10 minuti a 4 °C, seguita dalla raccolta dei surnatanti.
3. Quantificare la proteina cellulare totale utilizzando il kit per il dosaggio delle proteine BCA seguendo le istruzioni del produttore. Regolare i campioni a 2 μg/μl utilizzando il tampone del campione di colorante caricato al 4×.
4. Denaturare i campioni di proteine a 70 °C per 10 minuti, caricare quantità uguali di ciascun campione e risolvere utilizzando gel SDS-PAGE⁷ con gradiente 4%-12%, quindi trasferirli su membrana PVDF a una tensione costante di 100 V per 1 ora a 4 °C.
5. Bloccare le membrane con latte scremato al 5% e incubare in diluizioni di anticorpi primari a 4 °C durante la notte con rotazione.
6. Successivamente, lavare le membrane 5 volte utilizzando il tampone PBST e incubare in anticorpi secondari appropriati coniugati con HRP per 1 ora a temperatura ambiente.
7. Lavare nuovamente le membrane con PBST 5x, incubare con substrato chemiluminescente e sviluppare utilizzando pellicole radiografiche.

6. Immunocolorazione

1. Seminare le cellule su piastre a pozzetti P4 e incubare per almeno 24 ore prima del fissaggio per consentire il corretto fissaggio delle cellule alle superfici.
2. Lavare le celle 3 volte con PBS per rimuovere eventuali cellule morte e componenti del terreno, quindi fissarle con PFA al 4% per 15 minuti a temperatura ambiente.
3. Permeabilizzare le cellule utilizzando tritone X-100 allo 0,3% seguito dal blocco per legame aspecifico utilizzando il 2% di BSA in PBS per 1 ora a temperatura ambiente.
4. Incubare i campioni con anticorpi primari (OCT4, NANOG, SOX2, KI67, PAX6, Brachuary, FOXA2) diluiti in BSA all'1% per una notte a 4 °C.
5. Lavare le cellule 3 volte con PBS e incubare con opportuni anticorpi secondari (Capra anti-topo 488, Capra anti-coniglio 488, Capra anti-topo 546, Capra anti-coniglio 546) diluiti all'1% di BSA per 1 ora a temperatura ambiente.
6. Infine, lavare i campioni con PBS 3x e colorarli con DAPI e acquisire immagini utilizzando un microscopio a fluorescenza.

Risultati

Clonaggio di sgRNA L2HGDH in lentiCRISPRv2 puro
Il vettore puro lentiCRISPRv2 è stato ottenuto commercialmente (vedi Tabella dei materiali) e digerito con BsmB1, che ha portato al rilascio di un frammento di stuffer da 1,8 Kb. Come mostrato nella Figura 2A, è stata osservata una digestione completa del vettore. Per ogni costrutto, sei cloni sono stati sottoposti a screening per verificare la presenza o l'assenza di inse...

Discussione

Questo studio ha standardizzato un metodo che consente delezioni geniche altamente efficienti ed economiche nelle hESC attraverso la tecnologia CRISPR-Cas9. Questo metodo ha raggiunto con successo la delezione omozigote del gene L2HGDH nelle hESC entro 3-4 settimane, a partire dall'infezione da hESC fino alla selezione clonale e alla propagazione di singole cellule (Tabella 1). Sebbene le manipolazioni geniche mediate da CRISPR-Cas9 possano essere ottenute mediante trasf...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
2-MERCAPTOETHANOL	Invitrogen	31350010
38.5 mL, Sterile + Certified Free Open-Top Thinwall Ultra-Clear Tubes	Beckman Coulter	C14292
Accutase	Stem cell technologies	7920
bFGF Recombinant human	Invitrogen	PHG0261
Brachyury Rabbit mAb	Abclonal	A5078
BsmBI-v2	NEB	R0739S
chir99021	Tocris	4423/10
Corning Matrigel Basement Membrane Matrix, LDEV-free	Corning	354234
Cyclopamine	Stem cell technologies	72074
DMEM media	Invitrogen	11995073
DMEM NUTRIENT MIX F12	Invitrogen	11320033
DPBS w/o: Ca and Mg	PAN Biotech	P04-36500
Fetal bovie serum	Invitrogen	10270106
FoxA2/HNF3β	CST	8186
GAPDH (14C10) Rabbit mAb Antibody	CST	2118S
Gentle Cell Dissociation Reagent	Stem cell technologies	7174
HyClone Non Essential Amino Acids (NEAA) 100x Solution	GE healthcare	SH30238.01
Ki-67 (D3B5) Rabbit mAb	CST	9129
KnockOut Serum Replacement	Invitrogen	10828028
L GLUTAMINE, 100x	Invitrogen	2924190090
L2H-BMSBSP-F1	Macrogen		CGTGCGGGTTCGCGTCTGGG
L2HGDH Polyclonal antibody	Proteintech	15707-1-AP
L2HGDH-SgRNA1-F	Macrogen		CACCGCGTGCGG GTTCGCGTCTGGG
L2HGDH-SgRNA1-R	Macrogen		AAACCCCAGACGC GAACCCGCACGC
L2HGDH-SgRNA2-F	Macrogen		CACCGCCCGCGG GCTTTTCGCCGG
L2HGDH-SgRNA2-R	Macrogen		AAACCCGGCGAA AAGCCCGCGGGC
L2H-SeqF1	Macrogen		GCTAAAGAGCGC GGGTCCTCGG
L2H-SeqR1	Macrogen		GTGGACGGGTTG TTCAAAGCCAGAG
L2H-UMSBSP-R1	Macrogen		GTGGACGGGTTG TTCAAAGCCAGAG
LentiCRISPRv2	Addgene	52961
mTesR1 complete media	Stem cell technologies	85850
Nanog Antibody	CST	3580
NEUROBASAL MEDIUM 1x CTS	Invitrogen	A1371201
Neuropan 2 Supplement 100x	PAN Biotech	P07-11050
Neuropan 27 Supplement 50x	PAN Biotech	P07-07200
Oct-4 Antibody	CST	2750
Pax6 (D3A9V) XP Rabbit mAb	CST	60433
PENICILLIN STREPTOMYCIN SOL	Invitrogen	15140122
pMD2.G	Addgene	12259
Polybrene infection reagent	Sigma	TR1003- G
Polyethylenimine, branched	Sigma	408727
psPAX2.0	Addgene	12260
Puromycin	Invitrogen	A1113802
qPCR Lentivirus Titer Kit	Abm	LV900
Rock inhibitor Y-27632 dihydrochloride	Tocris	1254
SB 431542	Tocris	1614/10
Sox2 Antibody	CST	2748
Sucrose	Sigma	57-50-1
TRYPSIN .05% EDTA	Invitrogen	25300062
U6-459F	Macrogen		GAGGGCCTATT TCCCATGATTC
Wizard Genomic DNA Purification Kit	Promega	A1120
XAV 939	Tocris	3748/10