CRISPR-Cas9 매개 유전자 결실은 feeder-free 조건에서 배양된 인간 만능 줄기 세포에서 발생합니다.

요약

제시된 방법은 고효율 렌티바이러스 매개 유전자 전달 시스템을 사용하여 L2HGDH 유전자를 표적으로 하는 sgRNA를 안정적으로 발현하는 인간 배아 줄기 세포(hESC) 계통 H9에서 CRISPR 매개 유전자 knockout의 생성을 설명합니다.

초록

게놈 편집을 위한 CRISPR-Cas9 시스템은 줄기세포를 포함한 포유류 세포의 유전자 기능 연구에 혁명을 일으켰습니다. 그러나 이 기술의 실제 적용, 특히 만능 줄기 세포에서 시간 및 노동 집약적이고 편집 효율성이 낮은 것과 같은 특정 문제가 있습니다. 여기에서는 매우 효율적이고 안정적인 렌티바이러스 매개 유전자 전달 시스템을 사용하여 L2HGDH 유전자에 대한 sgRNA를 안정적으로 발현하는 인간 배아 줄기 세포(hESC) 계열에서 CRISPR 매개 유전자 knockout을 생성하는 방법에 대해 설명합니다. L2HGDH 유전자의 엑손 1을 표적으로 하는 sgRNA를 화학적으로 합성하여 렌tiCRISPR v2-puro 벡터로 클로닝했으며, 이 벡터는 고효율 단일 벡터 시스템에서 sgRNA와 Cas9의 구성적 발현을 결합하여 hESC 감염에 대한 더 높은 렌티바이러스 역가를 달성하고 퓨로마이신을 사용하여 안정적인 선택을 가능하게 했습니다. Puromycin-선택된 세포를 더욱 증식시키고, 제한된 희석 방법을 사용하여 단일-세포 클론을 수득하였다. 단일 클론을 확장하고, 웨스턴 블롯 분석을 사용하여 L2HGDH 발현의 100% 감소로 확인된 바와 같이 L2HGDH 유전자에 대한 여러 동형접합 녹아웃 클론을 수득하였다. 또한 MSBSP-PCR을 사용하여 CRISPR 돌연변이 부위를 선택된 동형접합 클론에서 Cas9의 PAM 인식 서열의 업스트림으로 매핑했습니다. 정확한 삽입/결실을 분석하기 위해 Sanger 염기서열분석을 수행하고, 클론의 기능적 특성 분석을 수행했습니다. 이 방법은 이전에 보고된 비바이러스성 유전자 전달 방법에 비해 훨씬 더 높은 동형접합 결실 비율을 생성했습니다. 이 보고서는 L2HGDH 유전자에 초점을 맞추고 있지만, 이 강력하고 비용 효율적인 접근 방식은 유전자 기능 연구를 위해 만능줄기세포의 다른 유전자에 대한 동형접합 knockout을 생성하는 데 사용할 수 있습니다.

서문

인간 배아 줄기 세포(hESC) 및 유도 만능 줄기 세포(iPSC)는 신체의 모든 세포 유형으로 분화할 수 있는 잠재력을 가진 줄기 세포입니다. 이러한 세포는 인간 발달을 연구하고 다양한 질병의 기본 메커니즘을 이해하는 데 유용한 도구 역할을 하므로 재생 의학, 질병 모델링 및 약물 발견에 대한 엄청난 가능성을 제공합니다. 이러한 연구에는 특정 유전자가 유기체의 발달, 기능 및 조절에 어떻게 기여하는지 조사하는 것이 포함됩니다 ^1,2.

유전자 knockout 또는 과발현과 같은 유전자 조작, 게놈 편집을 포함하여 유전자 기능을 해독하기 위해 다양한 기술과 접근 방식이 사용됩니다. 이 중 CRISPR-Cas9 기술은 유전자 knockout 및 유전자 편집 연구를 위한 가장 효율적인 접근법으로 부상하고^{있습니다 1,2,3}. CRISPR-Cas9 시스템은 특정 관심 DNA 염기서열을 식별하고 결합하도록 특별히 설계된 단일 가이드 RNA(sgRNA) 분자를 활용하여 작동합니다. 분자 가이드 역할을 하는 sgRNA는 Cas9 효소를 수정이 필요한 게놈의 정확한 위치로 유도합니다. 일단 결합되면, Cas9는 지정된 부위의 DNA에서 이중 가닥 절단을 시작합니다. DNA가 절단되면 세포의 고유한 복구 메커니즘이 활성화됩니다. 여기에는 NHEJ(Non-Homologous End Joining)와 HDR(Homology-Directed Repair)의 두 가지 주요 복구 경로가 포함됩니다. NHEJ는 종종 절단 부위에 삽입 또는 결실(indels)을 초래하여 유전자 파괴 또는 불활성화를 초래합니다. 반대로, HDR은 절단 부위에 새로운 DNA 염기서열을 삽입할 수 있게 하여 표적 유전자 변형의 도입을 용이하게 합니다⁴.

만능줄기세포에서 유전자 결실의 중요성을 감안할 때, hESCs/iPSCs에서 CRISPR-Cas9 매개 유전자 knockouts에 대한 여러 프로토콜이 발표되었습니다. 그러나 이러한 프로토콜 중 다수는 시간이 많이 걸리고 노동 집약적이며 비바이러스 유전자 전달 방법을 사용하기 때문에 효율성이 낮다는 등의 심각한 한계에 직면해 있습니다⁵. 이러한 문제는 hESC/iPSC에서 더욱 두드러지는데, 이러한 세포는 다른 세포 유형에 비해 편집 효율이 낮은 것으로 알려져 있기 때문입니다⁵. 이러한 한계 중 일부는 Cas9 및 sgRNA를 포함하는 플라스미드 전달의 효율성을 높임으로써 해결할 수 있습니다. 이는 유전자 편집 결과를 크게 개선할 수 있는 렌티바이러스 벡터 시스템을 사용하여 성공적으로 달성할 수 있습니다. 렌티바이러스 패키징 프로토콜은 잘 정립되어 있고 간단하여 경험이 부족한 연구자도 실험실에서 쉽게 채택할 수 있습니다. 렌티바이러스는 hESC 및 iPSC를 포함한 다양한 세포 유형에서 높은 감염 효율을 보입니다. 따라서 Cas9-sgRNA 발현을 위해 렌티바이러스 시스템을 활용하는 것은 유전자 기능 연구를 위한 hESC/iPSC의 일상적인 유전자 편집 실험에 이상적입니다.

여기에서는 기존 프로토콜보다 비교적 짧은 시간 내에 hESC에서 매우 효율적인 CRISPR-Cas9 기반 유전자 결실을 위한 간단하고 간단한 방법을 제공합니다(그림 1). Cas9 및 sgRNA의 구성적 발현을 가진 렌티바이러스 벡터가 사용되었지만, 제어 가능한 Cas9 발현을 위해 약물 유도 Cas9 발현으로 쉽게 대체될 수 있습니다.

프로토콜

이 연구에 사용된 유전자 염기서열, 시약 및 장비의 세부 사항은 재료 표에 나열되어 있습니다.

1. Single guide RNA(sgRNA) 디자인, 클로닝 및 렌티바이러스 벡터 생산

참고: L2HGDH 유전자의 엑손 1을 표적으로 하는 두 가지 다른 sgRNA 염기서열이 사용되며, 둘 다 Qiu et ^al.6에서 채택된 AGG 및 TGG의 PAM 부위와 염기서열 1 및 2에 대해 사용됩니다. 두 sgRNA의 길이는 20 bp였고, 이전 보고서⁶에서 설명한 바와 같이 표적 벡터(LentiCRISPRv2)에서 클로닝할 제한효소 Bsmb1에 대한 링커 서열을 추가하도록 말단을 수정하였다. 링커 염기서열은 클로닝 목적으로 sgRNA를 설계하는 동안 추가되었습니다.

1. 화학적으로 합성된 sgRNAs⁶ 및 클론을 이전에 보고된 최적화된 프로토콜을 사용하여 Bsmb1 단일 컷 렌티바이러스 벡터인 LentiCRISPRv2로 어닐링합니다⁷.
2. 표준화되고 최적화된 프로토콜을 사용하여 렌티바이러스 패키징 및 농축 진행⁷.
3. 렌티바이러스 생산을 위해 DMEM, 10% FBS 및 1x 페니실린/스트렙토마이신(P/S)을 사용하여 HEK293T 세포(1 × 10⁵ cells/cm²)를 종종하고 습한 조건에서 5% CO₂ 의 분위기에서 37°C의 조직 배양 인큐베이터에서 밤새 배양합니다.
4. 90%가 합류하면 entry vector(빈 백본 또는 sgRNA 발현 플라스미드)가 있는 HEK293T 세포를 co-transfection하고 앞서 설명한 대로 저비용 양이온성 폴리머 PEI를 사용하여 플라스미드를 패키징합니다⁷.
5. transfection 후 48시간 및 72시간에 Lentiviral 상층액(LVS) 입자가 포함된 컨디셔닝된 배지를 수집하고 슈크로스 쿠션을 사용하여 초원심분리를 진행하고 1,25,000 x g 에서 4°C에서 2시간 동안 튜브를 회전시킵니다.
6. LVS 입자 농도를 PBS의 원래 부피의 최소 200배까지 진행하고 분취하여 사용할 때까지 -80°C에서 보관합니다.
7. 제조업체의 지침에 따라 qPCR Lentivirus Titer Kit를 사용하여 렌티바이러스 입자의 역가를 측정합니다( 재료 표 참조).

2. 렌티바이러스 감염 및 단세포 클론 증식

1. LVS 입자 감염의 경우, 1 × 10⁵ cells/0.5 mL의 hESC 배양 배지(기저 배지 + P/S + 10 μM의 Rock Inhibitor)를 가진 seed hESC(H9) 세포 현탁액을 500 μL의 배지에 코팅하고 세포가 부착될 수 있도록 밤새 배양합니다. LVS에 감염되지 않지만 퓨로마이신으로 처리하여 비감염 대조군 역할을 하는 여분의 웰을 파종합니다.
   참고: 세포 계수는 수동 혈구계 또는 자동 세포 계수기를 사용하여 수행할 수 있습니다.
2. 다음 날, 8μg/mL의 폴리브렌과 함께 MOI(Multiplicity of Infection) 10에서 세포를 감염시키고 37°C에서 8시간 동안 배양한 다음 Rock Inhibitor가 없는 새로운 hESC 배지 + P/S로 배지를 교체하고 세포가 90% 합류할 때까지 계속 배양합니다.
3. 세포가 90% 밀도(일반적으로 감염 후 48-72시간)에 도달하면 배지에 0.8μg/mL 농도의 퓨로마이신을 보충하여 puromycin 선택을 시작하고 감염되지 않은 세포(대조군)에서 모든 세포가 죽을 때까지 선택을 계속합니다.
4. 선택이 완료된 후(보통 4-6일) 안정적인 세포를 분할하고(1:4) 동결 보존 및 추가 분석을 위해 확장합니다.
5. L2HGDH-sgRNA-1을 발현하는 세포를 사용하여 단일 세포 선택 및 클론 확장을 수행합니다⁶.
6. 이를 위해 500개 세포/10mL의 완전 성장 배지에 해당하는 세포 현탁액을 준비하고 96웰 플레이트의 각 웰에 이 현탁액 100μL를 파종합니다.
7. 세포를 3일 동안 방해하지 않고 그대로 두었다가 관찰하십시오.
8. 단일 클론을 산출하는 웰을 표시하고 콜로니가 더 확장하고 냉동 보존 및 분석할 수 있는 충분한 크기(보통 2주)에 도달할 때까지 이틀에 한 번씩 배지를 교체합니다.

3. gDNA 추출, MS-BSP PCR 및 Sanger 염기서열분석

1. 제조업체의 지침에 따라 게놈 DNA 분리 키트를 사용하여 세포에서 gDNA를 분리합니다( 재료 표 참조).
2. MS-BSP(Mutation Sites Based Specific Primers) 분석을 사용하여 PAM 인식 서열의 상류에 있는 돌연변이 부위 매핑을 진행합니다⁸.
3. 이를 위해 편향되지 않은 오른쪽 프라이머 L2H-UMSBSP-R1은 Exon1 외부 영역을 증폭하여 모든 표적을 증폭하도록 설계되었습니다.
4. sgRNA와 동일한 염기서열로 편향된 좌측 프라이머 L2H-BMSBSP-F1을 설계하여 PAM 인식 염기서열에 가깝게 표적 염기서열을 증폭합니다.
   주: PCR의 아주 높은 엄격한 조건에서, 제품은 돌연변이되지 않은 클론에 있는 젤에 관찰될 것입니다. PAM 인식 염기서열의 업스트림에 가까운 돌연변이를 보이는 CRISPR-knockout 클론에서는 어떤 제품도 관찰되지 않습니다.
5. 단일 염기쌍 돌연변이를 매핑하기 위해 PCR은 L2HGDH 의 전체 엑손 1에 걸쳐 468bp 염기서열을 증폭하고 Sanger 염기서열분석 후 clustalw⁸을 사용하여 다중 염기서열 정렬 분석을 수행합니다.

4. hESC-분화 및 배아체(EB) 형성 분석

1. 이중 smad 억제 방법 ^9,10,11을 사용하여 이전에 설명한 바와 같이 확립된 프로토콜에 따라 신경 외배엽 운명에 대한 hESC의 제어 및 다양한 CRISPR 클론(H9)의 지시 분화를 진행합니다.
2. 밀도가 90%에 도달하면 100% KSR 배지에서 처음 24시간 동안 LDN193189(200nM) 및 SB431542(10μM)로 세포를 처리한 다음 추가 2일 동안 XAV939(2μM)를 추가합니다.
3. 3일 후 N2 미디어(DMEM/F12에 N2 보충제 1개, P/S 1개, P/S 1%(v/v)가 보충된 Kr 미디어(15%(v/v) KSR, 1%(v/v) L-글루타민, 1%(v/v) P/S, 1%(v/v) 10mM MEM 및 0.1%(v/v) 2-메르캅토에탄올(75%, 50%, 25%)이 보충된 Knockout DMEM을 N2 미디어(DMEM/F12에 N2 보충제 1개, P/S 1개, )을 8일 동안 100% N2 미디어에 저장합니다.
4. 12일이 시작될 때 PAX6를 신경 외배엽 마커로 사용하여 면역염색을 위해 세포를 고정합니다.
5. 중배엽 및 내배엽 운명 결정 연구의 경우 이전 간행물^12,13에 설명된 소분자 CHIR99021 기반 접근법을 사용합니다.
6. 이를 위해 세포가 70% 밀도에 도달하면 Definitive Endoderm(DE) 배지에서 3μM의 CHIR99021으로 24시간 동안 처리한 다음 Brachuary를 중배엽 특이적 마커로 사용하여 면역염색을 위한 고정을 수행합니다.
7. 내배엽 단계의 경우 FOXA2를 사용하여 면역염색을 고정하기 전에 CHIR99021를 추가하지 않고 DE 배지에서만 추가로 24시간 동안 세포를 배양합니다.
8. EB 형성 분석의 경우, 현미경 사진을 찍기 전에 Matrigel을 사용하여 현탁 상태에서 24시간 동안 세포를 배양하지 않고 부착이 낮은 세포 표면에 세포를 파종합니다.

5. 웨스턴 블롯 분석

1. PBS를 사용하여 세포를 두 번 세척하고 1% SDS와 1x 프로테아제 및 인산가수분해효소 억제제 칵테일을 포함하는 1x RIPA 완충액을 사용하여 용해합니다.
2. 16,000 x g 에서 4 °C에서 10 분 동안 원심 분리하여 용해물을 세척 한 후 상층액을 수집합니다.
3. 제조업체의 지침에 따라 BCA 단백질 분석 키트를 사용하여 총 세포 단백질을 정량화합니다. 4× 로딩 염료 시료 버퍼를 사용하여 시료를 2μg/μL로 조정합니다.
4. 단백질 시료를 70°C에서 10분 동안 변성시키고, 각 시료를 동일한 양으로 로드하고, 4%-12% 그래디언트 SDS-PAGE 겔⁷ 을 사용하여 분해한 다음 4°C에서 1시간 동안 100V의 일정한 전압에서 PVDF 멤브레인으로 옮깁니다.
5. 5% 무지방 우유를 사용하여 멤브레인을 차단하고 4°C에서 1차 항체 희석액으로 하룻밤 동안 회전하면서 배양합니다.
6. 다음으로, PBST 완충액을 사용하여 멤브레인을 5배 세척하고 실온에서 1시간 동안 HRP 접합 적절한 2차 항체에 배양합니다.
7. PBST 5x로 멤브레인을 다시 세척하고, 화학발광 기질로 배양하고, X선 필름을 사용하여 현상합니다.

6. 면역염색

1. P4 웰 플레이트에 세포를 파종하고 세포가 표면에 적절하게 부착될 수 있도록 고정하기 전에 최소 24시간 동안 배양합니다.
2. PBS로 세포를 3번 세척하여 죽은 세포와 배지 구성 요소를 제거한 다음 실온에서 4% PFA를 사용하여 15분 동안 고정합니다.
3. 0.3% 트리톤 X-100을 사용하여 세포를 투과시킨 다음 실온에서 1시간 동안 PBS에서 2% BSA를 사용하여 비특이적 결합을 차단합니다.
4. 1% BSA에 4°C에서 하룻밤 동안 희석한 1차 항체(OCT4, NANOG, SOX2, KI67, PAX6, Brachuary, FOXA2)로 샘플을 배양합니다.
5. PBS로 세포를 3배 세척하고 실온에서 1시간 동안 1% BSA에 희석한 적절한 2차 항체(Goat anti-mouse 488, Goat anti-rabbit 488, Goat anti-mouse 546, Goat anti-rabbit 546)로 배양합니다.
6. 마지막으로 PBS 3x로 샘플을 세척하고 형광 현미경을 사용하여 DAPI와 이미지로 대조염색합니다.

결과

lentiCRISPRv2 puro에서 L2HGDH sgRNAs 클로닝
lentiCRISPRv2 puro 벡터를 상업적으로 획득하고( 재료 표 참조) BsmB1로 절단한 결과, 1.8Kb 스터퍼 단편이 방출되었습니다. 그림 2A에서 볼 수 있듯이, 벡터의 완전한 분해가 관찰되었습니다. 각 구조체에 대해 벡터 서열 내에서 역 sgRNA 서열을 프라이머로, 전방 프라이머(U6-459F)를 사용하여 삽?...

토론

본 연구는 CRISPR-Cas9 기술을 통해 hESC에서 매우 효율적이고 비용 효율적인 유전자 결실을 가능하게 하는 방법을 표준화하였습니다. 이 방법은 hESC 감염부터 단세포 클론 선택 및 증식에 이르기까지 3-4주 이내에 hESC에서 L2HGDH 유전자의 동형접합 결실을 성공적으로 달성했습니다(표 1). CRISPR-Cas9 매개 유전자 조작은 대부분의 세포에서 일시적인 transfection으로 달?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
2-MERCAPTOETHANOL	Invitrogen	31350010
38.5 mL, Sterile + Certified Free Open-Top Thinwall Ultra-Clear Tubes	Beckman Coulter	C14292
Accutase	Stem cell technologies	7920
bFGF Recombinant human	Invitrogen	PHG0261
Brachyury Rabbit mAb	Abclonal	A5078
BsmBI-v2	NEB	R0739S
chir99021	Tocris	4423/10
Corning Matrigel Basement Membrane Matrix, LDEV-free	Corning	354234
Cyclopamine	Stem cell technologies	72074
DMEM media	Invitrogen	11995073
DMEM NUTRIENT MIX F12	Invitrogen	11320033
DPBS w/o: Ca and Mg	PAN Biotech	P04-36500
Fetal bovie serum	Invitrogen	10270106
FoxA2/HNF3β	CST	8186
GAPDH (14C10) Rabbit mAb Antibody	CST	2118S
Gentle Cell Dissociation Reagent	Stem cell technologies	7174
HyClone Non Essential Amino Acids (NEAA) 100x Solution	GE healthcare	SH30238.01
Ki-67 (D3B5) Rabbit mAb	CST	9129
KnockOut Serum Replacement	Invitrogen	10828028
L GLUTAMINE, 100x	Invitrogen	2924190090
L2H-BMSBSP-F1	Macrogen		CGTGCGGGTTCGCGTCTGGG
L2HGDH Polyclonal antibody	Proteintech	15707-1-AP
L2HGDH-SgRNA1-F	Macrogen		CACCGCGTGCGG GTTCGCGTCTGGG
L2HGDH-SgRNA1-R	Macrogen		AAACCCCAGACGC GAACCCGCACGC
L2HGDH-SgRNA2-F	Macrogen		CACCGCCCGCGG GCTTTTCGCCGG
L2HGDH-SgRNA2-R	Macrogen		AAACCCGGCGAA AAGCCCGCGGGC
L2H-SeqF1	Macrogen		GCTAAAGAGCGC GGGTCCTCGG
L2H-SeqR1	Macrogen		GTGGACGGGTTG TTCAAAGCCAGAG
L2H-UMSBSP-R1	Macrogen		GTGGACGGGTTG TTCAAAGCCAGAG
LentiCRISPRv2	Addgene	52961
mTesR1 complete media	Stem cell technologies	85850
Nanog Antibody	CST	3580
NEUROBASAL MEDIUM 1x CTS	Invitrogen	A1371201
Neuropan 2 Supplement 100x	PAN Biotech	P07-11050
Neuropan 27 Supplement 50x	PAN Biotech	P07-07200
Oct-4 Antibody	CST	2750
Pax6 (D3A9V) XP Rabbit mAb	CST	60433
PENICILLIN STREPTOMYCIN SOL	Invitrogen	15140122
pMD2.G	Addgene	12259
Polybrene infection reagent	Sigma	TR1003- G
Polyethylenimine, branched	Sigma	408727
psPAX2.0	Addgene	12260
Puromycin	Invitrogen	A1113802
qPCR Lentivirus Titer Kit	Abm	LV900
Rock inhibitor Y-27632 dihydrochloride	Tocris	1254
SB 431542	Tocris	1614/10
Sox2 Antibody	CST	2748
Sucrose	Sigma	57-50-1
TRYPSIN .05% EDTA	Invitrogen	25300062
U6-459F	Macrogen		GAGGGCCTATT TCCCATGATTC
Wizard Genomic DNA Purification Kit	Promega	A1120
XAV 939	Tocris	3748/10