Deleción génica mediada por CRISPR-Cas9 en células madre pluripotentes humanas cultivadas en condiciones libres de alimentadores

Resumen

El método presentado describe la generación de un knockout génico mediado por CRISPR en la línea H9 de células madre embrionarias humanas (hESC), que expresa de manera estable sgRNAs dirigidos al gen L2HGDH utilizando un sistema de entrega de genes mediado por lentivirales altamente eficiente.

Resumen

El sistema CRISPR-Cas9 para la edición del genoma ha revolucionado los estudios de la función génica en células de mamíferos, incluidas las células madre. Sin embargo, la aplicación práctica de esta técnica, particularmente en células madre pluripotentes, presenta ciertos desafíos, como ser intensivo en tiempo y mano de obra y tener una baja eficiencia de edición. Aquí, describimos la generación de un knockout génico mediado por CRISPR en una línea de células madre embrionarias humanas (hESC) que expresa de manera estable sgRNAs para el gen L2HGDH, utilizando un sistema de entrega de genes mediado por lentivirales altamente eficiente y estable. Los sgRNAs dirigidos al exón 1 del gen L2HGDH se sintetizaron químicamente y se clonaron en el vector lentiCRISPR v2-puro, que combina la expresión constitutiva de sgRNAs con Cas9 en un sistema de vector único altamente eficiente para lograr títulos lentivirales más altos para la infección por hESC y una selección estable utilizando puromicina. Las células seleccionadas con puromicina se expandieron aún más y se obtuvieron clones de células individuales utilizando el método de dilución limitada. Los clones individuales se expandieron y se obtuvieron varios clones homocigotos knockout para el gen L2HGDH, como lo confirmó una reducción del 100% en la expresión de L2HGDH mediante el análisis de Western blot. Además, mediante MSBSP-PCR, se mapeó el sitio de mutación de CRISPR aguas arriba de la secuencia de reconocimiento de PAM de Cas9 en los clones homocigotos seleccionados. Se realizó la secuenciación Sanger para analizar las inserciones/deleciones exactas, y se realizó la caracterización funcional de los clones. Este método produjo un porcentaje significativamente mayor de deleciones homocigóticas en comparación con los métodos de administración de genes no virales informados anteriormente. Aunque este informe se centra en el gen L2HGDH, este enfoque sólido y rentable se puede utilizar para crear knockouts homocigotos para otros genes en células madre pluripotentes para estudios de función génica.

Introducción

Las células madre embrionarias humanas (hESCs) y las células madre pluripotentes inducidas (iPSCs) son células madre con el potencial de diferenciarse en todos los tipos de células del cuerpo. Estas células sirven como herramientas valiosas para estudiar el desarrollo humano, así como para comprender los mecanismos subyacentes de diversas enfermedades, lo que ofrece una gran promesa para la medicina regenerativa, el modelado de enfermedades y el descubrimiento de fármacos. Dichos estudios implican investigar cómo genes específicos contribuyen al desarrollo, funcionamiento y regulación de los organismos ^1,2.

Se emplean varias técnicas y enfoques para descifrar la función de los genes, incluida la manipulación genética, como la eliminación o sobreexpresión de genes, y la edición del genoma. Entre ellas, la tecnología CRISPR-Cas9 se ha convertido en el enfoque más eficiente para los estudios de knockout y edición de genes ^1,2,3. El sistema CRISPR-Cas9 funciona utilizando una sola molécula de ARN guía (sgRNA) diseñada específicamente para identificar y unirse a una secuencia de ADN particular de interés. Actuando como una guía molecular, el sgRNA dirige la enzima Cas9 a la ubicación precisa en el genoma que requiere modificación. Una vez unido, Cas9 inicia una ruptura de doble cadena en el ADN en el sitio designado. Tras la escisión del ADN, se activan los mecanismos de reparación inherentes a la célula. Estos incluyen dos vías de reparación principales: la unión de extremos no homólogos (NHEJ) y la reparación dirigida por homología (HDR). La NHEJ a menudo da lugar a inserciones o deleciones (indels) en el sitio de ruptura, lo que conduce a la interrupción o inactivación de genes. Por el contrario, el HDR permite la inserción de nuevas secuencias de ADN en el lugar de la ruptura, lo que facilita la introducción de alteraciones genéticas específicas⁴.

Dada la importancia de las deleciones génicas en las células madre pluripotentes, se han publicado varios protocolos sobre los knockouts génicos mediados por CRISPR-Cas9 en hESCs/iPSCs. Sin embargo, muchos de estos protocolos se enfrentan a limitaciones significativas, como ser extremadamente lentos, laboriosos y tener una baja eficiencia debido al uso de métodos de administración de genes no virales⁵. Estos desafíos son aún más pronunciados en las hESCs/iPSCs, ya que se sabe que estas células tienen una menor eficiencia de edición en comparación con otros tipos de células⁵. Algunas de estas limitaciones se pueden abordar aumentando la eficiencia de la entrega de plásmidos que contienen Cas9 y sgRNA. Esto se puede lograr con éxito utilizando un sistema de vectores lentivirales, que puede mejorar significativamente los resultados de la edición de genes. Los protocolos de empaquetado de lentivirus están bien establecidos y son sencillos, lo que permite una fácil adopción en los laboratorios, incluso por parte de investigadores con experiencia limitada. Los lentivirus exhiben una alta eficiencia de infección en varios tipos de células, incluidas las hESC y las iPSC. Por lo tanto, el uso de un sistema lentiviral para la expresión de Cas9-sgRNA es ideal para experimentos rutinarios de edición de genes en hESCs/iPSCs para estudios de función génica.

Aquí, proporcionamos un método simple y directo para deleciones de genes basadas en CRISPR-Cas9 altamente eficientes en hESC en una duración de tiempo comparativamente más corta que los protocolos convencionales (Figura 1). Aunque se ha utilizado un vector lentiviral con expresión constitutiva de Cas9 y sgRNA, podría reemplazarse fácilmente con la expresión de Cas9 inducible por fármacos para una expresión de Cas9 controlable.

Protocolo

Los detalles de las secuencias de genes, los reactivos y el equipo utilizados en este estudio se enumeran en la Tabla de Materiales.

1. Diseño de ARN guía única (sgRNA), clonación y producción de vectores lentivirales

NOTA: Se utilizan dos secuencias diferentes de sgRNA dirigidas al exón 1 del gen L2HGDH , ambas adaptadas de Qiu et ^al.6con sitios PAM de AGG y TGG para las secuencias 1 y 2, respectivamente. Ambos sgRNAs tenían una longitud de 20 pb, y los extremos se modificaron para añadir secuencias enlazadoras para que la enzima de restricción Bsmb1 se clonara en el vector objetivo (LentiCRISPRv2) como se describe en el informe anterior⁶. Se añadieron secuencias de enlace durante el diseño de sgRNAs con fines de clonación.

1. Los sgRNAs⁶ sintetizados químicamente por el recocido annal y su clonación en el vector lentiviral de corte único Bsmb1, LentiCRISPRv2, utilizando un protocolo optimizado como se informó anteriormente⁷.
2. Proceda con el empaquetamiento y concentración lentiviral utilizando un protocolo estandarizado y optimizado⁷.
3. Para la producción de lentivirus, se siembran células HEK293T (1 × 10⁵ células/^cm2) utilizando DMEM, FBS al 10% y 1x penicilina/estreptomicina (P/S) e incubar durante la noche en una incubadora de cultivo de tejidos a 37 °C en una atmósfera de 5% de CO₂ en condiciones húmedas.
4. Cuando el 90% confluye, co-transfecta células HEK293T con vector de entrada (columna vertebral vacía o plásmidos que expresan sgRNA) y empaqueta plásmidos utilizando PEI de polímero catiónico de bajo costo como se describió anteriormente⁷.
5. Recoja los medios acondicionados que contienen partículas de sobrenadante lentiviral (LVS) a las 48 h y 72 h después de la transfección y proceda a la ultracentrifugación con cojín de sacarosa y centrifuga los tubos a 1,25,000 x g durante 2 h a 4 °C.
6. Proceda con la concentración de partículas del VI al menos 200 veces el volumen original en PBS, alícuota, y almacene a -80 °C hasta su uso.
7. Determine el título de las partículas lentivirales utilizando el kit de titulación de lentivirus qPCR siguiendo las instrucciones del fabricante (consulte la tabla de materiales).

2. Infecciones lentivirales y propagación clonal unicelular

1. En el caso de infecciones con partículas de LVS, la suspensión celular de semilla hESC (H9) con 1 × 10⁵ células/0,5 mL de medio de cultivo de hESC (medio basal + P/S + 10 μM de inhibidor de roca) en placas de pocillos P24 recubiertas de Matrigel completo (1:50) en 500 μL de medio e incubar durante la noche para permitir que las células se adhieran. Siembre pocillos adicionales que no se infectarían con LVS, pero se tratarían con puromicina para que sirvieran como control no infectado.
   NOTA: El recuento de células se puede realizar utilizando un hemocitómetro manual o un contador de células automatizado.
2. Al día siguiente, infecte las células con una multiplicidad de infección (MOI) de 10 junto con 8 μg/mL de polibreno e incube a 37 °C durante 8 h, seguido de un reemplazo del medio con medio hESC fresco + P/S sin inhibidor de rocas y continúe cultivando hasta que las células sean 90% confluentes.
3. Comience la selección de puromicina suplementando el medio con una concentración de 0,8 μg/mL de puromicina cuando las células alcancen el 90% de confluencia, lo que suele ser 48-72 h después de la infección, y continúe la selección hasta que todas las células mueran en las células no infectadas (grupo de control).
4. Una vez completada la selección (generalmente de 4 a 6 días), divida las células estables (1:4) y amplíe para la criopreservación y el análisis posterior.
5. Realizar la selección de una sola célula y la expansión clonal utilizando células que expresan L2HGDH-sgRNA-1⁶.
6. Para ello, prepare una suspensión celular equivalente a 500 células/10 mL de medio de crecimiento completo y siembre 100 μL de esta suspensión en cada pocillo de una placa de 96 pocillos.
7. Deje las células intactas durante 3 días y luego observe.
8. Marque los pocillos que producen clones individuales y cambie el medio cada dos días hasta que se logre un tamaño suficiente para que las colonias (generalmente 2 semanas) se expandan más, se crioconserven y se analicen.

3. Extracción de ADNg, PCR MS-BSP y secuenciación de Sanger

1. Aísle el ADNg de las células utilizando el kit de aislamiento de ADN genómico siguiendo las instrucciones del fabricante (consulte la tabla de materiales).
2. Proceda con el mapeo de los sitios de mutación aguas arriba de las secuencias de reconocimiento de PAM utilizando el análisis de cebadores específicos basados en sitios de mutación (MS-BSP)⁸.
3. Para esto, un cebador derecho imparcial L2H-UMSBSP-R1 está diseñado para amplificar la región fuera del Exon1 para amplificar cualquier objetivo.
4. Diseñe un cebador izquierdo sesgado L2H-BMSBSP-F1 con una secuencia idéntica al sgRNA para amplificar la secuencia objetivo cerca de las secuencias de reconocimiento de PAM.
   NOTA: En condiciones muy estrictas de PCR, el producto se observará en el gel en clones no mutados. No se observaría ningún producto en los clones knockout de CRISPR que exhibieran mutaciones cerca de las secuencias de reconocimiento de PAM.
5. Con el fin de mapear las mutaciones de un solo par de bases, la PCR amplifica una secuencia de 468 pb que abarca todo el exón 1 de L2HGDH y se somete a una secuenciación de Sanger seguida de un análisis de alineación de secuencias múltiples utilizando clustalw⁸.

4. Ensayo de diferenciación de hESC y formación de cuerpos embrioides (EB)

1. Proceder a la diferenciación dirigida del control y de los diferentes clones CRISPR de hESCs (H9) hacia el destino del neuro-ectodermo siguiendo los protocolos establecidos descritos anteriormente utilizando el método de inhibición dual smad ^9,10,11.
2. Cuando tengan una confluencia del 90 %, trate las células con LDN193189 (200 nM) y SB431542 (10 μM) durante 24 h iniciales en medios 100% KSR seguidos de la adición de XAV939 (2 μM) durante 2 días adicionales.
3. Después de 3 días, reduzca el porcentaje de medios KSR (Knockout DMEM suplementado con 15% (v/v) KSR, 1% (v/v) L-glutamina, 1% (v/v) P/S, 1% (v/v) 10 mM MEM y 0,1% (v/v) 2-mercaptoetanol (75%, 50%, 25%) combinándolo con medios N2 (DMEM/F12 suplementado con 1x suplemento de N2, 1x P/S, ) al 100% de N2 durante un período de 8 días.
4. Al comienzo del día 12, fije las células para la inmunotinción utilizando PAX6 como marcador de neuroectodermo.
5. Para los estudios de determinación del destino mesodermo y endodérmico, se empleó un enfoque basado en CHIR99021 moléculas pequeñas descrito en publicaciones anteriores^12,13.
6. Para ello, cuando las células alcancen el 70% de confluencia, tratar con 3 μM de CHIR99021 en medio Definitive Endoderm (DE) durante 24 h seguido de la fijación para inmunotinción utilizando Brachuary como marcador específico del mesodermo.
7. Para la etapa endodérmica, cultive las células durante 24 h adicionales en medio DE solo sin la adición de CHIR99021 antes de fijar para la inmunotinción con FOXA2.
8. Para el ensayo de formación de EB, siembre las células en superficies celulares de baja adhesión sin usar Matrigel para cultivar células en condiciones de suspensión durante 24 h antes de tomar micrografías.

5. Análisis de Western blot

1. Lavar las células dos veces con PBS y lisar con 1x tampón RIPA que contiene 1% de SDS y 1x cóctel de inhibidores de proteasa y fosfatasa.
2. Aclarar los lisados por centrifugación a 16.000 x g durante 10 min a 4 °C, seguido de la recogida de los sobrenadantes.
3. Cuantifique la proteína celular total utilizando el kit de ensayo de proteínas BCA siguiendo las instrucciones del fabricante. Ajuste las muestras a 2 μg/μL utilizando un tampón de muestra de colorante de carga de 4×.
4. Desnaturalice las muestras de proteínas a 70 °C durante 10 min, cargue cantidades iguales de cada muestra y resuelva utilizando geles SDS-PAGE⁷ con un gradiente de 4%-12% seguido de una transferencia a la membrana de PVDF a un voltaje constante de 100 V durante 1 h a 4 °C.
5. Bloquee las membranas con leche descremada al 5% e incube en diluciones de anticuerpos primarios a 4 °C durante la noche con rotación.
6. A continuación, lave las membranas 5 veces con tampón PBST e incube en anticuerpos secundarios apropiados conjugados con HRP durante 1 h a temperatura ambiente.
7. Lavar las membranas de nuevo con PBST 5x, incubar con sustrato quimioluminiscente y revelar con películas de rayos X.

6. Inmunotinción

1. Siembre las células en placas de pocillos P4 e incube durante al menos 24 horas antes de la fijación para permitir la unión adecuada de las células a las superficies.
2. Lave las celdas 3 veces con PBS para eliminar las celdas muertas, así como los componentes del medio, seguido de la fijación con PFA al 4% durante 15 minutos a temperatura ambiente.
3. Permeabilizar las células mediante el uso de tritón X-100 al 0,3% seguido de un bloqueo para la unión inespecífica mediante el uso de BSA al 2% en PBS durante 1 h a temperatura ambiente.
4. Incubar las muestras con anticuerpos primarios (OCT4, NANOG, SOX2, KI67, PAX6, Brachuary, FOXA2) diluidos en BSA al 1% durante la noche a 4 °C.
5. Lavar las células 3 veces con PBS e incubar con anticuerpos secundarios apropiados (Cabra anti-ratón 488, Cabra anti-conejo 488, Cabra anti-ratón 546, Cabra anti-conejo 546) diluidos en BSA al 1% durante 1 h a temperatura ambiente.
6. Por último, lavar las muestras con PBS 3x y contrateñirlas con DAPI y obtener imágenes con un microscopio de fluorescencia.

Resultados

Clonación de sgRNAs L2HGDH en lentiCRISPRv2 puro
El vector puro lentiCRISPRv2 se obtuvo comercialmente (ver Tabla de Materiales) y se digirió con BsmB1, lo que resultó en la liberación de un fragmento de relleno de 1,8 Kb. Como se muestra en la Figura 2A, se observó una digestión completa del vector. Para cada constructo, se examinaron seis clones para detectar la presencia o ausencia de inserto utilizando una secue...

Discusión

Este estudio ha estandarizado un método que permite deleciones génicas altamente eficientes y rentables en hESCs a través de la tecnología CRISPR-Cas9. Este método logró con éxito la deleción homocigota del gen L2HGDH en hESCs en 3-4 semanas, desde la infección por hESC hasta la selección y propagación clonal de una sola célula (Tabla 1). Aunque las manipulaciones genéticas mediadas por CRISPR-Cas9 se pueden lograr mediante transfecciones transitorias en la ...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
2-MERCAPTOETHANOL	Invitrogen	31350010
38.5 mL, Sterile + Certified Free Open-Top Thinwall Ultra-Clear Tubes	Beckman Coulter	C14292
Accutase	Stem cell technologies	7920
bFGF Recombinant human	Invitrogen	PHG0261
Brachyury Rabbit mAb	Abclonal	A5078
BsmBI-v2	NEB	R0739S
chir99021	Tocris	4423/10
Corning Matrigel Basement Membrane Matrix, LDEV-free	Corning	354234
Cyclopamine	Stem cell technologies	72074
DMEM media	Invitrogen	11995073
DMEM NUTRIENT MIX F12	Invitrogen	11320033
DPBS w/o: Ca and Mg	PAN Biotech	P04-36500
Fetal bovie serum	Invitrogen	10270106
FoxA2/HNF3β	CST	8186
GAPDH (14C10) Rabbit mAb Antibody	CST	2118S
Gentle Cell Dissociation Reagent	Stem cell technologies	7174
HyClone Non Essential Amino Acids (NEAA) 100x Solution	GE healthcare	SH30238.01
Ki-67 (D3B5) Rabbit mAb	CST	9129
KnockOut Serum Replacement	Invitrogen	10828028
L GLUTAMINE, 100x	Invitrogen	2924190090
L2H-BMSBSP-F1	Macrogen		CGTGCGGGTTCGCGTCTGGG
L2HGDH Polyclonal antibody	Proteintech	15707-1-AP
L2HGDH-SgRNA1-F	Macrogen		CACCGCGTGCGG GTTCGCGTCTGGG
L2HGDH-SgRNA1-R	Macrogen		AAACCCCAGACGC GAACCCGCACGC
L2HGDH-SgRNA2-F	Macrogen		CACCGCCCGCGG GCTTTTCGCCGG
L2HGDH-SgRNA2-R	Macrogen		AAACCCGGCGAA AAGCCCGCGGGC
L2H-SeqF1	Macrogen		GCTAAAGAGCGC GGGTCCTCGG
L2H-SeqR1	Macrogen		GTGGACGGGTTG TTCAAAGCCAGAG
L2H-UMSBSP-R1	Macrogen		GTGGACGGGTTG TTCAAAGCCAGAG
LentiCRISPRv2	Addgene	52961
mTesR1 complete media	Stem cell technologies	85850
Nanog Antibody	CST	3580
NEUROBASAL MEDIUM 1x CTS	Invitrogen	A1371201
Neuropan 2 Supplement 100x	PAN Biotech	P07-11050
Neuropan 27 Supplement 50x	PAN Biotech	P07-07200
Oct-4 Antibody	CST	2750
Pax6 (D3A9V) XP Rabbit mAb	CST	60433
PENICILLIN STREPTOMYCIN SOL	Invitrogen	15140122
pMD2.G	Addgene	12259
Polybrene infection reagent	Sigma	TR1003- G
Polyethylenimine, branched	Sigma	408727
psPAX2.0	Addgene	12260
Puromycin	Invitrogen	A1113802
qPCR Lentivirus Titer Kit	Abm	LV900
Rock inhibitor Y-27632 dihydrochloride	Tocris	1254
SB 431542	Tocris	1614/10
Sox2 Antibody	CST	2748
Sucrose	Sigma	57-50-1
TRYPSIN .05% EDTA	Invitrogen	25300062
U6-459F	Macrogen		GAGGGCCTATT TCCCATGATTC
Wizard Genomic DNA Purification Kit	Promega	A1120
XAV 939	Tocris	3748/10