Deleção gênica mediada por CRISPR-Cas9 em células-tronco pluripotentes humanas cultivadas em condições livres de alimentador

Resumo

O método apresentado descreve a geração de um nocaute gênico mediado por CRISPR na linhagem H9 de células-tronco embrionárias humanas (hESC), que expressa de forma estável sgRNAs direcionados ao gene L2HGDH usando um sistema de entrega de genes mediado por lentivírus altamente eficiente.

Resumo

O sistema CRISPR-Cas9 para edição de genoma revolucionou os estudos de função gênica em células de mamíferos, incluindo células-tronco. No entanto, a aplicação prática dessa técnica, particularmente em células-tronco pluripotentes, apresenta alguns desafios, como ser demorada e trabalhosa e ter baixa eficiência de edição. Aqui, descrevemos a geração de um nocaute genético mediado por CRISPR em uma linhagem de células-tronco embrionárias humanas (hESC) expressando sgRNAs estáveis para o gene L2HGDH, usando um sistema de entrega de genes mediado por lentivírus altamente eficiente e estável. Os sgRNAs direcionados ao éxon 1 do gene L2HGDH foram sintetizados quimicamente e clonados no vetor lentiCRISPR v2-puro, que combina a expressão constitutiva de sgRNAs com Cas9 em um sistema de vetor único altamente eficiente para obter títulos lentivirais mais altos para infecção por hESC e seleção estável usando puromicina. As células selecionadas por puromicina foram expandidas e clones de célula única foram obtidos usando o método de diluição limitada. Os clones únicos foram expandidos e vários clones knockout homozigotos para o gene L2HGDH foram obtidos, conforme confirmado por uma redução de 100% na expressão de L2HGDH usando análise de Western blot. Além disso, usando MSBSP-PCR, o local da mutação CRISPR foi mapeado a montante da sequência de reconhecimento PAM de Cas9 nos clones homozigotos selecionados. O sequenciamento de Sanger foi realizado para analisar as inserções/deleções exatas e a caracterização funcional dos clones foi realizada. Este método produziu uma porcentagem significativamente maior de deleções homozigóticas em comparação com os métodos de entrega de genes não virais relatados anteriormente. Embora este relatório se concentre no gene L2HGDH, essa abordagem robusta e econômica pode ser usada para criar nocautes homozigotos para outros genes em células-tronco pluripotentes para estudos de função gênica.

Introdução

As células-tronco embrionárias humanas (hESCs) e as células-tronco pluripotentes induzidas (iPSCs) são células-tronco com potencial para se diferenciar em todos os tipos de células do corpo. Essas células servem como ferramentas valiosas para estudar o desenvolvimento humano, bem como para entender os mecanismos subjacentes de várias doenças, oferecendo assim uma tremenda promessa para a medicina regenerativa, modelagem de doenças e descoberta de medicamentos. Tais estudos envolvem a investigação de como genes específicos contribuem para o desenvolvimento, funcionamento e regulação dos organismos ^1,2.

Várias técnicas e abordagens são empregadas para decifrar a função do gene, incluindo manipulação genética, como nocaute ou superexpressão de genes, e edição do genoma. Dentre estes, a tecnologia CRISPR-Cas9 emergiu como a abordagem mais eficiente para estudos de nocaute genético e edição de genes ^1,2,3. O sistema CRISPR-Cas9 funciona utilizando uma única molécula de RNA guia (sgRNA) projetada especificamente para identificar e se ligar a uma sequência de DNA específica de interesse. Atuando como um guia molecular, o sgRNA direciona a enzima Cas9 para o local preciso no genoma que requer modificação. Uma vez ligado, Cas9 inicia uma quebra de fita dupla no DNA no local designado. Após a clivagem do DNA, os mecanismos de reparo inerentes à célula são ativados. Isso inclui duas vias principais de reparo: junção de extremidade não homóloga (NHEJ) e reparo dirigido por homologia (HDR). O NHEJ geralmente resulta em inserções ou deleções (indels) no local da quebra, levando à interrupção ou inativação do gene. Por outro lado, o HDR permite a inserção de novas sequências de DNA no local da quebra, facilitando a introdução de alterações genéticas direcionadas⁴.

Dada a importância das deleções gênicas em células-tronco pluripotentes, vários protocolos foram publicados sobre nocautes gênicos mediados por CRISPR-Cas9 em hESCs/iPSCs. No entanto, muitos desses protocolos enfrentam limitações significativas, como serem extremamente demorados, trabalhosos e de baixa eficiência devido ao uso de métodos de entrega de genes não virais⁵. Esses desafios são ainda mais pronunciados em hESCs/iPSCs, pois essas células são conhecidas por terem menor eficiência de edição em comparação com outros tipos de células⁵. Algumas dessas limitações podem ser resolvidas aumentando a eficiência da entrega de plasmídeos contendo Cas9 e sgRNAs. Isso pode ser alcançado com sucesso usando um sistema de vetor lentiviral, que pode melhorar significativamente os resultados da edição de genes. Os protocolos de empacotamento de lentivírus são bem estabelecidos e diretos, permitindo fácil adoção em laboratórios, mesmo por pesquisadores com experiência limitada. Os lentivírus exibem alta eficiência de infecção em vários tipos de células, incluindo hESCs e iPSCs. Portanto, a utilização de um sistema lentiviral para expressão de Cas9-sgRNA é ideal para experimentos de edição de genes de rotina em hESCs/iPSCs para estudos de função gênica.

Aqui, fornecemos um método simples e direto para deleções de genes baseadas em CRISPR-Cas9 altamente eficientes em hESCs em uma duração de tempo comparativamente mais curta do que os protocolos convencionais (Figura 1). Embora um vetor lentiviral com expressão constitutiva de Cas9 e sgRNA tenha sido usado, ele pode ser facilmente substituído pela expressão de Cas9 induzível por drogas para expressão controlável de Cas9.

Protocolo

Os detalhes das sequências genéticas, reagentes e equipamentos usados neste estudo estão listados na Tabela de Materiais.

1. Design de RNA guia único (sgRNA), clonagem e produção de vetor lentiviral

NOTA: Duas sequências diferentes de sgRNA direcionadas ao éxon 1 do gene L2HGDH , ambas adaptadas de Qiu et ^al.6com sítios PAM de AGG e TGG para as sequências 1 e 2, respectivamente, são usadas. Ambos os sgRNAs tinham 20 pb de comprimento e as extremidades foram modificadas para adicionar sequências de ligantes para a enzima de restrição Bsmb1 a ser clonada no vetor alvo (LentiCRISPRv2), conforme descrito no relatório anterior⁶. Sequências de ligantes foram adicionadas durante o projeto de sgRNAs para fins de clonagem.

1. Recozer sintetizou quimicamente sgRNAs⁶ e clonou em vetor lentiviral de corte único Bsmb1, LentiCRISPRv2 usando protocolo otimizado conforme relatado anteriormente⁷.
2. Prossiga com o empacotamento e concentração de lentivírus usando protocolo padronizado e otimizado⁷.
3. Para a produção de lentivírus, semear HEK293T células (1 × 10⁵ células/^cm2) usando DMEM, 10% de FBS e 1x penicilina/estreptomicina (P/S) e incubar durante a noite em incubadora de cultura de tecidos a 37 °C em uma atmosfera de 5% de CO₂ em condições úmidas.
4. Quando 90% confluentes, co-transfectam células HEK293T com vetor de entrada (esqueleto vazio ou plasmídeos expressores de sgRNA) e plasmídeos de empacotamento usando polímero catiônico de baixo custo PEI, conforme descrito anteriormente⁷.
5. Coletar os meios condicionados contendo partículas de sobrenadante lentiviral (LVS) 48 h e 72 h após a transfecção e proceder à ultracentrifugação com almofada de sacarose e girar os tubos a 1,25,000 x g por 2 h a 4 ° C.
6. Prosseguir com a concentração de partículas LVS para pelo menos 200 vezes o volume original em PBS, alíquota e armazenar a -80 °C até o uso.
7. Determine o título de partículas lentivirais usando o kit de título de lentivírus qPCR seguindo as instruções do fabricante (consulte a Tabela de Materiais).

2. Infecções lentivirais e propagação clonal de célula única

1. Para infecções com partículas LVS, semeie a suspensão de células hESC (H9) com 1 × 10⁵ células/0,5 mL de meio de cultura hESC (meio basal + P/S + 10 μM de inibidor de rocha) em placas de poço P24 revestidas com Matrigel (1:50) completas em 500 μL de meio e incube durante a noite para permitir que as células se fixem. Semeie poços extras que não seriam infectados com LVS, mas tratados com puromicina para servir como controle não infectado.
   NOTA: A contagem de células pode ser realizada usando um hemocitômetro manual ou contador de células automatizado.
2. No dia seguinte, infecte as células em Multiplicidade de Infecção (MOI) de 10 junto com 8 μg / mL de polibreno e incube a 37 ° C por 8 h, seguido de substituição do meio por meio hESC fresco + P / S sem inibidor de rocha e continue a cultura até que as células estejam 90% confluentes.
3. Inicie a seleção de puromicina suplementando o meio com concentração de 0,8 μg / mL de puromicina quando as células atingirem 90% de confluência, que geralmente é 48-72 h após a infecção, e continue a seleção até que todas as células morram nas células não infectadas (grupo controle).
4. Após a conclusão da seleção (geralmente 4-6 dias), divida as células estáveis (1:4) e expanda para criopreservação e análise posterior.
5. Realize a seleção de células únicas e a expansão clonal usando células que expressam L2HGDH-sgRNA-1⁶.
6. Para isso, preparar uma suspensão celular equivalente a 500 células/10 mL de meio de crescimento completo e semear 100 μL dessa suspensão em cada poço de uma placa de 96 poços.
7. Deixe as células intactas por 3 dias e depois observe.
8. Marque os poços que produzem clones únicos e troque o meio a cada dois dias até que um tamanho suficiente seja alcançado para que as colônias (geralmente 2 semanas) se expandam ainda mais, criopreservem e analisem.

3. extração de gDNA, MS-BSP PCR e sequenciamento de Sanger

1. Isole o gDNA das células usando o kit de isolamento de DNA genômico seguindo as instruções do fabricante (consulte a Tabela de Materiais).
2. Prossiga com o mapeamento dos locais de mutação a montante das sequências de reconhecimento PAM usando a análise de Mutation Sites Based Specific Primers (MS-BSP)⁸.
3. Para isso, um primer direito imparcial L2H-UMSBSP-R1 é projetado para amplificar a região fora do Exon1 para amplificar quaisquer alvos.
4. Projete um primer esquerdo tendencioso L2H-BMSBSP-F1 com uma sequência idêntica ao sgRNA para amplificar a sequência alvo próxima às sequências de reconhecimento PAM.
   NOTA: Em condições muito rigorosas de PCR, o produto será observado no gel em clones não mutados. Nenhum produto seria observado em clones nocaute para CRISPR exibindo mutações próximas a montante das sequências de reconhecimento de PAM.
5. Para mapear mutações de par de bases únicas, a PCR amplifica uma sequência de 468 pb abrangendo todo o éxon 1 de L2HGDH e sujeita a sequenciamento de Sanger seguido de análise de alinhamento de sequência múltipla usando clustalw⁸.

4. ensaio de diferenciação de hESC e formação de corpo embrióide (EB)

1. Prossiga com a diferenciação direcionada de controle e diferentes clones CRISPR de hESCs (H9) para o destino do neuroectoderma seguindo protocolos estabelecidos, conforme descrito anteriormente, usando o método de inibição de smad duplo ^9,10,11.
2. Quando estiver a 90% de confluência, trate as células com LDN193189 (200 nM) e SB431542 (10 μM) por 24 h iniciais em meio 100% KSR, seguido pela adição de XAV939 (2 μM) por mais 2 dias.
3. Após 3 dias, reduza a porcentagem de meio KSR (Knockout DMEM suplementado com 15% (v / v) KSR, 1% (v / v) L-glutamina, 1% (v / v) P / S, 1% (v / v) 10 mM MEM e 0,1% (v / v) 2-mercaptoetanol (75%, 50%, 25%) combinando com meio N2 (DMEM / F12 suplementado com 1x suplemento N2, 1x P / S, ) a 100% de N2 durante um período de 8 dias.
4. No início do dia 12, fixe as células para imunocoloração usando PAX6 como marcador neuro-ectoderma.
5. Para estudos de determinação de mesoderma e destino endodérmico, empregue uma abordagem baseada em CHIR99021 de pequenas moléculas descrita em publicações anteriores^12,13.
6. Para isso, quando as células atingirem 70% de confluência, tratar com 3 μM de CHIR99021 em meio de Endoderme Definitiva (DE) por 24 h seguido de fixação para imunomarcação utilizando Brachuary como marcador mesoderma específico.
7. Para a fase endodérmica, cultivar as células durante mais 24 h apenas em meio DE, sem adição de CHIR99021 antes de fixar para imunocoloração com FOXA2.
8. Para o ensaio de formação de EB, semeie as células em superfícies celulares de baixa fixação sem usar Matrigel para cultivar células sob condições de suspensão por 24 h antes de fazer micrografias.

5. Análise de Western blot

1. Lave as células duas vezes usando PBS e lise usando 1x tampão RIPA contendo 1% de SDS e 1x coquetel de inibidores de protease e fosfatase.
2. Limpar os lisados por centrifugação a 16.000 x g durante 10 min a 4 °C, seguida de recolha dos sobrenadantes.
3. Quantifique a proteína celular total usando o kit de ensaio de proteína BCA seguindo as instruções do fabricante. Ajuste as amostras para 2 μg/μL usando 4× tampão de amostra de corante de carga.
4. Desnaturar as amostras de proteína a 70 ° C por 10 min, carregar quantidades iguais de cada amostra e resolver usando géis SDS-PAGE de gradiente de 4% a 12%⁷ , seguido de transferência para membrana de PVDF a uma tensão constante de 100 V por 1 h a 4 ° C.
5. Bloquear as membranas com 5% de leite desnatado e incubar em diluições de anticorpos primários a 4 °C durante a noite com rotação.
6. Em seguida, lave as membranas 5x usando tampão PBST e incube em anticorpos secundários apropriados conjugados com HRP por 1 h à temperatura ambiente.
7. Lave as membranas novamente com PBST 5x, incube com substrato quimioluminescente e revele usando filmes de raios-X.

6. Imunocoloração

1. Semeie as células em placas de poços P4 e incube por pelo menos 24 h antes da fixação para permitir a fixação adequada das células às superfícies.
2. Lave as células 3x com PBS para remover quaisquer células mortas, bem como componentes do meio, seguido de fixação usando PFA a 4% por 15 min em temperatura ambiente.
3. Permeabilize as células usando 0,3% de triton X-100 seguido de bloqueio para ligação inespecífica usando 2% de BSA em PBS por 1 h à temperatura ambiente.
4. Incubar as amostras com anticorpos primários (OCT4, NANOG, SOX2, KI67, PAX6, Brachuary, FOXA2) diluídos em 1% de BSA durante a noite a 4 °C.
5. Lave as células 3x com PBS e incube com anticorpos secundários apropriados (cabra anti-camundongo 488, cabra anti-coelho 488, cabra anti-camundongo 546, cabra anti-coelho 546) diluídos em 1% BSA por 1 h em temperatura ambiente.
6. Por fim, lave as amostras com PBS 3x e contra-core com DAPI e imagem usando um microscópio de fluorescência.

Resultados

Clonagem de sgRNAs de L2HGDH em lentiCRISPRv2 puro
O vetor puro lentiCRISPRv2 foi obtido comercialmente (ver Tabela de Materiais) e digerido com BsmB1, o que resultou na liberação de um fragmento de enchimento de 1,8 Kb. Conforme mostrado na Figura 2A, foi observada uma digestão completa do vetor. Para cada construção, seis clones foram selecionados quanto à presença ou ausência de inserção usando a sequência d...

Discussão

Este estudo padronizou um método que permite deleções gênicas altamente eficientes e econômicas em hESCs por meio da tecnologia CRISPR-Cas9. Este método alcançou com sucesso a deleção homozigótica do gene L2HGDH em hESCs em 3-4 semanas, desde a infecção por hESC até a seleção e propagação clonal de célula única (Tabela 1). Embora as manipulações de genes mediadas por CRISPR-Cas9 possam ser alcançadas por transfecções transitórias na maioria das c...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
2-MERCAPTOETHANOL	Invitrogen	31350010
38.5 mL, Sterile + Certified Free Open-Top Thinwall Ultra-Clear Tubes	Beckman Coulter	C14292
Accutase	Stem cell technologies	7920
bFGF Recombinant human	Invitrogen	PHG0261
Brachyury Rabbit mAb	Abclonal	A5078
BsmBI-v2	NEB	R0739S
chir99021	Tocris	4423/10
Corning Matrigel Basement Membrane Matrix, LDEV-free	Corning	354234
Cyclopamine	Stem cell technologies	72074
DMEM media	Invitrogen	11995073
DMEM NUTRIENT MIX F12	Invitrogen	11320033
DPBS w/o: Ca and Mg	PAN Biotech	P04-36500
Fetal bovie serum	Invitrogen	10270106
FoxA2/HNF3β	CST	8186
GAPDH (14C10) Rabbit mAb Antibody	CST	2118S
Gentle Cell Dissociation Reagent	Stem cell technologies	7174
HyClone Non Essential Amino Acids (NEAA) 100x Solution	GE healthcare	SH30238.01
Ki-67 (D3B5) Rabbit mAb	CST	9129
KnockOut Serum Replacement	Invitrogen	10828028
L GLUTAMINE, 100x	Invitrogen	2924190090
L2H-BMSBSP-F1	Macrogen		CGTGCGGGTTCGCGTCTGGG
L2HGDH Polyclonal antibody	Proteintech	15707-1-AP
L2HGDH-SgRNA1-F	Macrogen		CACCGCGTGCGG GTTCGCGTCTGGG
L2HGDH-SgRNA1-R	Macrogen		AAACCCCAGACGC GAACCCGCACGC
L2HGDH-SgRNA2-F	Macrogen		CACCGCCCGCGG GCTTTTCGCCGG
L2HGDH-SgRNA2-R	Macrogen		AAACCCGGCGAA AAGCCCGCGGGC
L2H-SeqF1	Macrogen		GCTAAAGAGCGC GGGTCCTCGG
L2H-SeqR1	Macrogen		GTGGACGGGTTG TTCAAAGCCAGAG
L2H-UMSBSP-R1	Macrogen		GTGGACGGGTTG TTCAAAGCCAGAG
LentiCRISPRv2	Addgene	52961
mTesR1 complete media	Stem cell technologies	85850
Nanog Antibody	CST	3580
NEUROBASAL MEDIUM 1x CTS	Invitrogen	A1371201
Neuropan 2 Supplement 100x	PAN Biotech	P07-11050
Neuropan 27 Supplement 50x	PAN Biotech	P07-07200
Oct-4 Antibody	CST	2750
Pax6 (D3A9V) XP Rabbit mAb	CST	60433
PENICILLIN STREPTOMYCIN SOL	Invitrogen	15140122
pMD2.G	Addgene	12259
Polybrene infection reagent	Sigma	TR1003- G
Polyethylenimine, branched	Sigma	408727
psPAX2.0	Addgene	12260
Puromycin	Invitrogen	A1113802
qPCR Lentivirus Titer Kit	Abm	LV900
Rock inhibitor Y-27632 dihydrochloride	Tocris	1254
SB 431542	Tocris	1614/10
Sox2 Antibody	CST	2748
Sucrose	Sigma	57-50-1
TRYPSIN .05% EDTA	Invitrogen	25300062
U6-459F	Macrogen		GAGGGCCTATT TCCCATGATTC
Wizard Genomic DNA Purification Kit	Promega	A1120
XAV 939	Tocris	3748/10