CRISPR-Cas9 תיווך מחיקת גנים בתאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים שגודלו בתרבית בתנאים נטולי הזנה

Summary

השיטה המוצגת מתארת את יצירתו של נוקאאוט גנטי בתיווך קריספר בקו תאי גזע עובריים אנושיים (hESC) H9, המבטא ביציבות sgRNA המכוון לגן L2HGDH באמצעות מערכת העברת גנים בתיווך לנטיויראלי יעילה ביותר.

Abstract

מערכת CRISPR-Cas9 לעריכת גנום חוללה מהפכה במחקרי תפקוד גנים בתאי יונקים, כולל תאי גזע. עם זאת, היישום המעשי של טכניקה זו, במיוחד בתאי גזע פלוריפוטנטים, מציב אתגרים מסוימים, כגון היותה עתירת זמן ועבודה ויעילות עריכה נמוכה. במאמר זה אנו מתארים את היצירה של נוקאאוט גנטי בתיווך קריספר בקו תאי גזע עובריים אנושיים (hESC) המבטא ביציבות sgRNA עבור הגן L2HGDH, תוך שימוש במערכת העברת גנים בתיווך לנטיויראלי יעילה ויציבה ביותר. ה-sgRNA המכוון לאקסון 1 של הגן L2HGDH סונתז כימית ושוכפל לווקטור lentiCRISPR v2-puro, המשלב את הביטוי המכונן של sgRNA עם Cas9 במערכת וקטורית יחידה יעילה ביותר להשגת טיטרים לנטי-ויראליים גבוהים יותר עבור זיהום hESC ובחירה יציבה באמצעות פורומיצין. תאים שנבחרו בפורומיצין הורחבו עוד יותר, ושיבוטים חד-תאיים התקבלו בשיטת הדילול המוגבלת. השיבוטים הבודדים הורחבו, והתקבלו מספר שיבוטים הומוזיגוטיים עבור הגן L2HGDH, כפי שאושר על ידי הפחתה של 100% בביטוי L2HGDH באמצעות ניתוח כתמים מערביים. יתר על כן, באמצעות MSBSP-PCR, אתר מוטציית CRISPR מופה במעלה הזרם של רצף זיהוי PAM של Cas9 בשיבוטים הומוזיגוטיים שנבחרו. בוצע ריצוף סנגר לניתוח ההחדרות/מחיקות המדויקות, ובוצע אפיון פונקציונלי של השיבוטים. שיטה זו יצרה אחוז גבוה משמעותית של מחיקות הומוזיגוטיות בהשוואה לשיטות העברת גנים לא נגיפיות שדווחו בעבר. למרות שדו"ח זה מתמקד בגן L2HGDH, גישה חזקה וחסכונית זו יכולה לשמש ליצירת נוקאאוטים הומוזיגוטיים עבור גנים אחרים בתאי גזע פלוריפוטנטיים למחקרי תפקודי גנים.

Introduction

תאי גזע עובריים אנושיים (hESCs) ותאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים (iPSCs) הם תאי גזע בעלי פוטנציאל להתמיין לכל סוגי התאים בגוף. תאים אלה משמשים כלים רבי ערך לחקר ההתפתחות האנושית, כמו גם להבנת המנגנונים העומדים בבסיסן של מחלות שונות, ובכך מציעים הבטחה עצומה לרפואה רגנרטיבית, מידול מחלות וגילוי תרופות. מחקרים כאלה כוללים חקירה כיצד גנים מסוימים תורמים להתפתחות, תפקוד וויסות של אורגניזמים ^1,2.

טכניקות וגישות שונות משמשות לפענוח תפקוד גנים, כולל מניפולציה גנטית, כגון נוקאאוט גנים או ביטוי יתר, ועריכת גנום. בין אלה, טכנולוגיית CRISPR-Cas9 התגלתה כגישה היעיל

Protocol

פרטי רצפי הגנים, הריאגנטים והציוד ששימשו במחקר זה מפורטים בטבלת החומרים.

1. תכנון RNA מדריך יחיד (sgRNA), שיבוט וייצור וקטורים לנטי-ויראליים

הערה: נעשה שימוש בשני רצפי sgRNA שונים המכוונים לאקסון 1 של הגן L2HGDH , שניהם מותאמים מ-Qiu et ^al.6עם אתרי PAM של AGG ו-TGG עבור רצפים 1 ו-2, בהתאמה. אורכם של שני ה-sgRNA היה 20 bp, והקצוות שונו כדי להוסיף רצפי קישור עבור אנזים הגבלה Bsmb1 שישוכפל בווקטור המטרה (LentiCRISPRv2) כפי שתואר בדו"ח הקודם⁶. רצפי לינקר נוספו במהלך תכנון sgRNA למטרות שיבוט.

תוצאות

שיבוט של L2HGDH sgRNA ב-lentiCRISPRv2 puro
וקטור הפורו lentiCRISPRv2 הושג באופן מסחרי (ראו טבלת חומרים) ועוכל עם BsmB1, מה שהביא לשחרור של קטע פוחלץ של 1.8 Kb. כפי שניתן לראות באיור 2A, נצפה עיכול מלא של הווקטור. עבור כל מבנה, שישה שיבוטים נבדקו לנוכחות או היעדר החד...

Discussion

מחקר זה תיקן שיטה המאפשרת מחיקות גנים יעילות וחסכוניות ביותר בתאי גזע עובריים באמצעות טכנולוגיית CRISPR-Cas9. שיטה זו השיגה בהצלחה מחיקה הומוזיגוטית של הגן L2HGDH בתאי גזע עובריים עובריים תוך 3-4 שבועות, החל מזיהום בתאי גזע עובריים עובריים ועד לבחירה והתפשטות של תא בודד (טבל?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
2-MERCAPTOETHANOL	Invitrogen	31350010
38.5 mL, Sterile + Certified Free Open-Top Thinwall Ultra-Clear Tubes	Beckman Coulter	C14292
Accutase	Stem cell technologies	7920
bFGF Recombinant human	Invitrogen	PHG0261
Brachyury Rabbit mAb	Abclonal	A5078
BsmBI-v2	NEB	R0739S
chir99021	Tocris	4423/10
Corning Matrigel Basement Membrane Matrix, LDEV-free	Corning	354234
Cyclopamine	Stem cell technologies	72074
DMEM media	Invitrogen	11995073
DMEM NUTRIENT MIX F12	Invitrogen	11320033
DPBS w/o: Ca and Mg	PAN Biotech	P04-36500
Fetal bovie serum	Invitrogen	10270106
FoxA2/HNF3β	CST	8186
GAPDH (14C10) Rabbit mAb Antibody	CST	2118S
Gentle Cell Dissociation Reagent	Stem cell technologies	7174
HyClone Non Essential Amino Acids (NEAA) 100x Solution	GE healthcare	SH30238.01
Ki-67 (D3B5) Rabbit mAb	CST	9129
KnockOut Serum Replacement	Invitrogen	10828028
L GLUTAMINE, 100x	Invitrogen	2924190090
L2H-BMSBSP-F1	Macrogen		CGTGCGGGTTCGCGTCTGGG
L2HGDH Polyclonal antibody	Proteintech	15707-1-AP
L2HGDH-SgRNA1-F	Macrogen		CACCGCGTGCGG GTTCGCGTCTGGG
L2HGDH-SgRNA1-R	Macrogen		AAACCCCAGACGC GAACCCGCACGC
L2HGDH-SgRNA2-F	Macrogen		CACCGCCCGCGG GCTTTTCGCCGG
L2HGDH-SgRNA2-R	Macrogen		AAACCCGGCGAA AAGCCCGCGGGC
L2H-SeqF1	Macrogen		GCTAAAGAGCGC GGGTCCTCGG
L2H-SeqR1	Macrogen		GTGGACGGGTTG TTCAAAGCCAGAG
L2H-UMSBSP-R1	Macrogen		GTGGACGGGTTG TTCAAAGCCAGAG
LentiCRISPRv2	Addgene	52961
mTesR1 complete media	Stem cell technologies	85850
Nanog Antibody	CST	3580
NEUROBASAL MEDIUM 1x CTS	Invitrogen	A1371201
Neuropan 2 Supplement 100x	PAN Biotech	P07-11050
Neuropan 27 Supplement 50x	PAN Biotech	P07-07200
Oct-4 Antibody	CST	2750
Pax6 (D3A9V) XP Rabbit mAb	CST	60433
PENICILLIN STREPTOMYCIN SOL	Invitrogen	15140122
pMD2.G	Addgene	12259
Polybrene infection reagent	Sigma	TR1003- G
Polyethylenimine, branched	Sigma	408727
psPAX2.0	Addgene	12260
Puromycin	Invitrogen	A1113802
qPCR Lentivirus Titer Kit	Abm	LV900
Rock inhibitor Y-27632 dihydrochloride	Tocris	1254
SB 431542	Tocris	1614/10
Sox2 Antibody	CST	2748
Sucrose	Sigma	57-50-1
TRYPSIN .05% EDTA	Invitrogen	25300062
U6-459F	Macrogen		GAGGGCCTATT TCCCATGATTC
Wizard Genomic DNA Purification Kit	Promega	A1120
XAV 939	Tocris	3748/10