Délétion de gène médiée par CRISPR-Cas9 dans des cellules souches pluripotentes humaines cultivées dans des conditions sans nourrisseur

Résumé

La méthode présentée décrit la génération d’un gène knock-out médié par CRISPR dans la lignée H9 de cellules souches embryonnaires humaines (hESC), qui exprime de manière stable des sgRNA ciblant le gène L2HGDH à l’aide d’un système de distribution de gènes à médiation lentivirale très efficace.

Résumé

Le système CRISPR-Cas9 pour l’édition du génome a révolutionné les études de la fonction des gènes dans les cellules de mammifères, y compris les cellules souches. Cependant, l’application pratique de cette technique, en particulier dans les cellules souches pluripotentes, présente certains défis, tels que le fait qu’elle demande beaucoup de temps et de main-d’œuvre et qu’elle a une faible efficacité d’édition. Ici, nous décrivons la génération d’un knock-out de gène médié par CRISPR dans une lignée de cellules souches embryonnaires humaines (hESC) exprimant de manière stable des sgRNA pour le gène L2HGDH, à l’aide d’un système de distribution de gènes à médiation lentivirale très efficace et stable. Les ARNsg ciblant l’exon 1 du gène L2HGDH ont été synthétisés chimiquement et clonés dans le vecteur lentiCRISPR v2-puro, qui combine l’expression constitutive des ARNsg avec Cas9 dans un système à vecteur unique très efficace pour obtenir des titres lentiviraux plus élevés pour l’infection par les CSEh et une sélection stable à l’aide de la puromycine. Les cellules sélectionnées par la puromycine ont été davantage élargies et des clones unicellulaires ont été obtenus à l’aide de la méthode de dilution limitée. Les clones uniques ont été développés, et plusieurs clones knock-out homozygotes pour le gène L2HGDH ont été obtenus, comme le confirme une réduction de 100 % de l’expression de L2HGDH à l’aide de l’analyse par transfert Western. De plus, à l’aide de la MSBSP-PCR, le site de mutation CRISPR a été cartographié en amont de la séquence de reconnaissance PAM de Cas9 dans les clones homozygotes sélectionnés. Un séquençage de Sanger a été effectué pour analyser les insertions/délétions exactes, et une caractérisation fonctionnelle des clones a été effectuée. Cette méthode a produit un pourcentage significativement plus élevé de délétions homozygotes par rapport aux méthodes d’administration de gènes non virales précédemment rapportées. Bien que ce rapport se concentre sur le gène L2HGDH, cette approche robuste et rentable peut être utilisée pour créer des knock-outs homozygotes pour d’autres gènes dans les cellules souches pluripotentes pour les études de fonction génique.

Introduction

Les cellules souches embryonnaires humaines (CSEh) et les cellules souches pluripotentes induites (CSPi) sont des cellules souches ayant le potentiel de se différencier en tous les types de cellules du corps. Ces cellules constituent des outils précieux pour l’étude du développement humain, ainsi que pour la compréhension des mécanismes sous-jacents de diverses maladies, offrant ainsi d’énormes promesses pour la médecine régénérative, la modélisation des maladies et la découverte de médicaments. De telles études consistent à étudier comment des gènes spécifiques contribuent au développement, au fonctionnement et à la régulation des organismes ^1,2.

Diverses techniques et approches sont employées pour déchiffrer la fonction des gènes, y compris la manipulation génétique, telle que l’inactivation ou la surexpression des gènes, et l’édition du génome. Parmi celles-ci, la technologie CRISPR-Cas9 s’est révélée être l’approche la plus efficace pour les études d’inactivation et d’édition de gènes ^1,2,3. Le système CRISPR-Cas9 fonctionne en utilisant une molécule d’ARN guide unique (ARNsg) spécialement conçue pour identifier et se lier à une séquence d’ADN d’intérêt particulière. Agissant comme un guide moléculaire, l’ARNsg dirige l’enzyme Cas9 vers l’emplacement précis du génome qui nécessite une modification. Une fois lié, Cas9 initie une cassure double brin de l’ADN au site désigné. Suite au clivage de l’ADN, les mécanismes de réparation inhérents à la cellule sont activés. Il s’agit notamment de deux voies de réparation principales : la jonction d’extrémité non homologue (NHEJ) et la réparation dirigée par homologie (HDR). La NHEJ entraîne souvent des insertions ou des délétions (indels) au site de la rupture, entraînant une perturbation ou une inactivation du gène. À l’inverse, la HDR permet l’insertion de nouvelles séquences d’ADN au site de rupture, facilitant ainsi l’introduction d’altérations génétiques ciblées⁴.

Compte tenu de l’importance des délétions de gènes dans les cellules souches pluripotentes, plusieurs protocoles ont été publiés sur les knock-outs de gènes médiés par CRISPR-Cas9 dans les CSEh/iPSC. Cependant, bon nombre de ces protocoles sont confrontés à des limitations importantes, telles que le fait qu’ils prennent beaucoup de temps, qu’ils nécessitent beaucoup de main-d’œuvre et qu’ils sont peu efficaces en raison de l’utilisation de méthodes d’administration de gènes non viraux⁵. Ces défis sont encore plus prononcés dans les CSEh/iPSC, car ces cellules sont connues pour avoir une efficacité d’édition inférieure à celle des autres types de cellules⁵. Certaines de ces limitations peuvent être résolues en augmentant l’efficacité de l’administration de plasmides contenant Cas9 et des ARNsg. Cela peut être réalisé avec succès en utilisant un système de vecteurs lentiviraux, ce qui peut améliorer considérablement les résultats de l’édition génomique. Les protocoles d’emballage des lentivirus sont bien établis et simples, ce qui permet une adoption facile dans les laboratoires, même par des chercheurs ayant une expérience limitée. Les lentivirus présentent une efficacité d’infection élevée dans divers types de cellules, y compris les CSEh et les CSPi. Par conséquent, l’utilisation d’un système lentiviral pour l’expression de Cas9-sgRNA est idéale pour les expériences d’édition de gènes de routine dans les hESCs/iPSCs pour les études de la fonction des gènes.

Ici, nous fournissons une méthode simple et directe pour des délétions de gènes basées sur CRISPR-Cas9 très efficaces dans les CSEh dans une durée comparativement plus courte que les protocoles conventionnels (Figure 1). Bien qu’un vecteur lentiviral avec une expression constitutive de Cas9 et d’ARNsg ait été utilisé, il pourrait facilement être remplacé par une expression de Cas9 induite par le médicament pour une expression contrôlable de Cas9.

Protocole

Les détails des séquences génétiques, des réactifs et de l’équipement utilisés dans cette étude sont répertoriés dans la table des matériaux.

1. Conception d’ARN guide unique (ARNsg), clonage et production de vecteurs lentiviraux

REMARQUE : Deux séquences différentes d’ARNsg ciblant l’exon 1 du gène L2HGDH , toutes deux adaptées de Qiu et ^al.6avec les sites PAM d’AGG et de TGG pour les séquences 1 et 2, respectivement, sont utilisées. Les deux ARNsg mesuraient 20 pb et les extrémités ont été modifiées pour ajouter des séquences de liaison pour l’enzyme de restriction Bsmb1 à cloner dans le vecteur cible (LentiCRISPRv2) comme décrit dans le rapport précédent⁶. Des séquences de liaison ont été ajoutées lors de la conception des ARNsg à des fins de clonage.

1. Le recuit a synthétisé chimiquement les ARNsg⁶ et les a clonés dans le vecteur lentiviral unique Bsmb1, LentiCRISPRv2, en utilisant le protocole optimisé précédemment rapporté⁷.
2. Procéder à l’emballage et à la concentration des lentiviraux à l’aide d’un protocole normalisé et optimisé⁷.
3. Pour la production de lentivirus, semer HEK293T cellules (1 × 10⁵ cellules/cm²) à l’aide de DMEM, de 10 % de FBS et d'1 x pénicilline/streptomycine (P/S) et incuber pendant la nuit dans un incubateur de culture tissulaire à 37 °C dans une atmosphère de 5 % de CO₂ dans des conditions humides.
4. Lorsqu’ils sont confluents à 90 %, les cellules HEK293T avec vecteur d’entrée (squelette vide ou plasmides exprimant l’ARNsg) et empaquetent les plasmides à l’aide d’un polymère cationique PEI à faible coût, comme décrit précédemment⁷.
5. Prélever le milieu conditionné contenant des particules de surnageant lentiviral (LVS) 48 h et 72 h après la transfection et procéder à l’ultracentrifugation à l’aide d’un coussin de saccharose et faire tourner les tubes à 1,25 000 x g pendant 2 h à 4 °C.
6. Procéder à la concentration de particules LVS à au moins 200 fois le volume d’origine en PBS, aliquote, et stocker à -80 °C jusqu’à l’utilisation.
7. Déterminez le titre des particules lentivirales à l’aide du kit qPCR Lentivirus Titer Kit en suivant les instructions du fabricant (voir le tableau des matériaux).

2. Infections lentivirales et propagation clonale unicellulaire

1. Pour les infections par des particules de LVS, amorcer une suspension cellulaire de CSEh (H9) contenant 1 × 10⁵ cellules/0,5 mL de milieu de culture CSEh (milieu basal + P/S + 10 μM d’inhibiteur de roche) sur des plaques de puits P24 revêtues de Matrigel (1:50) complètes dans 500 μL de milieu et incuber pendant la nuit pour permettre aux cellules de se fixer. Ensemencer des puits supplémentaires qui ne seraient pas infectés par l’EFV, mais traités avec de la puromycine pour servir de contrôle non infecté.
   REMARQUE : Le comptage des cellules peut être effectué à l’aide d’un hémocytomètre manuel ou d’un compteur de cellules automatisé.
2. Le lendemain, infecter les cellules à une multiplicité d’infection (MOI) de 10 avec 8 μg/mL de polybrène et incuber à 37 °C pendant 8 h, puis remplacer le milieu par un milieu hESC frais + P/S sans inhibiteur de roche et poursuivre la culture jusqu’à ce que les cellules soient confluentes à 90 %.
3. Commencer la sélection de la puromycine en complétant le milieu avec une concentration de 0,8 μg/mL de puromycine lorsque les cellules atteignent 90 % de confluence, ce qui est généralement de 48 à 72 heures après l’infection, et poursuivre la sélection jusqu’à ce que toutes les cellules meurent dans les cellules non infectées (groupe témoin).
4. Une fois la sélection terminée (généralement de 4 à 6 jours), divisez les cellules stables (1:4) et élargissez-les pour la cryoconservation et une analyse plus approfondie.
5. Effectuez une sélection unicellulaire et une expansion clonale à l’aide de cellules exprimant L2HGDH-sgRNA-1⁶.
6. À cette fin, préparer une suspension cellulaire équivalente à 500 cellules/10 mL de milieu de croissance complet et semer 100 μL de cette suspension dans chaque puits d’une plaque à 96 puits.
7. Laissez les cellules tranquilles pendant 3 jours, puis observez.
8. Marquez les puits qui produisent des clones uniques et changez le milieu tous les deux jours jusqu’à ce qu’une taille suffisante soit atteinte pour que les colonies (généralement 2 semaines) puissent s’étendre davantage, cryoconserver et analyser.

3. Extraction d’ADNg, PCR MS-BSP et séquençage de Sanger

1. Isolez l’ADNg des cellules à l’aide du kit d’isolement de l’ADN génomique en suivant les instructions du fabricant (voir le tableau des matériaux).
2. Procéder à la cartographie des sites de mutation en amont des séquences de reconnaissance PAM à l’aide de l’analyse MS-BSP (Mutation Sites Based Specific Amorers)⁸.
3. Pour cela, une amorce droite non biaisée L2H-UMSBSP-R1 est conçue pour amplifier la région à l’extérieur de l’Exon1 afin d’amplifier toutes les cibles.
4. Concevoir une amorce gauche biaisée L2H-BMSBSP-F1 avec une séquence identique à l’ARNsg pour amplifier la séquence cible à proximité des séquences de reconnaissance PAM.
   REMARQUE : Dans des conditions très strictes de PCR, le produit sera observé sur le gel dans des clones non mutés. Aucun produit ne serait observé dans les clones knock-out CRISPR présentant des mutations proches de l’amont des séquences de reconnaissance PAM.
5. Afin de cartographier les mutations à une paire de bases, la PCR amplifie une séquence de 468 pb couvrant l’ensemble de l’exon 1 de L2HGDH et soumise à un séquençage de Sanger suivi d’une analyse d’alignement de séquences multiples à l’aide de clustalw⁸.

4. Essai de différenciation des CSEh et de formation de corps embryoïdes (EB)

1. Procéder à la différenciation dirigée du contrôle et des différents clones CRISPR des CSEh (H9) vers le devenir du neuro-ectoderme en suivant les protocoles établis décrits précédemment en utilisant la méthode d’inhibition double SMAD ^9,10,11.
2. Lorsque la confluence est de 90 %, traiter les cellules avec du LDN193189 (200 nM) et du SB431542 (10 μM) pendant 24 h initiales dans un milieu à 100 % KSR, suivi de l’ajout de XAV939 (2 μM) pendant 2 jours supplémentaires.
3. Après 3 jours, réduire le pourcentage de milieu KSR (Knockout DMEM complété par 15 % (v/v) de KSR, 1 % (v/v) de L-glutamine, 1 % (v/v) P/S, 1 % (v/v) 10 mM MEM et 0,1 % (v/v) de 2-mercaptoéthanol (75 %, 50 %, 25 %) en l’associant à des milieux N2 (DMEM/F12 complété par 1 supplément de N2, 1 x P/S, ) sur 100 % de milieux N2 sur une période de 8 jours.
4. Au début du jour 12, fixez les cellules pour l’immunomarquage en utilisant PAX6 comme marqueur neuro-ectodermique.
5. Pour les études de détermination du devenir du mésoderme et de l’endoderme, utiliser une approche basée sur le CHIR99021 des petites molécules décrite dans des publications précédentes^12,13.
6. Pour cela, lorsque les cellules atteignent 70 % de confluence, traiter avec 3 μM de CHIR99021 dans un milieu endodermique définitif (DE) pendant 24 h, suivi d’une fixation pour immunocoloration en utilisant Brachuary comme marqueur spécifique du mésoderme.
7. Pour le stade endodermique, cultiver les cellules pendant 24 heures supplémentaires dans un milieu DE seul sans ajout de CHIR99021 avant de fixer pour l’immunocoloration à l’aide de FOXA2.
8. Pour le test de formation d’EB, ensemencez les cellules sur des surfaces cellulaires à faible attachement sans utiliser Matrigel pour cultiver des cellules en suspension pendant 24 heures avant de prendre des micrographies.

5. Analyse par transfert Western

1. Laver les cellules deux fois à l’aide de PBS et lyser à l’aide de 1 tampon RIPA contenant 1 % de SDS et 1 cocktail d’inhibiteurs de protéase et de phosphatase.
2. Éliminer les lysats par centrifugation à 16 000 x g pendant 10 min à 4 °C, puis collecte des surnageants.
3. Quantifier la protéine cellulaire totale à l’aide de la trousse de dosage des protéines BCA en suivant les instructions du fabricant. Ajustez les échantillons à 2 μg/μL à l’aide d’un tampon de colorant de chargement de 4×.
4. Dénaturer les échantillons de protéines à 70 °C pendant 10 min, charger des quantités égales de chaque échantillon et résoudre à l’aide de gels SDS-PAGE⁷ à gradient de 4 % à 12 %, puis les transférer sur une membrane PVDF à une tension constante de 100 V pendant 1 h à 4 °C.
5. Bloquez les membranes à l’aide de lait écrémé à 5 % et incubez dans des dilutions d’anticorps primaires à 4 °C pendant la nuit avec rotation.
6. Ensuite, lavez les membranes 5 fois à l’aide d’un tampon PBST et incubez dans des anticorps secondaires appropriés conjugués à la HRP pendant 1 h à température ambiante.
7. Lavez à nouveau les membranes avec du PBST 5x, incubez avec un substrat chimiluminescent et développez-les à l’aide de films à rayons X.

6. Immunocoloration

1. Ensemencez les cellules sur des plaques de puits P4 et incubez pendant au moins 24 h avant la fixation pour permettre une bonne fixation des cellules aux surfaces.
2. Lavez les cellules 3 fois avec du PBS pour éliminer les cellules mortes ainsi que les composants du milieu, puis fixez-les avec 4 % de PFA pendant 15 min à température ambiante.
3. Perméabiliser les cellules en utilisant 0,3 % de triton X-100, suivi d’un blocage pour la liaison non spécifique en utilisant 2 % de BSA dans du PBS pendant 1 h à température ambiante.
4. Incuber les échantillons avec des anticorps primaires (OCT4, NANOG, SOX2, KI67, PAX6, Brachuary, FOXA2) dilués dans 1 % de BSA pendant une nuit à 4 °C.
5. Laver les cellules 3 fois avec du PBS et incuber avec des anticorps secondaires appropriés (Chèvre anti-souris 488, Chèvre anti-lapin 488, Chèvre anti-souris 546, Chèvre anti-lapin 546) dilués dans 1 % de BSA pendant 1 h à température ambiante.
6. Enfin, lavez les échantillons avec du PBS 3x et contre-colorez-les avec du DAPI et imagez à l’aide d’un microscope à fluorescence.

Résultats

Clonage d’ARNsg L2HGDH dans lentiCRISPRv2 puro
Le vecteur puro lentiCRISPRv2 a été obtenu commercialement (voir la table des matériaux) et digéré avec BsmB1, ce qui a entraîné la libération d’un fragment de bourreau de 1,8 Ko. Comme le montre la figure 2A, une digestion complète du vecteur a été observée. Pour chaque construction, six clones ont été criblés pour la présence ou l’absence d’insert en...

Discussion

Cette étude a normalisé une méthode qui permet des délétions de gènes très efficaces et rentables dans les CSEh grâce à la technologie CRISPR-Cas9. Cette méthode a permis d’obtenir une délétion homozygote du gène L2HGDH dans les CSEh en 3 à 4 semaines, de l’infection par CSEh à la sélection clonale et à la propagation sur cellule unique (Tableau 1). Bien que les manipulations de gènes médiées par CRISPR-Cas9 puissent être réalisées par des tran...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
2-MERCAPTOETHANOL	Invitrogen	31350010
38.5 mL, Sterile + Certified Free Open-Top Thinwall Ultra-Clear Tubes	Beckman Coulter	C14292
Accutase	Stem cell technologies	7920
bFGF Recombinant human	Invitrogen	PHG0261
Brachyury Rabbit mAb	Abclonal	A5078
BsmBI-v2	NEB	R0739S
chir99021	Tocris	4423/10
Corning Matrigel Basement Membrane Matrix, LDEV-free	Corning	354234
Cyclopamine	Stem cell technologies	72074
DMEM media	Invitrogen	11995073
DMEM NUTRIENT MIX F12	Invitrogen	11320033
DPBS w/o: Ca and Mg	PAN Biotech	P04-36500
Fetal bovie serum	Invitrogen	10270106
FoxA2/HNF3β	CST	8186
GAPDH (14C10) Rabbit mAb Antibody	CST	2118S
Gentle Cell Dissociation Reagent	Stem cell technologies	7174
HyClone Non Essential Amino Acids (NEAA) 100x Solution	GE healthcare	SH30238.01
Ki-67 (D3B5) Rabbit mAb	CST	9129
KnockOut Serum Replacement	Invitrogen	10828028
L GLUTAMINE, 100x	Invitrogen	2924190090
L2H-BMSBSP-F1	Macrogen		CGTGCGGGTTCGCGTCTGGG
L2HGDH Polyclonal antibody	Proteintech	15707-1-AP
L2HGDH-SgRNA1-F	Macrogen		CACCGCGTGCGG GTTCGCGTCTGGG
L2HGDH-SgRNA1-R	Macrogen		AAACCCCAGACGC GAACCCGCACGC
L2HGDH-SgRNA2-F	Macrogen		CACCGCCCGCGG GCTTTTCGCCGG
L2HGDH-SgRNA2-R	Macrogen		AAACCCGGCGAA AAGCCCGCGGGC
L2H-SeqF1	Macrogen		GCTAAAGAGCGC GGGTCCTCGG
L2H-SeqR1	Macrogen		GTGGACGGGTTG TTCAAAGCCAGAG
L2H-UMSBSP-R1	Macrogen		GTGGACGGGTTG TTCAAAGCCAGAG
LentiCRISPRv2	Addgene	52961
mTesR1 complete media	Stem cell technologies	85850
Nanog Antibody	CST	3580
NEUROBASAL MEDIUM 1x CTS	Invitrogen	A1371201
Neuropan 2 Supplement 100x	PAN Biotech	P07-11050
Neuropan 27 Supplement 50x	PAN Biotech	P07-07200
Oct-4 Antibody	CST	2750
Pax6 (D3A9V) XP Rabbit mAb	CST	60433
PENICILLIN STREPTOMYCIN SOL	Invitrogen	15140122
pMD2.G	Addgene	12259
Polybrene infection reagent	Sigma	TR1003- G
Polyethylenimine, branched	Sigma	408727
psPAX2.0	Addgene	12260
Puromycin	Invitrogen	A1113802
qPCR Lentivirus Titer Kit	Abm	LV900
Rock inhibitor Y-27632 dihydrochloride	Tocris	1254
SB 431542	Tocris	1614/10
Sox2 Antibody	CST	2748
Sucrose	Sigma	57-50-1
TRYPSIN .05% EDTA	Invitrogen	25300062
U6-459F	Macrogen		GAGGGCCTATT TCCCATGATTC
Wizard Genomic DNA Purification Kit	Promega	A1120
XAV 939	Tocris	3748/10