CRISPR-Cas9 תיווך מחיקת גנים בתאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים שגודלו בתרבית בתנאים נטולי הזנה

Summary

השיטה המוצגת מתארת את יצירתו של נוקאאוט גנטי בתיווך קריספר בקו תאי גזע עובריים אנושיים (hESC) H9, המבטא ביציבות sgRNA המכוון לגן L2HGDH באמצעות מערכת העברת גנים בתיווך לנטיויראלי יעילה ביותר.

Abstract

מערכת CRISPR-Cas9 לעריכת גנום חוללה מהפכה במחקרי תפקוד גנים בתאי יונקים, כולל תאי גזע. עם זאת, היישום המעשי של טכניקה זו, במיוחד בתאי גזע פלוריפוטנטים, מציב אתגרים מסוימים, כגון היותה עתירת זמן ועבודה ויעילות עריכה נמוכה. במאמר זה אנו מתארים את היצירה של נוקאאוט גנטי בתיווך קריספר בקו תאי גזע עובריים אנושיים (hESC) המבטא ביציבות sgRNA עבור הגן L2HGDH, תוך שימוש במערכת העברת גנים בתיווך לנטיויראלי יעילה ויציבה ביותר. ה-sgRNA המכוון לאקסון 1 של הגן L2HGDH סונתז כימית ושוכפל לווקטור lentiCRISPR v2-puro, המשלב את הביטוי המכונן של sgRNA עם Cas9 במערכת וקטורית יחידה יעילה ביותר להשגת טיטרים לנטי-ויראליים גבוהים יותר עבור זיהום hESC ובחירה יציבה באמצעות פורומיצין. תאים שנבחרו בפורומיצין הורחבו עוד יותר, ושיבוטים חד-תאיים התקבלו בשיטת הדילול המוגבלת. השיבוטים הבודדים הורחבו, והתקבלו מספר שיבוטים הומוזיגוטיים עבור הגן L2HGDH, כפי שאושר על ידי הפחתה של 100% בביטוי L2HGDH באמצעות ניתוח כתמים מערביים. יתר על כן, באמצעות MSBSP-PCR, אתר מוטציית CRISPR מופה במעלה הזרם של רצף זיהוי PAM של Cas9 בשיבוטים הומוזיגוטיים שנבחרו. בוצע ריצוף סנגר לניתוח ההחדרות/מחיקות המדויקות, ובוצע אפיון פונקציונלי של השיבוטים. שיטה זו יצרה אחוז גבוה משמעותית של מחיקות הומוזיגוטיות בהשוואה לשיטות העברת גנים לא נגיפיות שדווחו בעבר. למרות שדו"ח זה מתמקד בגן L2HGDH, גישה חזקה וחסכונית זו יכולה לשמש ליצירת נוקאאוטים הומוזיגוטיים עבור גנים אחרים בתאי גזע פלוריפוטנטיים למחקרי תפקודי גנים.

Introduction

תאי גזע עובריים אנושיים (hESCs) ותאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים (iPSCs) הם תאי גזע בעלי פוטנציאל להתמיין לכל סוגי התאים בגוף. תאים אלה משמשים כלים רבי ערך לחקר ההתפתחות האנושית, כמו גם להבנת המנגנונים העומדים בבסיסן של מחלות שונות, ובכך מציעים הבטחה עצומה לרפואה רגנרטיבית, מידול מחלות וגילוי תרופות. מחקרים כאלה כוללים חקירה כיצד גנים מסוימים תורמים להתפתחות, תפקוד וויסות של אורגניזמים ^1,2.

טכניקות וגישות שונות משמשות לפענוח תפקוד גנים, כולל מניפולציה גנטית, כגון נוקאאוט גנים או ביטוי יתר, ועריכת גנום. בין אלה, טכנולוגיית CRISPR-Cas9 התגלתה כגישה היעילה ביותר למחקרי נוקאאוט גנים^ועריכת גנים ^1,2,3. מערכת CRISPR-Cas9 פועלת על ידי שימוש במולקולת RNA מנחה יחידה (sgRNA) שתוכננה במיוחד לזהות ולהיקשר לרצף DNA מסוים של עניין. כמדריך מולקולרי, ה-sgRNA מכוון את האנזים Cas9 למיקום המדויק בגנום הדורש שינוי. לאחר הקשירה, Cas9 יוזם שבירה דו-גדילית בדנ"א באתר המיועד. בעקבות פיצול הדנ"א מופעלים מנגנוני התיקון הטבועים בתא. אלה כוללים שני מסלולי תיקון עיקריים: חיבור קצה לא הומולוגי (NHEJ) ותיקון מכוון הומולוגיה (HDR). NHEJ גורם לעתים קרובות להחדרות או מחיקות (indels) באתר ההפסקה, מה שמוביל לשיבוש או השבתה של גנים. לעומת זאת, HDR מאפשר החדרה של רצפי DNA חדשים באתר ההפסקה, מה שמקל על הכנסת שינויים גנטיים ממוקדים⁴.

בהתחשב בחשיבות של מחיקות גנים בתאי גזע פלוריפוטנטים, פורסמו מספר פרוטוקולים על נוקאאוטים גנטיים בתיווך CRISPR-Cas9 בתאי גזע עובריים עובריים/iPSCs. עם זאת, רבים מהפרוטוקולים הללו עומדים בפני מגבלות משמעותיות, כגון היותם גוזלים זמן רב, דורשים עבודה רבה ויעילות נמוכה עקב השימוש בשיטות העברת גנים שאינם נגיפיים⁵. אתגרים אלה בולטים עוד יותר בתאי גזע עובריים/iPSCs, שכן תאים אלה ידועים כבעלי יעילות עריכה נמוכה יותר בהשוואה לסוגי תאים אחרים⁵. ניתן לטפל בחלק ממגבלות אלה על ידי הגברת היעילות של העברת פלסמיד המכיל Cas9 ו- sgRNAs. ניתן להשיג זאת בהצלחה באמצעות מערכת וקטורית לנטיויראלית, אשר יכולה לשפר באופן משמעותי את תוצאות עריכת הגנים. פרוטוקולי האריזה של Lentivirus מבוססים היטב ופשוטים, ומאפשרים אימוץ קל במעבדות, אפילו על ידי חוקרים בעלי ניסיון מוגבל. לנטי-וירוסים מפגינים יעילות זיהום גבוהה בסוגי תאים שונים, כולל תאי גזע עובריים (עוברי עובר) ותאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים (iPSC). לכן, שימוש במערכת לנטי-ויראלית לביטוי Cas9-sgRNA הוא אידיאלי לניסויים שגרתיים בעריכת גנים בתאי גזע עובריים/iPSCs עבור מחקרי תפקוד גנים.

כאן, אנו מספקים שיטה פשוטה ופשוטה למחיקות גנים יעילות ביותר המבוססות על CRISPR-Cas9 בתאי גזע עובריים עובריים (תאי גזע עובריים) במשך זמן קצר יחסית מאשר פרוטוקולים קונבנציונליים (איור 1). למרות שנעשה שימוש בווקטור לנטי-ויראלי עם ביטוי מכונן של Cas9 ו-sgRNA, ניתן בקלות להחליף אותו בביטוי Cas9 הניתן להשראת תרופות עבור ביטוי Cas9 הניתן לשליטה.

Protocol

פרטי רצפי הגנים, הריאגנטים והציוד ששימשו במחקר זה מפורטים בטבלת החומרים.

1. תכנון RNA מדריך יחיד (sgRNA), שיבוט וייצור וקטורים לנטי-ויראליים

הערה: נעשה שימוש בשני רצפי sgRNA שונים המכוונים לאקסון 1 של הגן L2HGDH , שניהם מותאמים מ-Qiu et ^al.6עם אתרי PAM של AGG ו-TGG עבור רצפים 1 ו-2, בהתאמה. אורכם של שני ה-sgRNA היה 20 bp, והקצוות שונו כדי להוסיף רצפי קישור עבור אנזים הגבלה Bsmb1 שישוכפל בווקטור המטרה (LentiCRISPRv2) כפי שתואר בדו"ח הקודם⁶. רצפי לינקר נוספו במהלך תכנון sgRNA למטרות שיבוט.

1. אנלי מסנתז כימית sgRNAs⁶ ומשובט לתוך Bsmb1 יחיד לחתוך וקטור lentiviral, LentiCRISPRv2 באמצעות פרוטוקול אופטימלי כפי שדווח בעבר⁷.
2. המשך עם אריזה וריכוז לנטיויראלי באמצעות פרוטוקול סטנדרטי וממוטב⁷.
3. לייצור לנטיוירוסים, זרעים HEK293T תאים (1 × 10⁵ תאים לס"מ²) באמצעות DMEM, 10% FBS ו-1x פניצילין/סטרפטומיצין (P/S) ודגרים לילה באינקובטור תרביות רקמה בטמפרטורה של 37°C באטמוספירה של 5% CO₂ בתנאי לחות.
4. כאשר 90% מתמזגים, קו-טרנספקט HEK293T תאים עם וקטור כניסה (עמוד שדרה ריק או sgRNA המבטא פלסמידים) ואריזת פלסמידים באמצעות פולימר קטיוני בעלות נמוכה PEI כפי שתואר קודם לכן⁷.
5. אסוף את המדיה המותנית המכילה חלקיקי סופרנאטנט לנטי-ויראלי (LVS) ב-48 שעות ו-72 שעות לאחר הטרנספקציה והמשך עם אולטרה-צנטריפוגה באמצעות כרית סוכרוז וסובב את הצינורות ב-1,25,000 x גרם במשך שעתיים ב-4 מעלות צלזיוס.
6. המשך עם ריכוז חלקיקי LVS לפחות פי 200 מהנפח המקורי ב- PBS, aliquot, ואחסן ב -80 ° C עד לשימוש.
7. קבע את הטיטר של חלקיקים לנטי-ויראליים באמצעות ערכת הטיטר qPCR Lentivirus בהתאם להוראות היצרן (ראה טבלת חומרים).

2. זיהומים לנטי-ויראליים והתפשטות חד-תאית

1. עבור זיהומים עם חלקיקי LVS, תרחיף תאי hESC (H9) זרע בעל 1 × 10⁵ תאים / 0.5 מ"ל של מדיה בתרבית hESC (מדיה בזאלית + P/S + 10 מיקרומטר של מעכב סלעים) על מטריגל שלם (1:50) מצופה P24 צלחות באר ב 500 μL של מדיה ולדגור במשך הלילה כדי לאפשר לתאים להיקשר. זרע בארות נוספות שלא יהיו נגועות ב- LVS אך יטופלו בפורומיצין כדי לשמש כבקרה לא נגועה.
   הערה: ספירת תאים יכולה להתבצע באמצעות המוציטומטר ידני או מונה תאים אוטומטי.
2. למחרת, להדביק את התאים ב ריבוי של זיהום (MOI) של 10 יחד עם 8 מיקרוגרם / מ"ל של פוליברן לדגור ב 37 ° C במשך 8 שעות ולאחר מכן החלפת מדיה עם מדיה hESC טרי + P / S ללא מעכב סלע ולהמשיך בתרבית עד שהתאים הם 90% נפגשים.
3. התחל את בחירת הפורומיצין על ידי השלמת המדיה עם ריכוז של 0.8 מיקרוגרם / מ"ל של פורומיצין כאשר התאים מגיעים למפגש של 90%, שהוא בדרך כלל 48-72 שעות לאחר ההדבקה, והמשך את הבחירה עד שכל התאים ימותו בתאים שאינם נגועים (קבוצת הביקורת).
4. לאחר השלמת הבחירה (בדרך כלל 4-6 ימים), לפצל תאים יציבים (1:4) ולהרחיב להקפאה וניתוח נוסף.
5. בצע בחירה של תא בודד והרחבת שיבוט באמצעות תאים המבטאים L2HGDH-sgRNA-1⁶.
6. לשם כך, הכינו תרחיף תאים שווה ערך ל-500 תאים/10 מ"ל של מצע גדילה שלם וזרעים של 100 מיקרוליטר של תרחיף זה בכל באר של צלחת 96 בארות.
7. השאירו את התאים ללא הפרעה במשך 3 ימים ולאחר מכן התבוננו.
8. סמן את הבארות המניבות שיבוטים בודדים ושנה את המדיה כל יומיים עד שיושג גודל מספיק עבור המושבות (בדרך כלל שבועיים) להתרחב עוד, להקפיא ולנתח.

3. מיצוי gDNA, MS-BSP PCR וריצוף Sanger

1. בודד gDNA מתאים באמצעות ערכת בידוד הדנ"א הגנומי בהתאם להוראות היצרן (ראה טבלת חומרים).
2. המשך במיפוי אתרי מוטציות במעלה הזרם של רצפי זיהוי PAM באמצעות ניתוח פריימרים ספציפיים מבוססי אתרי מוטציות (MS-BSP)⁸.
3. לשם כך, פריימר ימני בלתי משוחד L2H-UMSBSP-R1 נועד להגביר את האזור שמחוץ ל- Exon1 כדי להגביר את כל המטרות.
4. תכנן פריימר שמאלי מוטה L2H-BMSBSP-F1 עם רצף זהה ל-sgRNA כדי להגביר את רצף המטרה קרוב לרצפי זיהוי PAM.
   הערה: בתנאים מחמירים מאוד של PCR, המוצר ייצפה על הג'ל בשיבוטים ללא מוטציה. שום מוצר לא ייצפה בשיבוטים של CRISPR-knockout המציגים מוטציות קרובות לזרם מעלה של רצפי זיהוי PAM.
5. על מנת למפות מוטציות של זוג בסיסים יחידים, PCR מגביר רצף של 468 bp המשתרע על פני כל האקסון 1 של L2HGDH וכפוף לריצוף Sanger ואחריו ניתוח יישור רצפים מרובים באמצעות clustalw⁸.

4. בדיקת התמיינות תאי גזע עובריים והיווצרות גוף עוברי (EB)

1. המשך עם התמיינות מכוונת של בקרה ושיבוטים שונים של CRISPR של תאי גזע עובריים (H9) לקראת גורל נוירו-אקטודרם בעקבות פרוטוקולים מבוססים כפי שתוארו קודם לכן באמצעות שיטת עיכוב smad כפולה ^9,10,11.
2. כאשר במפגש של 90%, טפל בתאים עם LDN193189 (200 ננומטר) ו- SB431542 (10 מיקרומטר) למשך 24 שעות ראשוניות במדיה של 100% KSR ולאחר מכן תוספת של XAV939 (2 מיקרומטר) למשך יומיים נוספים.
3. לאחר 3 ימים, הפחיתו את אחוז מדיית KSR (Knockout DMEM בתוספת 15% (v/v) KSR, 1% (v/v) L-גלוטמין, 1% (v/v) P/S, 1% (v/v) 10 mM MEM ו-0.1% (v/v) 2-מרקפטואתנול (75%, 50%, 25%) על ידי שילוב עם מדיה N2 (DMEM/F12 בתוספת תוספת N2 1x, מכפיל רווח 1x, ) ל-100% מדיה N2 במשך תקופה של 8 ימים.
4. בתחילת היום ה-12, תקנו את התאים לצביעת מערכת החיסון באמצעות PAX6 כסמן נוירו-אקטודרם (neuro-ectoderm).
5. עבור מחקרים על קביעת גורל מזודרם ואנדודרמלי, השתמש בגישה מבוססת CHIR99021 מולקולה קטנה שתוארה בפרסומים קודמים^12,13.
6. לשם כך, כאשר התאים מגיעים למפגש של 70%, יש לטפל עם 3 מיקרומטר של CHIR99021 במדיה Definitive Endoderm (DE) במשך 24 שעות ולאחר מכן קיבוע עבור immunostaining באמצעות Brachuary כמו סמן ספציפי mesoderm.
7. עבור השלב האנדודרמלי, תרבית את התאים במשך 24 שעות נוספות במדיה DE בלבד ללא תוספת של CHIR99021 לפני קיבוע עבור immunostaining באמצעות FOXA2.
8. לבדיקת היווצרות EB, זרעו את התאים על משטחי תאים בעלי התקשרות נמוכה מבלי להשתמש במטריג'ל לתרבית תאים בתנאי השעיה במשך 24 שעות לפני לקיחת מיקרוגרפים.

5. ניתוח כתמים מערביים

1. יש לשטוף את התאים פעמיים באמצעות PBS וליז באמצעות חיץ RIPA אחד המכיל 1% SDS וקוקטייל מעכבי פרוטאז ופוספטאז 1x.
2. נקה את הליזטים על ידי צנטריפוגה ב 16,000 x גרם במשך 10 דקות ב 4 ° C ואחריו איסוף של supernatants.
3. כמת את חלבון התא הכולל באמצעות ערכת בדיקת חלבון BCA בהתאם להוראות היצרן. התאם את הדגימות ל- 2 מיקרוגרם/מיקרוליטר באמצעות מאגר דגימת צבע טעינה של 4×.
4. נטרלו את דגימות החלבון בטמפרטורה של 70°C למשך 10 דקות, טענו כמויות שוות של כל דגימה ופתרו באמצעות ג'ל SDS-PAGE 7 הדרגתי^של 4%-12% ולאחר מכן העבירו אותן לממברנת PVDF במתח קבוע של 100 V למשך שעה אחת ב-4°C.
5. לחסום את הממברנות באמצעות חלב 5% ללא שומן ולדגור בדילול נוגדנים ראשוני ב 4 ° C במשך הלילה עם סיבוב.
6. לאחר מכן, יש לשטוף את הממברנות 5x באמצעות חיץ PBST ולדגור בנוגדנים משניים מצומדים ל-HRP למשך שעה אחת בטמפרטורת החדר.
7. לשטוף את הממברנות שוב עם PBST 5x, לדגור עם מצע chemiluminescent, ולהתפתח באמצעות יריעות רנטגן.

6. Immunostaining

1. זרעו את התאים על צלחות באר P4 ודגרו לפחות 24 שעות לפני הקיבוע כדי לאפשר חיבור תקין של תאים למשטחים.
2. שטפו את התאים 3x עם PBS כדי להסיר תאים מתים כמו גם רכיבי מדיה, ולאחר מכן קיבוע באמצעות 4% PFA במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר.
3. חדרו את התאים באמצעות 0.3% טריטון X-100 ולאחר מכן חסמו עבור קשירה לא ספציפית על ידי שימוש ב-2% BSA ב-PBS למשך שעה אחת בטמפרטורת החדר.
4. דגרו על הדגימות עם נוגדנים ראשוניים (OCT4, NANOG, SOX2, KI67, PAX6, Brachuary, FOXA2) מדוללים ב-1% BSA למשך הלילה ב-4°C.
5. יש לשטוף את התאים 3x עם PBS ולדגור עם נוגדנים משניים מתאימים (עז נגד עכבר 488, עז נגד ארנב 488, עז נגד עכבר 546, עז נגד ארנב 546) מדולל ב 1% BSA במשך 1 שעה בטמפרטורת החדר.
6. לבסוף, שטפו את הדגימות עם PBS 3x והכתימו אותן נגדית עם DAPI ותמונה באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי.

תוצאות

שיבוט של L2HGDH sgRNA ב-lentiCRISPRv2 puro
וקטור הפורו lentiCRISPRv2 הושג באופן מסחרי (ראו טבלת חומרים) ועוכל עם BsmB1, מה שהביא לשחרור של קטע פוחלץ של 1.8 Kb. כפי שניתן לראות באיור 2A, נצפה עיכול מלא של הווקטור. עבור כל מבנה, שישה שיבוטים נבדקו לנוכחות או היעדר החד...

Discussion

מחקר זה תיקן שיטה המאפשרת מחיקות גנים יעילות וחסכוניות ביותר בתאי גזע עובריים באמצעות טכנולוגיית CRISPR-Cas9. שיטה זו השיגה בהצלחה מחיקה הומוזיגוטית של הגן L2HGDH בתאי גזע עובריים עובריים תוך 3-4 שבועות, החל מזיהום בתאי גזע עובריים עובריים ועד לבחירה והתפשטות של תא בודד (טבל?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
2-MERCAPTOETHANOL	Invitrogen	31350010
38.5 mL, Sterile + Certified Free Open-Top Thinwall Ultra-Clear Tubes	Beckman Coulter	C14292
Accutase	Stem cell technologies	7920
bFGF Recombinant human	Invitrogen	PHG0261
Brachyury Rabbit mAb	Abclonal	A5078
BsmBI-v2	NEB	R0739S
chir99021	Tocris	4423/10
Corning Matrigel Basement Membrane Matrix, LDEV-free	Corning	354234
Cyclopamine	Stem cell technologies	72074
DMEM media	Invitrogen	11995073
DMEM NUTRIENT MIX F12	Invitrogen	11320033
DPBS w/o: Ca and Mg	PAN Biotech	P04-36500
Fetal bovie serum	Invitrogen	10270106
FoxA2/HNF3β	CST	8186
GAPDH (14C10) Rabbit mAb Antibody	CST	2118S
Gentle Cell Dissociation Reagent	Stem cell technologies	7174
HyClone Non Essential Amino Acids (NEAA) 100x Solution	GE healthcare	SH30238.01
Ki-67 (D3B5) Rabbit mAb	CST	9129
KnockOut Serum Replacement	Invitrogen	10828028
L GLUTAMINE, 100x	Invitrogen	2924190090
L2H-BMSBSP-F1	Macrogen		CGTGCGGGTTCGCGTCTGGG
L2HGDH Polyclonal antibody	Proteintech	15707-1-AP
L2HGDH-SgRNA1-F	Macrogen		CACCGCGTGCGG GTTCGCGTCTGGG
L2HGDH-SgRNA1-R	Macrogen		AAACCCCAGACGC GAACCCGCACGC
L2HGDH-SgRNA2-F	Macrogen		CACCGCCCGCGG GCTTTTCGCCGG
L2HGDH-SgRNA2-R	Macrogen		AAACCCGGCGAA AAGCCCGCGGGC
L2H-SeqF1	Macrogen		GCTAAAGAGCGC GGGTCCTCGG
L2H-SeqR1	Macrogen		GTGGACGGGTTG TTCAAAGCCAGAG
L2H-UMSBSP-R1	Macrogen		GTGGACGGGTTG TTCAAAGCCAGAG
LentiCRISPRv2	Addgene	52961
mTesR1 complete media	Stem cell technologies	85850
Nanog Antibody	CST	3580
NEUROBASAL MEDIUM 1x CTS	Invitrogen	A1371201
Neuropan 2 Supplement 100x	PAN Biotech	P07-11050
Neuropan 27 Supplement 50x	PAN Biotech	P07-07200
Oct-4 Antibody	CST	2750
Pax6 (D3A9V) XP Rabbit mAb	CST	60433
PENICILLIN STREPTOMYCIN SOL	Invitrogen	15140122
pMD2.G	Addgene	12259
Polybrene infection reagent	Sigma	TR1003- G
Polyethylenimine, branched	Sigma	408727
psPAX2.0	Addgene	12260
Puromycin	Invitrogen	A1113802
qPCR Lentivirus Titer Kit	Abm	LV900
Rock inhibitor Y-27632 dihydrochloride	Tocris	1254
SB 431542	Tocris	1614/10
Sox2 Antibody	CST	2748
Sucrose	Sigma	57-50-1
TRYPSIN .05% EDTA	Invitrogen	25300062
U6-459F	Macrogen		GAGGGCCTATT TCCCATGATTC
Wizard Genomic DNA Purification Kit	Promega	A1120
XAV 939	Tocris	3748/10