CRISPR-Cas9 介导在无饲养层条件下培养的人多能干细胞中的基因缺失

摘要

所提出的方法描述了在人胚胎干细胞 （hESC） 系 H9 中产生 CRISPR 介导的基因敲除，该基因使用高效的慢病毒介导的基因递送系统稳定表达靶向 L2HGDH 基因的 sgRNA。

摘要

用于基因组编辑的 CRISPR-Cas9 系统彻底改变了哺乳动物细胞（包括干细胞）的基因功能研究。然而，该技术的实际应用，特别是在多能干细胞中，存在一定的挑战，例如时间和劳动密集型以及编辑效率低。在这里，我们描述了使用高效和稳定的慢病毒介导的基因递送系统，在稳定表达 L2HGDH 基因 sgRNA 的人胚胎干细胞 （hESC） 系中产生 CRISPR 介导的基因敲除。化学合成靶向 L2HGDH 基因外显子 1 的 sgRNA 并克隆到 lentiCRISPR v2-puro 载体中，该载体将 sgRNA 与 Cas9 的组成型表达结合在一个高效的单载体系统中，以实现更高的 hESC 感染慢病毒滴度和使用嘌呤霉素进行稳定选择。嘌呤霉素选择的细胞进一步扩增，并使用有限稀释法获得单细胞克隆。扩增单个克隆，并获得 L2HGDH 基因的几个纯合敲除克隆，使用 Western blot 分析将 L2HGDH 表达降低 100% 证实。此外，使用 MSBSP-PCR，在选定的纯合克隆中，将 CRISPR 突变位点定位在 Cas9 的 PAM 识别序列的上游。进行 Sanger 测序以分析确切的插入/缺失，并对克隆进行功能表征。与先前报道的非病毒基因递送方法相比，该方法产生的纯合缺失百分比显着更高。虽然本报告侧重于 L2HGDH 基因，但这种稳健且具有成本效益的方法可用于为多能干细胞中的其他基因创建纯合敲除，以进行基因功能研究。

引言

人胚胎干细胞 （hESC） 和诱导多能干细胞 （iPSC） 是具有分化为体内所有细胞类型的潜力的干细胞。这些细胞是研究人类发育以及了解各种疾病潜在机制的宝贵工具，因此为再生医学、疾病建模和药物发现提供了巨大的前景。此类研究涉及调查特定基因如何促进生物体的发育、功能和调节 ^1,2。

采用各种技术和方法来破译基因功能，包括基因作，例如基因敲除或过表达，以及基因组编辑。其中，CRISPR-Cas9 技术已成为基因敲除和基因编辑研究的最有效方法 ^1,2,3。CRISPR-Cas9 系统的工作原理是利用专门设计用于识别和结合特定目标 DNA 序列的单向导 RNA （sgRNA） 分子。作为分子指南，sgRNA 将 Cas9 酶引导至基因组中需要修饰的精确位置。一旦结合，Cas9 就会在指定位点启动 DNA 中的双链断裂。DNA 切割后，细胞固有的修复机制被激活。这些包括两种主要的修复途径:非同源末端连接 （NHEJ） 和同源定向修复 （HDR）。NHEJ 通常会导致断裂位点的插入或缺失（插入缺失），从而导致基因破坏或失活。相反，HDR 能够在断裂位点插入新的 DNA 序列，从而促进靶向遗传改变的引入⁴。

鉴于基因缺失在多能干细胞中的重要性，已经发表了几种关于 CRISPR-Cas9 介导的 hESC/iPSC 基因敲除的方案。然而，其中许多方案面临重大限制，例如极其耗时、劳动密集型以及由于使用非病毒基因递送方法而效率低下⁵。这些挑战在 hESC/iPSC 中更为明显，因为众所周知，与其他细胞类型相比，这些细胞的编辑效率较低⁵。其中一些限制可以通过提高含有 Cas9 和 sgRNA 的质粒递送的效率来解决。这可以使用慢病毒载体系统成功实现，这可以显着改善基因编辑结果。慢病毒包装方案成熟且简单明了，即使在经验有限的研究人员也能在实验室中轻松采用。慢病毒在各种细胞类型（包括 hESC 和 iPSC）中表现出高感染效率。因此，利用慢病毒系统进行 Cas9-sgRNA 表达是 hESCs/iPSC 中用于基因功能研究的常规基因编辑实验的理想选择。

在这里，我们提供了一种简单明了的方法，可以在比传统方案相对较短的持续时间内在 hESC 中高效地基于 CRISPR-Cas9 的基因缺失（图 1）。尽管已经使用了具有 Cas9 和 sgRNA 组成型表达的慢病毒载体，但可以很容易地用药物诱导型 Cas9 表达代替它，以实现可控的 Cas9 表达。

研究方案

本研究中使用的基因序列、试剂和设备的详细信息列在 材料表中。

1. 单向导 RNA （sgRNA） 设计、克隆和慢病毒载体生产

注:使用靶向 L2HGDH 基因外显子 1 的两种不同的 sgRNA 序列，均改编自 Qiu 等人 ⁶，序列 1 和 2 分别具有 AGG 和 TGG 的 PAM 位点。两个 sgRNA 的长度均为 20 bp，末端被修饰为添加限制性内切酶 Bsmb1 的连接序列，以便在目标载体 （LentiCRISPRv2） 中克隆，如上一份报告⁶ 所述。在设计 sgRNA 期间添加接头序列用于克隆目的。

1. 退火化学合成 sgRNAs⁶ 并使用先前报道的优化方案克隆到 Bsmb1 单切慢病毒载体 LentiCRISPRv2^{中 7}。
2. 使用标准化和优化的方案进行慢病毒包装和浓缩⁷.
3. 对于慢病毒生产，使用 DMEM、10% FBS 和 1x 青霉素/链霉素 （P/S） 接种HEK293T细胞（1 × 10⁵ 个细胞/cm²），并在 37 °C 的组织培养箱中在 5% CO₂ 的气氛中孵育过夜潮湿条件。
4. 当 90% 汇合时，使用低成本阳离子聚合物 PEI 共转染带有入口载体（空骨架或 sgRNA 表达质粒）和包装质粒的 HEK293T 细胞，如前所述⁷。
5. 在转染后 48 小时和 72 小时收集含有慢病毒上清液 （LVS） 颗粒的条件培养基，并使用蔗糖垫进行超速离心，并在 4 °C 下以 1,25,000 x g 旋转试管 2 小时。
6. 继续将 LVS 颗粒浓度降至 PBS 中原始体积的至少 200 倍，等分试样，并储存在 -80 °C 直至使用。
7. 按照制造商的说明使用 qPCR 慢病毒滴度试剂盒测定慢病毒颗粒的滴度（参见 材料表）。

2. 慢病毒感染和单细胞克隆繁殖

1. 对于 LVS 颗粒感染，将具有 1 ×^{10 个 5} 个细胞/0.5 mL hESC 培养基（基础培养基 + P/S + 10 μM 岩石抑制剂）的 hESC （H9） 细胞悬液接种在完整的基质胶 （1:50） 包被的 P24 孔板上，在 500 μL 培养基中，孵育过夜以使细胞附着。接种不会被 LVS 感染但用嘌呤霉素处理的额外孔，作为未感染的对照。
   注:可以使用手动血球计数器或自动细胞计数仪进行细胞计数。
2. 第二天，以 10 的感染复数 （MOI） 和 8 μg/mL 聚凝胺感染细胞，并在 37 °C 下孵育 8 小时，然后用新鲜的 hESC 培养基 + P/S 更换培养基，不含 Rock 抑制剂并继续培养，直到细胞达到 90% 汇合。
3. 当细胞达到 90% 汇合度时（通常是感染后 48-72 小时），通过向培养基补充 0.8 μg/mL 浓度的嘌呤霉素来开始嘌呤霉素选择，并继续选择直到所有细胞在未感染的细胞中死亡（对照组）。
4. 选择完成后（通常为 4-6 天），分液稳定细胞 （1:4） 并扩增以进行冷冻保存和进一步分析。
5. 使用表达 L2HGDH-sgRNA-1 的细胞进行单细胞选择和克隆扩增⁶。
6. 为此，制备相当于 500 个细胞/10 mL 完全生长培养基的细胞悬液，并在 96 孔板的每个孔中接种 100 μL 这种悬浮液。
7. 让细胞不受干扰 3 天，然后观察。
8. 标记产生单个克隆的孔，并每隔一天更换一次培养基，直到达到足够的大小，使菌落进一步扩增、冷冻保存和分析（通常为 2 周）。

3. gDNA 提取、MS-BSP PCR 和 Sanger 测序

1. 按照制造商的说明，使用基因组 DNA 分离试剂盒从细胞中分离 gDNA（参见 材料表）。
2. 使用基于突变位点的特异性引物 （MS-BSP） 分析⁸ 继续对 PAM 识别序列上游的突变位点进行定位。
3. 为此，设计了无偏倚右引物 L2H-UMSBSP-R1 来扩增外显子 1 外的区域以扩增任何靶标。
4. 设计与 sgRNA 具有相同序列的偏倚左引物 L2H-BMSBSP-F1，以扩增接近 PAM 识别序列的靶序列。
   注:在非常严格的 PCR 条件下，将在未突变克隆的凝胶上观察到产物。在 PAM 识别序列上游附近表现出突变的 CRISPR 敲除克隆中不会观察到任何产物。
5. 为了定位单碱基对突变，PCR 扩增跨越 L2HGDH 整个外显子 1 的 468 bp 序列，并进行 Sanger 测序，然后使用 clustalw⁸ 进行多序列比对分析。

4. hESC 分化和拟胚体 （EB） 形成测定

1. 按照先前描述的既定方案，使用双重 smad 抑制方法 ^9,10,11，^继续对 hESC （H9） 的对照和不同 CRISPR 克隆进行神经外胚层命运的定向分化。
2. 当达到 90% 汇合时，在 100% KSR 培养基中用 LDN193189 （200 nM） 和 SB431542 （10 μM） 处理细胞最初 24 小时，然后添加 XAV939 （2 μM） 再添加 2 天。
3. 3天后，通过与N2培养基（补充有1x N2补充剂、1x P/S的DMEM/F12、1x P/S、1% （v/v） P/S、1%（v/v）10 mM MEM和0.1%（v / v）2-巯基乙醇（75%、50%、25%）结合，降低KSR培养基（补充有1x N2补充剂、1x P/S、） 添加到 100% N2 培养基中。
4. 在第 12 天开始时，使用 PAX6 作为神经外胚层标志物固定细胞以进行免疫染色。
5. 对于中胚层和内胚层命运确定研究，采用先前出版物^12,13 中描述的基于小分子CHIR99021的方法。
6. 为此，当细胞达到 70% 汇合时，在定形内胚层 （DE） 培养基中用 3 μM CHIR99021处理 24 小时，然后使用 Brachuary 作为中胚层特异性标记物固定以进行免疫染色。
7. 对于内胚层阶段，在固定使用 FOXA2 进行免疫染色之前，仅在 DE 培养基中将细胞再培养 24 小时，而不添加 CHIR99021。
8. 对于 EB 形成测定，在拍摄显微照片之前，将细胞接种在低附着细胞表面上，而不使用 Matrigel 在悬浮条件下培养细胞 24 小时。

5. 蛋白质印迹分析

1. 使用 PBS 洗涤细胞两次，并使用含有 1% SDS 和 1x 蛋白酶和磷酸酶抑制剂混合物的 1x RIPA 缓冲液裂解。
2. 通过在 4 °C 下以 16,000 x g 离心 10 分钟，然后收集上清液来清除裂解物。
3. 按照制造商的说明使用 BCA 蛋白检测试剂盒定量总细胞蛋白。使用 4 × 上样染料样品缓冲液将样品调节至 2 μg/μL。
4. 将蛋白质样品在 70 °C 下变性 10 分钟，加载等量的每个样品，并使用 4%-12% 梯度的 SDS-PAGE 凝胶⁷ 分离，然后在 4 °C 下以 100 V 的恒定电压转移到 PVDF 膜上 1 小时。
5. 使用 5% 脱脂牛奶封闭膜，并在 4 °C 下以一抗稀释液旋转孵育过夜。
6. 接下来，使用 PBST 缓冲液洗涤膜 5 次，并在室温下在 HRP 偶联的适当二抗中孵育 1 小时。
7. 用 PBST 5x 再次洗涤膜，与化学发光底物孵育，并使用 X 射线胶片显影。

6. 免疫染色

1. 将细胞接种在 P4 孔板上，并在固定前孵育至少 24 小时，以使细胞正确附着在表面上。
2. 用 PBS 洗涤细胞 3 次以去除任何死细胞和培养基成分，然后在室温下使用 4% PFA 固定 15 分钟。
3. 通过使用 0.3% triton X-100 透化细胞，然后在室温下使用 2% BSA 在 PBS 中 1 小时封闭非特异性结合。
4. 将样品与用 1% BSA 稀释的一抗（OCT4、NANOG、SOX2、KI67、PAX6、Brachuary、FOXA2）在 4 °C 下孵育过夜。
5. 用 PBS 洗涤细胞 3 次，并与适当的二抗（山羊抗小鼠 488、山羊抗兔 488、山羊抗小鼠 546、山羊抗兔 546）在室温下孵育 1 小时。
6. 最后，用 PBS 3x 洗涤样品，并用 DAPI 复染并使用荧光显微镜成像。

结果

在 lentiCRISPRv2 puro 中克隆 L2HGDH sgRNA
lentiCRISPRv2 puro 载体是市售的（参见 材料表）并用 BsmB1 消化，从而释放出 1.8 Kb 的填充物片段。如图 2A 所示，观察到载体的完全消化。对于每个构建体，使用反向 sgRNA 序列作为引物和载体序列内的正向引物 （U6-459F） 筛选 6 个克隆是否存在插入片段。使用这种方法，只有那些具有插入片...

讨论

本研究标准化了一种方法，该方法通过 CRISPR-Cas9 技术在 hESC 中实现高效且具有成本效益的基因缺失。该方法从 hESC 感染开始到单细胞克隆选择和增殖，在 3-4 周内成功实现了 hESC 中 L2HGDH 基因的纯合缺失（表 1）。尽管 CRISPR-Cas9 介导的基因作可以在大多数细胞中通过瞬时转染来实现，但由于转染效率差且细胞毒性高，这在干细胞中变得具有挑战性。不同的研?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
2-MERCAPTOETHANOL	Invitrogen	31350010
38.5 mL, Sterile + Certified Free Open-Top Thinwall Ultra-Clear Tubes	Beckman Coulter	C14292
Accutase	Stem cell technologies	7920
bFGF Recombinant human	Invitrogen	PHG0261
Brachyury Rabbit mAb	Abclonal	A5078
BsmBI-v2	NEB	R0739S
chir99021	Tocris	4423/10
Corning Matrigel Basement Membrane Matrix, LDEV-free	Corning	354234
Cyclopamine	Stem cell technologies	72074
DMEM media	Invitrogen	11995073
DMEM NUTRIENT MIX F12	Invitrogen	11320033
DPBS w/o: Ca and Mg	PAN Biotech	P04-36500
Fetal bovie serum	Invitrogen	10270106
FoxA2/HNF3β	CST	8186
GAPDH (14C10) Rabbit mAb Antibody	CST	2118S
Gentle Cell Dissociation Reagent	Stem cell technologies	7174
HyClone Non Essential Amino Acids (NEAA) 100x Solution	GE healthcare	SH30238.01
Ki-67 (D3B5) Rabbit mAb	CST	9129
KnockOut Serum Replacement	Invitrogen	10828028
L GLUTAMINE, 100x	Invitrogen	2924190090
L2H-BMSBSP-F1	Macrogen		CGTGCGGGTTCGCGTCTGGG
L2HGDH Polyclonal antibody	Proteintech	15707-1-AP
L2HGDH-SgRNA1-F	Macrogen		CACCGCGTGCGG GTTCGCGTCTGGG
L2HGDH-SgRNA1-R	Macrogen		AAACCCCAGACGC GAACCCGCACGC
L2HGDH-SgRNA2-F	Macrogen		CACCGCCCGCGG GCTTTTCGCCGG
L2HGDH-SgRNA2-R	Macrogen		AAACCCGGCGAA AAGCCCGCGGGC
L2H-SeqF1	Macrogen		GCTAAAGAGCGC GGGTCCTCGG
L2H-SeqR1	Macrogen		GTGGACGGGTTG TTCAAAGCCAGAG
L2H-UMSBSP-R1	Macrogen		GTGGACGGGTTG TTCAAAGCCAGAG
LentiCRISPRv2	Addgene	52961
mTesR1 complete media	Stem cell technologies	85850
Nanog Antibody	CST	3580
NEUROBASAL MEDIUM 1x CTS	Invitrogen	A1371201
Neuropan 2 Supplement 100x	PAN Biotech	P07-11050
Neuropan 27 Supplement 50x	PAN Biotech	P07-07200
Oct-4 Antibody	CST	2750
Pax6 (D3A9V) XP Rabbit mAb	CST	60433
PENICILLIN STREPTOMYCIN SOL	Invitrogen	15140122
pMD2.G	Addgene	12259
Polybrene infection reagent	Sigma	TR1003- G
Polyethylenimine, branched	Sigma	408727
psPAX2.0	Addgene	12260
Puromycin	Invitrogen	A1113802
qPCR Lentivirus Titer Kit	Abm	LV900
Rock inhibitor Y-27632 dihydrochloride	Tocris	1254
SB 431542	Tocris	1614/10
Sox2 Antibody	CST	2748
Sucrose	Sigma	57-50-1
TRYPSIN .05% EDTA	Invitrogen	25300062
U6-459F	Macrogen		GAGGGCCTATT TCCCATGATTC
Wizard Genomic DNA Purification Kit	Promega	A1120
XAV 939	Tocris	3748/10