CRISPR-Cas9 опосредует делецию генов в плюрипотентных стволовых клетках человека, культивируемых в условиях отсутствия фидеров

Резюме

Представленный метод описывает генерацию CRISPR-опосредованного нокаута гена в линии H9 эмбриональных стволовых клеток человека (hESC), которая стабильно экспрессирует sgРНК, нацеленные на ген L2HGDH, с помощью высокоэффективной лентивирально-опосредованной системы доставки генов.

Аннотация

Система редактирования генома CRISPR-Cas9 произвела революцию в исследованиях функций генов в клетках млекопитающих, включая стволовые клетки. Тем не менее, практическое применение этого метода, особенно в плюрипотентных стволовых клетках, сопряжено с определенными проблемами, такими как трудоемкость и времяпреемственность, а также низкая эффективность редактирования. В данной работе мы описываем генерацию CRISPR-опосредованного нокаута гена в линии эмбриональных стволовых клеток человека (hESC), стабильно экспрессирующих sgРНК для гена L2HGDH, с использованием высокоэффективной и стабильной лентивирально-опосредованной системы доставки генов. ГРНК, нацеленные на экзон 1 гена L2HGDH, были химически синтезированы и клонированы в вектор lentiCRISPR v2-puro, который сочетает конститутивную экспрессию sgРНК с Cas9 в высокоэффективной одновекторной системе для достижения более высоких титров лентивирусов для инфекции hESC и стабильной селекции с использованием пуромицина. Клетки, отобранные пуромицином, были дополнительно расширены, а одноклеточные клоны были получены с использованием метода ограниченного разведения. Одиночные клоны были расширены, и было получено несколько гомозиготных нокаутных клонов гена L2HGDH, что подтверждено 100% снижением экспрессии L2HGDH с помощью вестерн-блоттинга. Кроме того, с помощью MSBSP-ПЦР сайт мутации CRISPR был картирован перед последовательностью узнавания PAM Cas9 в выбранных гомозиготных клонах. Для анализа точных вставок/делеций было проведено секвенирование по Сэнгеру, а также проведена функциональная характеристика клонов. Этот метод дал значительно более высокий процент гомозиготных делеций по сравнению с ранее известными невирусными методами доставки генов. Несмотря на то, что в этом отчете основное внимание уделяется гену L2HGDH, этот надежный и экономически эффективный подход может быть использован для создания гомозиготных нокаутов для других генов в плюрипотентных стволовых клетках для исследований функции генов.

Введение

Человеческие эмбриональные стволовые клетки (hESCs) и индуцированные плюрипотентные стволовые клетки (iPSCs) являются стволовыми клетками, обладающими потенциалом к дифференцировке во все типы клеток организма. Эти клетки служат ценными инструментами для изучения развития человека, а также для понимания основных механизмов различных заболеваний, тем самым открывая огромные перспективы для регенеративной медицины, моделирования болезней и открытия лекарств. Такие исследования включают изучение того, как конкретные гены способствуют развитию, функционированию и регуляции организмов ^1,2.

Для расшифровки функции генов используются различные методы и подходы, включая генетические манипуляции, такие как нокаут или сверхэкспрессия генов, а также редактирование генома. Среди них технология CRISPR-Cas9 оказалась наиболее эффективным подходом к исследованиям нокаута генов и редактирования генов ^1,2,3. Система CRISPR-Cas9 работает с использованием одной молекулы направляющей РНК (sgRNA), специально разработанной для идентификации и связывания с определенной последовательностью ДНК, представляющей интерес. Действуя как молекулярный проводник, sgRNA направляет фермент Cas9 к точному месту в геноме, которое требует модификации. После связывания Cas9 инициирует двухцепочечный разрыв в ДНК в указанном месте. После расщепления ДНК активируются внутренние механизмы восстановления клетки. К ним относятся два основных пути репарации: негомологичное соединение концов (NHEJ) и гомологически направленное репарирование (HDR). NHEJ часто приводит к вставке или делеции (инделам) в месте разрыва, что приводит к нарушению или инактивации генов. С другой стороны, HDR позволяет вставлять новые последовательности ДНК в место разрыва, способствуя внедрению целевых генетических изменений⁴.

Учитывая важность делеций генов в плюрипотентных стволовых клетках, было опубликовано несколько протоколов по CRISPR-Cas9-опосредованным нокаутам генов в hESCs/iPSCs. Тем не менее, многие из этих протоколов сталкиваются со значительными ограничениями, такими как чрезвычайно трудоемкие и неэффективные протоколы из-за использования невирусных^{методов доставки} генов. Эти проблемы еще более выражены у hESCs/iPSCs, поскольку известно, что эти клетки имеют более низкую эффективность редактирования по сравнению с другими типами клеток⁵. Некоторые из этих ограничений могут быть устранены путем повышения эффективности доставки плазмид, содержащих Cas9 и sgРНК. Это может быть успешно достигнуто с помощью лентивирусной векторной системы, которая может значительно улучшить результаты редактирования генов. Протоколы упаковки лентивирусов хорошо зарекомендовали себя и просты, что позволяет легко применять их в лабораториях даже исследователям с ограниченным опытом. Лентивирусы демонстрируют высокую инфекционную эффективность в различных типах клеток, включая hESCs и iPSCs. Таким образом, использование лентивирусной системы для экспрессии Cas9-sgРНК идеально подходит для рутинных экспериментов по редактированию генов в hESCs/iPSCs для изучения функции генов.

Здесь мы предлагаем простой и понятный метод высокоэффективного делеции генов на основе CRISPR-Cas9 в hESCs за сравнительно более короткий промежуток времени, чем при использовании обычных протоколов (рис. 1). Несмотря на то, что был использован лентивирусный вектор с конститутивной экспрессией Cas9 и sgRNA, его можно легко заменить на индуцируемую лекарственными препаратами экспрессию Cas9 для контролируемой экспрессии Cas9.

протокол

Подробная информация о последовательностях генов, реагентах и оборудовании, использованных в этом исследовании, приведена в Таблице материалов.

1. Проектирование одной направляющей РНК (sgRNA), клонирование и производство лентивирусного вектора

Примечание: Используются две различные последовательности sgРНК, нацеленные на экзон 1 гена L2HGDH , обе адаптированные от Qiu et ^al.6с сайтами PAM AGG и TGG для последовательностей 1 и 2 соответственно. Обе гРНК имели длину 20.н., и концы были модифицированы для добавления линкерных последовательностей для фермента рестрикции Bsmb1, который должен быть клонирован в векторе-мишени (LentiCRISPRv2), как описано в предыдущем отчете⁶. Линкерные последовательности были добавлены в ходе проектирования sgРНК для целей клонирования.

1. Отжиг химически синтезировал sgРНК⁶ и клонировал в односрезной лентивирусный вектор Bsmb1, LentiCRISPRv2, используя оптимизированный протокол,^{как сообщалось ранее} 7.
2. Приступайте к упаковке и концентрированию лентивируса с использованием стандартизированного и оптимизированного протокола⁷.
3. Для получения лентивируса семена HEK293T клетки (1 × 10⁵ клеток/^см2) с использованием DMEM, 10% FBS и 1x пенициллин/стрептомицин (P/S) и инкубируют в течение ночи в инкубаторе для тканевых культур при 37 °C в атмосфере 5%_CO2 во влажных условиях.
4. При слиянии на 90% со-трансфектируйте HEK293T клетки с входным вектором (пустой остов или плазмидами, экспрессирующими sgРНК) и упаковывайте плазмиды с использованием недорогого катионного полимера PEI, как описано ранее⁷.
5. Соберите кондиционированную среду, содержащую частицы лентивирусной надосадочной жидкости (ЛЖ), через 48 ч и 72 ч после трансфекции и проведите ультрацентрифугирование с использованием сахарозной подушки и вращайте пробирки при давлении 1,25,000 х г в течение 2 ч при 4°С.
6. Продолжайте использовать концентрацию частиц LVS по крайней мере в 200 раз выше исходного объема в PBS, аликвоте, и хранить при температуре -80 °C до использования.
7. Определите титр лентивирусных частиц с помощью набора для титров лентивирусов для количественной ПЦР, следуя инструкциям производителя (см. Таблицу материалов).

2. Лентивирусные инфекции и одноклеточное клональное размножение

1. При инфекциях, вызванных частицами ЛЖ, суспензию клеток hESC (H9) семян с 1 ×^{10 5} клеток/0,5 мл питательных сред hESC (базальная среда + P/S + 10 мкМ ингибитора породы) на полном Матригеле (1:50) покрывают луночные планшеты P24 в 500 мкл среды и инкубируют в течение ночи, чтобы дать возможность клеткам прикрепиться. Засейте дополнительные лунки, которые не будут заражены LVS, но обработаны пуромицином, чтобы они служили неинфицированным контролем.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Подсчет клеток может быть выполнен с помощью ручного гемоцитометра или автоматического счетчика клеток.
2. На следующий день инфицируйте клетки при кратности инфекции (MOI) 10 вместе с 8 мкг/мл полибрена и инкубируйте при 37 °C в течение 8 ч с последующей заменой среды на свежую среду hESC + P/S без ингибитора горных пород и продолжайте культивирование до тех пор, пока клетки не станут слитыми на 90%.
3. Начните отбор пуромицина, добавив в среду 0,8 мкг/мл пуромицина, когда клетки достигнут 90% конфлюенции, что обычно происходит через 48-72 ч после заражения, и продолжайте отбор до тех пор, пока все клетки не погибнут в неинфицированных клетках (контрольная группа).
4. После завершения отбора (обычно 4-6 дней) разделяют стабильные клетки (1:4) и расширяют для криоконсервации и дальнейшего анализа.
5. Выполнение селекции одиночных клеток и клональной экспансии с использованием клеток, экспрессирующих L2HGDH-sgRNA-1⁶.
6. Для этой цели готовят клеточную суспензию, эквивалентную 500 клеток/10 мл полной питательной среды, и засевают 100 мкл этой суспензии в каждую лунку 96-луночного планшета.
7. Оставьте клетки в покое на 3 дня, а затем наблюдайте.
8. Отметьте лунки, в которых получаются одиночные клоны, и меняйте среду через день до тех пор, пока не будет достигнут достаточный размер для дальнейшего расширения колоний (обычно 2 недели) для дальнейшего расширения, криоконсервации и анализа.

3. Экстракция гДНК, ПЦР MS-BSP и секвенирование по Сэнгеру

1. Выделите гДНК из клеток с помощью набора для выделения геномной ДНК в соответствии с инструкциями производителя (см. Таблицу материалов).
2. Продолжите картирование сайтов мутаций перед последовательностями узнавания PAM с использованием анализа специфических праймеров на основе сайтов мутаций (MS-BSP)⁸.
3. Для этого предназначен несмещенный правый праймер L2H-UMSBSP-R1, который амплифицирует область за пределами экзона1 для усиления любых мишеней.
4. Разработать смещенный левый праймер L2H-BMSBSP-F1 с идентичной последовательности sgРНК для амплификации последовательности-мишени, близкой к последовательностям узнавания PAM.
   ПРИМЕЧАНИЕ: При очень высоких строгих условиях ПЦР продукт будет наблюдаться на геле в немутировавших клонах. В клонах с нокаутом CRISPR не будет наблюдаться никакого продукта, демонстрирующего мутации, близкие к предшествующим последовательностям узнавания PAM.
5. Чтобы картировать мутации одной пары оснований, ПЦР амплифицируют последовательность 468.о., охватывающую весь экзон 1 L2HGDH и подвергающуюся секвенированию по Сэнгеру с последующим анализом множественного выравнивания последовательностей с использованием clustalw⁸.

4. Анализ hESC-дифференцировки и образования эмбриоидных тел (БЭ)

1. Продолжайте направленную дифференцировку контрольных и различных клонов CRISPR hESCs (H9) в направлении нейроэктодермы в соответствии с установленными протоколами, как описано ранее, с использованием метода двойного ингибирования smad ^9,10,11.
2. При 90% конфлюенции обрабатывайте клетки LDN193189 (200 нМ) и SB431542 (10 мкМ) в течение первых 24 ч в 100% среде KSR с последующим добавлением XAV939 (2 мкМ) в течение дополнительных 2 дней.
3. Через 3 дня уменьшите процентное содержание сред KSR (Knockout DMEM с добавлением 15% (v/v) KSR, 1% (v/v) L-глутамина, 1% (v/v) P/S, 1% (v/v) 10 mM MEM и 0,1% (v/v) 2-меркаптоэтанола (75%, 50%, 25%) в сочетании с N2 средами (DMEM/F12 с добавлением 1x N2 добавки, 1x P/S, ) до 100% носителей N2 в течение 8 дней.
4. В начале 12-го дня зафиксируйте клетки для иммуноокрашивания, используя PAX6 в качестве маркера нейроэктодермы.
5. Для исследований определения мезодермы и эндодермальной судьбы используйте подход, основанный на малых молекулах CHIR99021, описанный в предыдущих публикациях^12,13.
6. Для этого, когда клетки достигают 70% конфлюенции, обрабатывают 3 мкМ CHIR99021 в среде Definitive Endoderm (DE) в течение 24 ч с последующей фиксацией для иммуноокрашивания с использованием Brachuary в качестве мезодерм-специфичного маркера.
7. Для эндодермальной стадии культивируют клетки в течение дополнительных 24 ч только в среде ДЭ без добавления CHIR99021 перед фиксацией для иммуноокрашивания с помощью FOXA2.
8. Для анализа образования БЭ посев клеток на клеточных поверхностях с низким прикреплением без использования Матригеля для культивирования клеток в условиях суспензии в течение 24 ч перед получением микрофотографий.

5. Вестерн-блоттинг

1. Дважды промойте клетки с помощью PBS и лизиса с использованием 1x буфера RIPA, содержащего 1% SDS и 1x коктейля из протеазы и ингибитора фосфатазы.
2. Очистите лизаты центрифугированием при 16 000 x g в течение 10 минут при 4 °C с последующим сбором надосадочной жидкости.
3. Количественное определение общего клеточного белка с помощью набора для анализа белка BCA в соответствии с инструкциями производителя. Отрегулируйте образцы до 2 мкг/мкл с помощью буфера для образцов с загрузкой 4× красителя.
4. Денатурируйте образцы белка при 70 °C в течение 10 мин, загрузите равное количество каждого образца и растворите с помощью гелей SDS-PAGE⁷ с градиентом 4%-12% с последующим переносом на мембрану PVDF при постоянном напряжении 100 В в течение 1 ч при 4 °C.
5. Заблокируйте мембраны с помощью 5% обезжиренного молока и инкубируйте в первичных разведениях антител при 4 °C в течение ночи с вращением.
6. Затем промывайте мембраны 5 раз с помощью PBST буфера и инкубируйте в HRP-конъюгированных соответствующих вторичных антителах в течение 1 ч при комнатной температуре.
7. Мембраны снова промойте PBST 5x, инкубируйте с хемилюминесцентным субстратом и проявите с помощью рентгеновских пленок.

6. Иммуноокрашивание

1. Засейте клетки на луночных планшетах P4 и инкубируйте не менее 24 ч перед фиксацией, чтобы обеспечить правильное прикрепление клеток к поверхностям.
2. Промойте клетки 3 раза PBS, чтобы удалить все омертвевшие клетки, а также компоненты среды, с последующей фиксацией с помощью 4% PFA в течение 15 минут при комнатной температуре.
3. Пермеабилизируйте клетки с помощью 0,3% тритона X-100 с последующим блокированием для неспецифического связывания с использованием 2% BSA в PBS в течение 1 ч при комнатной температуре.
4. Инкубируют образцы с первичными антителами (OCT4, NANOG, SOX2, KI67, PAX6, Brachuary, FOXA2), разведенными в 1% BSA, в течение ночи при 4 °C.
5. Промойте клетки 3 раза PBS и инкубируйте с соответствующими вторичными антителами (Козий против мыши 488, Козий против кролика 488, Козий против мыши 546, Козий против кролика 546), разведенными в 1% БСА в течение 1 ч при комнатной температуре.
6. Наконец, промойте образцы PBS 3x и закрасьте их DAPI и получите изображение с помощью флуоресцентного микроскопа.

Результаты

Клонирование sgРНК L2HGDH в lentiCRISPRv2 puro
Вектор lentiCRISPRv2 puro был коммерчески получен (см. Таблицу материалов) и расщеплен с BsmB1, в результате чего был выделен фрагмент наполнителя размером 1,8 Кб. Как показано на рисунке 2А, наблюдалось полное п...

Обсуждение

В этом исследовании был стандартизирован метод, который позволяет проводить высокоэффективные и экономичные делеции генов в ЭСК с помощью технологии CRISPR-Cas9. С помощью этого метода была успешно достигнута гомозиготная делеция гена L2HGDH в ЭСК в течение 3-4 недель, начина...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
2-MERCAPTOETHANOL	Invitrogen	31350010
38.5 mL, Sterile + Certified Free Open-Top Thinwall Ultra-Clear Tubes	Beckman Coulter	C14292
Accutase	Stem cell technologies	7920
bFGF Recombinant human	Invitrogen	PHG0261
Brachyury Rabbit mAb	Abclonal	A5078
BsmBI-v2	NEB	R0739S
chir99021	Tocris	4423/10
Corning Matrigel Basement Membrane Matrix, LDEV-free	Corning	354234
Cyclopamine	Stem cell technologies	72074
DMEM media	Invitrogen	11995073
DMEM NUTRIENT MIX F12	Invitrogen	11320033
DPBS w/o: Ca and Mg	PAN Biotech	P04-36500
Fetal bovie serum	Invitrogen	10270106
FoxA2/HNF3β	CST	8186
GAPDH (14C10) Rabbit mAb Antibody	CST	2118S
Gentle Cell Dissociation Reagent	Stem cell technologies	7174
HyClone Non Essential Amino Acids (NEAA) 100x Solution	GE healthcare	SH30238.01
Ki-67 (D3B5) Rabbit mAb	CST	9129
KnockOut Serum Replacement	Invitrogen	10828028
L GLUTAMINE, 100x	Invitrogen	2924190090
L2H-BMSBSP-F1	Macrogen		CGTGCGGGTTCGCGTCTGGG
L2HGDH Polyclonal antibody	Proteintech	15707-1-AP
L2HGDH-SgRNA1-F	Macrogen		CACCGCGTGCGG GTTCGCGTCTGGG
L2HGDH-SgRNA1-R	Macrogen		AAACCCCAGACGC GAACCCGCACGC
L2HGDH-SgRNA2-F	Macrogen		CACCGCCCGCGG GCTTTTCGCCGG
L2HGDH-SgRNA2-R	Macrogen		AAACCCGGCGAA AAGCCCGCGGGC
L2H-SeqF1	Macrogen		GCTAAAGAGCGC GGGTCCTCGG
L2H-SeqR1	Macrogen		GTGGACGGGTTG TTCAAAGCCAGAG
L2H-UMSBSP-R1	Macrogen		GTGGACGGGTTG TTCAAAGCCAGAG
LentiCRISPRv2	Addgene	52961
mTesR1 complete media	Stem cell technologies	85850
Nanog Antibody	CST	3580
NEUROBASAL MEDIUM 1x CTS	Invitrogen	A1371201
Neuropan 2 Supplement 100x	PAN Biotech	P07-11050
Neuropan 27 Supplement 50x	PAN Biotech	P07-07200
Oct-4 Antibody	CST	2750
Pax6 (D3A9V) XP Rabbit mAb	CST	60433
PENICILLIN STREPTOMYCIN SOL	Invitrogen	15140122
pMD2.G	Addgene	12259
Polybrene infection reagent	Sigma	TR1003- G
Polyethylenimine, branched	Sigma	408727
psPAX2.0	Addgene	12260
Puromycin	Invitrogen	A1113802
qPCR Lentivirus Titer Kit	Abm	LV900
Rock inhibitor Y-27632 dihydrochloride	Tocris	1254
SB 431542	Tocris	1614/10
Sox2 Antibody	CST	2748
Sucrose	Sigma	57-50-1
TRYPSIN .05% EDTA	Invitrogen	25300062
U6-459F	Macrogen		GAGGGCCTATT TCCCATGATTC
Wizard Genomic DNA Purification Kit	Promega	A1120
XAV 939	Tocris	3748/10