Besleyicisiz Koşullar Altında Kültürlenen İnsan Pluripotent Kök Hücrelerinde CRISPR-Cas9 Aracılı Gen Delesyonuna

Özet

Sunulan yöntem, yüksek verimli bir lentiviral aracılı gen dağıtım sistemi kullanarak L2HGDH genini hedefleyen sgRNA'ları kararlı bir şekilde ifade eden insan embriyonik kök hücre (hESC) hattı H9'da CRISPR aracılı bir gen nakavtının oluşturulmasını açıklar.

Özet

Genom düzenleme için CRISPR-Cas9 sistemi, kök hücreler de dahil olmak üzere memeli hücrelerinde gen fonksiyonu çalışmalarında devrim yarattı. Bununla birlikte, bu tekniğin, özellikle pluripotent kök hücrelerde pratik uygulaması, zaman ve emek yoğun olması ve düşük düzenleme verimliliğine sahip olması gibi bazı zorluklar ortaya çıkarmaktadır. Burada, yüksek verimli ve stabil bir lentiviral aracılı gen dağıtım sistemi kullanarak, L2HGDH geni için sgRNA'ları kararlı bir şekilde ifade eden bir insan embriyonik kök hücre (hESC) hattında CRISPR aracılı bir gen nakavtının oluşturulmasını açıklıyoruz. L2HGDH geninin ekzon 1'ini hedefleyen sgRNA'lar kimyasal olarak sentezlendi ve hESC enfeksiyonu için daha yüksek lentiviral titreler ve puromisin kullanılarak stabil seçim elde etmek için sgRNA'ların yapısal ekspresyonunu Cas9 ile yüksek verimli bir tek vektör sisteminde birleştiren lentiCRISPR v2-puro vektörüne klonlandı. Puromisin ile seçilen hücreler daha da genişletildi ve sınırlı seyreltme yöntemi kullanılarak tek hücreli klonlar elde edildi. Tek klonlar genişletildi ve Western blot analizi kullanılarak L2HGDH ekspresyonunda %100'lük bir azalma ile doğrulandığı gibi, L2HGDH geni için birkaç homozigot nakavt klonu elde edildi. Ayrıca, MSBSP-PCR kullanılarak, CRISPR mutasyon bölgesi, seçilen homozigot klonlarda Cas9'un PAM tanıma dizisinin yukarı akışında haritalandı. Kesin ekleme/silme işlemlerini analiz etmek için Sanger dizilemesi yapıldı ve klonların fonksiyonel karakterizasyonu yapıldı. Bu yöntem, daha önce bildirilen viral olmayan gen verme yöntemlerine kıyasla önemli ölçüde daha yüksek bir homozigot delesyon yüzdesi üretti. Bu rapor L2HGDH genine odaklansa da, bu sağlam ve uygun maliyetli yaklaşım, gen fonksiyon çalışmaları için pluripotent kök hücrelerdeki diğer genler için homozigot nakavtlar oluşturmak için kullanılabilir.

Giriş

İnsan embriyonik kök hücreleri (hESC'ler) ve indüklenmiş pluripotent kök hücreler (iPSC'ler), vücuttaki tüm hücre tiplerine farklılaşma potansiyeline sahip kök hücrelerdir. Bu hücreler, insan gelişimini incelemenin yanı sıra çeşitli hastalıkların altında yatan mekanizmaları anlamak için değerli araçlar olarak hizmet eder ve böylece rejeneratif tıp, hastalık modellemesi ve ilaç keşfi için muazzam bir umut vaat eder. Bu tür çalışmalar, belirli genlerin organizmaların gelişimine, işleyişine ve düzenlenmesine nasıl katkıda bulunduğunun araştırılmasını içerir ^1,2.

Gen işlevini deşifre etmek için, gen nakavt etme veya aşırı ekspresyon gibi genetik manipülasyon ve genom düzenleme dahil olmak üzere çeşitli teknikler ve yaklaşımlar kullanılır. Bunlar arasında CRISPR-Cas9 teknolojisi, gen nakavt ve gen düzenleme çalışmaları için en verimli yaklaşım olarak ortaya çıkmıştır ^1,2,3. CRISPR-Cas9 sistemi, ilgilenilen belirli bir DNA dizisini tanımlamak ve bağlamak için özel olarak tasarlanmış tek bir kılavuz RNA (sgRNA) molekülü kullanarak çalışır. Moleküler bir kılavuz görevi gören sgRNA, Cas9 enzimini genomda modifikasyon gerektiren kesin konuma yönlendirir. Bağlandıktan sonra, Cas9 belirlenen bölgede DNA'da çift sarmallı bir kırılma başlatır. DNA'nın bölünmesini takiben, hücrenin doğal onarım mekanizmaları aktive edilir. Bunlar iki ana onarım yolunu içerir: homolog olmayan uç birleştirme (NHEJ) ve homolojiye yönelik onarım (HDR). NHEJ genellikle kırılma bölgesinde eklemeler veya delesyonlar (indels) ile sonuçlanır ve bu da gen bozulmasına veya inaktivasyona yol açar. Tersine, HDR, kırılma bölgesine yeni DNA dizilerinin yerleştirilmesini sağlayarak hedeflenen genetik değişikliklerin tanıtılmasını kolaylaştırır⁴.

Pluripotent kök hücrelerde gen delesyonlarının önemi göz önüne alındığında, hESC'lerde / iPSC'lerde CRISPR-Cas9 aracılı gen nakavtları hakkında çeşitli protokoller yayınlanmıştır. Bununla birlikte, bu protokollerin çoğu, son derece zaman alıcı, emek yoğun ve viral olmayan gen dağıtım yöntemlerinin kullanılması nedeniyle düşük verimliliğe sahip olma gibi önemli sınırlamalarla karşı karşıyadır⁵. Bu hücrelerin diğer hücre tiplerine kıyasla daha düşük düzenleme verimliliğine sahip olduğu bilindiğinden, bu zorluklar hESC'lerde/iPSC'lerde daha da belirgindir⁵. Bu sınırlamalardan bazıları, Cas9 ve sgRNA'ları içeren plazmit dağıtımının verimliliğini artırarak ele alınabilir. Bu, gen düzenleme sonuçlarını önemli ölçüde iyileştirebilen bir lentiviral vektör sistemi kullanılarak başarılı bir şekilde başarılabilir. Lentivirus paketleme protokolleri iyi kurulmuş ve basittir, sınırlı deneyime sahip araştırmacılar tarafından bile laboratuvarlarda kolayca benimsenmesini sağlar. Lentivirüsler, hESC'ler ve iPSC'ler dahil olmak üzere çeşitli hücre tiplerinde yüksek enfeksiyon verimliliği sergiler. Bu nedenle, Cas9-sgRNA ekspresyonu için bir lentiviral sistem kullanmak, gen fonksiyonu çalışmaları için hESC'lerde/iPSC'lerde rutin gen düzenleme deneyleri için idealdir.

Burada, hESC'lerde geleneksel protokollerden nispeten daha kısa bir süre içinde yüksek verimli CRISPR-Cas9 tabanlı gen delesyonları için basit ve anlaşılır bir yöntem sunuyoruz (Şekil 1). Cas9 ve sgRNA'nın yapısal ekspresyonuna sahip bir lentiviral vektör kullanılmış olmasına rağmen, kontrol edilebilir Cas9 ekspresyonu için ilaca bağlı Cas9 ekspresyonu ile kolayca değiştirilebilir.

Protokol

Bu çalışmada kullanılan gen dizileri, reaktifler ve ekipmanların ayrıntıları Malzeme Tablosunda listelenmiştir.

1. Tek kılavuz RNA (sgRNA) tasarımı, klonlama ve lentiviral vektör üretimi

NOT: L2HGDH geninin ekzon 1'ini hedefleyen, her ikisi de Qiu ve ^ark.6'dansırasıyla 1 ve 2 dizileri için AGG ve TGG'nin PAM bölgeleri ile uyarlanmış iki farklı sgRNA dizisi kullanılır. Her iki sgRNA da 20 bp uzunluğundaydı ve uçlar, önceki rapor^6'da açıklandığı gibi hedef vektörde (LentiCRISPRv2) klonlanacak kısıtlama enzimi Bsmb1 için bağlayıcı diziler eklemek üzere değiştirildi. Klonlama amacıyla sgRNA'ların tasarımı sırasında bağlayıcı diziler eklendi.

1. Tavlanmış sgRNA'lar⁶ ve daha önce bildirildiği gibi optimize edilmiş protokol kullanılarak Bsmb1 tek kesimli lentiviral vektör, LentiCRISPRv2'ye klonlanır⁷.
2. Standartlaştırılmış ve optimize edilmiş protokol^7'yi kullanarak lentiviral paketleme ve konsantrasyon ile devam edin.
3. Lentivirüs üretimi için, DMEM,% 10 FBS ve 1x penisilin / streptomisin (P / S) kullanarak hücreleri (1 HEK293T× 10⁵ hücre /^cm2) tohumlayın ve nemli koşullar altında% 5 CO₂ atmosferinde 37 ° C'de doku kültürü inkübatöründe gece boyunca inkübe edin.
4. % 90 birleştiğinde, giriş vektörü (boş omurga veya plazmitleri eksprese eden sgRNA) ile HEK293T hücreleri birlikte transfekte edin ve daha önce tarif edildiği gibi düşük maliyetli katyonik polimer PEI kullanarak plazmitleri paketleyin⁷.
5. Transfeksiyondan 48 saat ve 72 saat sonra Lentiviral süpernatant (LVS) partikülleri içeren şartlandırılmış ortamı toplayın ve sükroz yastığı kullanarak ultrasantrifüjlemeye devam edin ve tüpleri 1,25,000 ° C'de 2 saat boyunca 4 x g'da döndürün.
6. LVS partikül konsantrasyonu ile PBS, alikot cinsinden orijinal hacmin en az 200 katına kadar devam edin ve kullanıma kadar -80 ° C'de saklayın.
7. Üreticinin talimatlarını izleyerek qPCR Lentivirus Titre Kitini kullanarak lentiviral partiküllerin titresini belirleyin (bkz. Malzeme Tablosu).

2. Lentiviral enfeksiyonlar ve tek hücreli klonal yayılım

1. LVS partikülleri ile enfeksiyonlar için, 1 × 10⁵ hücre/0.5 mL hESC kültür ortamına (Bazal ortam + P / S + 10 μM Kaya İnhibitörü) sahip tohum hESC (H9) hücre süspansiyonu, 500 μL ortamda tam Matrigel (1:50) kaplı P24 oyuklu plakalar üzerinde ve hücrelerin yapışmasına izin vermek için gece boyunca inkübe edilir. LVS ile enfekte olmayacak ancak enfekte olmayan kontrol olarak hizmet etmek için puromisin ile muamele edilecek ekstra kuyular tohumlayın.
   NOT: Hücre sayımı, manuel hemositometre veya otomatik hücre sayacı kullanılarak gerçekleştirilebilir.
2. Ertesi gün, hücreleri 8 μg/mL polibren ile birlikte 10 ° C'lik Enfeksiyon Çokluğunda (MOI) enfekte edin ve 37 ° C'de 8 saat inkübe edin, ardından taze hESC ortamı + Kaya İnhibitörü içermeyen P / S ile ortam değişimi yapın ve hücreler% 90 birleşene kadar kültürlemeye devam edin.
3. Hücreler genellikle enfeksiyondan 48-72 saat sonra %90 birleşmeye ulaştığında, ortamı 0.8 μg/mL puromisin konsantrasyonu ile destekleyerek puromisin seçimine başlayın ve enfekte olmayan hücrelerde (kontrol grubu) tüm hücreler ölene kadar seçime devam edin.
4. Seçim tamamlandıktan sonra (genellikle 4-6 gün), kararlı hücreleri bölün (1: 4) ve kriyoprezervasyon ve daha fazla analiz için genişletin.
5. L2HGDH-sgRNA-1⁶ eksprese eden hücreleri kullanarak tek hücre seçimi ve klonal genişleme gerçekleştirin.
6. Bu amaçla, 500 hücre / 10 mL tam büyüme ortamına eşdeğer bir hücre süspansiyonu hazırlayın ve 96 oyuklu bir plakanın her bir oyuğuna bu süspansiyondan 100 μL tohumlayın.
7. Hücreleri 3 gün boyunca rahatsız etmeyin ve sonra gözlemleyin.
8. Tek klonlar veren kuyuları işaretleyin ve kolonilerin daha da genişlemesi, kriyoprezervasyon yapması ve analiz etmesi için yeterli bir boyuta ulaşılana kadar (genellikle 2 hafta) ortamı her gün değiştirin.

3. gDNA ekstraksiyonu, MS-BSP PCR ve Sanger dizilimi

1. Üreticinin talimatlarını izleyerek genomik DNA izolasyon Kitini kullanarak hücrelerden gDNA'yı izole edin (bkz. Malzeme Tablosu).
2. Mutasyon Bölgelerine Dayalı Spesifik Primerler (MS-BSP) analizini⁸ kullanarak PAM tanıma dizilerinin yukarısındaki mutasyon bölgelerinin haritalanmasına devam edin.
3. Bunun için, tarafsız bir sağ astar L2H-UMSBSP-R1, herhangi bir hedefi yükseltmek için Ekson1 dışındaki bölgeyi büyütmek üzere tasarlanmıştır.
4. Hedef diziyi PAM tanıma dizilerine yakın bir şekilde yükseltmek için sgRNA ile aynı diziye sahip önyargılı bir sol primer L2H-BMSBSP-F1 tasarlayın.
   NOT: PCR'nin çok yüksek katı koşullarında, ürün mutasyona uğramamış klonlarda jel üzerinde gözlenecektir. CRISPR-nakavt klonlarında, PAM tanıma dizilerinin yukarı akışına yakın mutasyonlar sergileyen hiçbir ürün gözlenmeyecektir.
5. Tek baz çifti mutasyonlarını haritalamak için, PCR, L2HGDH'nin tüm ekzon 1'ini kapsayan 468 bp'lik bir diziyi çoğaltır ve Sanger dizilemesine ve ardından clustalw⁸ kullanılarak çoklu dizi hizalama analizine tabi tutulur.

4. hESC-farklılaşma ve embriyoid cisim (EB) oluşumu testi

1. Daha önce ikili smad inhibisyon yöntemi ^9,10,11 kullanılarak tarif edildiği gibi yerleşik protokolleri izleyerek nöro-ektoderm kaderine doğru kontrol ve hESC'lerin (H9) farklı CRISPR klonlarının yönlendirilmiş farklılaşması ile devam edin.
2. % 90 birleşme durumunda, hücreleri% 100 KSR ortamında ilk 24 saat boyunca LDN193189 (200 nM) ve SB431542 (10 μM) ile tedavi edin ve ardından 939 gün daha XAV2 (2 μM) ekleyin.
3. 3 gün sonra, KSR ortamının yüzdesini azaltın (% 15 (h / v) KSR,% 1 (h / v) L-glutamin,% 1 (h / v) P / S,% 1 (h / v) 10 mM MEM ve% 0.1 (h / h) 2-merkaptoetanol (% 75,% 50,% 25) ile N2 ortamı (1x N2 takviyesi ile desteklenmiş DMEM / F12, 1x P / S, ) 8 günlük bir süre içinde %100 N2 ortamına.
4. 12. Günün başında, nöro-ektoderm belirteci olarak PAX6 kullanarak hücreleri immün boyama için düzeltin.
5. Mezoderm ve endodermal kader belirleme çalışmaları için, önceki yayınlarda açıklanan küçük molekül CHIR99021 tabanlı bir yaklaşım kullanın^12,13.
6. Bunun için, hücreler% 70 birleşmeye ulaştığında, 24 saat boyunca Kesin Endoderm (DE) ortamında 3 μM CHIR99021 ile tedavi edin ve ardından mezoderme özgü belirteç olarak Brachuary kullanarak immünoboyama için fiksasyon yapın.
7. Endodermal aşama için, FOXA2 kullanarak immün boyama için fiksasyon yapmadan önce hücreleri CHIR99021 ilavesi olmadan sadece DE ortamında 24 saat daha kültürleyin.
8. EB oluşum testi için, mikrografları almadan önce 24 saat boyunca süspansiyon koşulları altında hücreleri kültürlemek için Matrigel kullanmadan hücreleri düşük bağlı hücre yüzeylerine tohumlayın.

5. Batı lekesi analizi

1. Hücreleri PBS kullanarak iki kez yıkayın ve %1 SDS içeren 1x RIPA tamponu ve 1x proteaz ve fosfataz inhibitör kokteyli kullanarak parçalayın.
2. Lizatları 4 ° C'de 10 dakika boyunca 16.000 x g'da santrifüjleme ve ardından süpernatanların toplanmasıyla temizleyin.
3. Üreticinin talimatlarını izleyerek BCA protein tahlil kitini kullanarak toplam hücre proteinini ölçün. 4 × yüklemeli boya numune tamponu kullanarak numuneleri 2 μg/μL'ye ayarlayın.
4. Protein numunelerini 10 dakika boyunca 70 ° C'de denatüre edin, her numuneden eşit miktarda yükleyin ve% 4 -% 12 gradyan SDS-PAGE jelleri⁷ kullanarak çözün ve ardından 4 ° C'de 1 saat boyunca 100 V'luk sabit bir voltajda PVDF membranına aktarın.
5. % 5 yağsız süt kullanarak zarları bloke edin ve rotasyonla gece boyunca 4 ° C'de birincil antikor seyreltmelerinde inkübe edin.
6. Daha sonra, membranları PBST tamponu kullanarak 5x yıkayın ve oda sıcaklığında 1 saat boyunca HRP konjuge uygun ikincil antikorlarda inkübe edin.
7. Membranları PBST 5x ile tekrar yıkayın, kemilüminesan substrat ile inkübe edin ve X-ışını filmleri kullanarak geliştirin.

6. İmmün boyama

1. Hücreleri P4 kuyu plakalarına tohumlayın ve hücrelerin yüzeylere düzgün bir şekilde bağlanmasını sağlamak için fiksasyondan önce en az 24 saat inkübe edin.
2. Ölü hücreleri ve ortam bileşenlerini çıkarmak için hücreleri 3 kez PBS ile yıkayın, ardından oda sıcaklığında 15 dakika boyunca% 4 PFA kullanarak fiksasyon yapın.
3. % 0.3 triton X-100 kullanarak hücreleri geçirgen hale getirin, ardından oda sıcaklığında 1 saat boyunca PBS'de% 2 BSA kullanarak% 2 BSA kullanarak spesifik olmayan bağlanmayı bloke edin.
4. Numuneleri, gece boyunca 4 ° C'de% 1 BSA içinde seyreltilmiş birincil antikorlarla (OCT4, NANOG, SOX2, KI67, PAX6, Brachuary, FOXA2) inkübe edin.
5. Hücreleri 3x PBS ile yıkayın ve oda sıcaklığında 1 saat boyunca% 1 BSA ile seyreltilmiş uygun ikincil antikorlarla (Keçi anti-fare 488, Keçi anti-tavşan 488, Keçi anti-fare 546, Keçi anti-tavşan 546) inkübe edin.
6. Son olarak, numuneleri PBS 3x ile yıkayın ve bir floresan mikroskobu kullanarak DAPI ve görüntü ile lekeleyin.

Sonuçlar

L2HGDH sgRNA'ların lentiCRISPRv2 puro'da klonlanması
lentiCRISPRv2 puro vektörü ticari olarak elde edildi (Malzeme Tablosuna bakınız) ve BsmB1 ile sindirildi, bu da 1.8 Kb'lik bir doldurma parçasının serbest bırakılmasıyla sonuçlandı. Şekil 2A'da gösterildiği gibi, vektörün tam bir sindirimi gözlendi. Her yapı için, altı klon, bir primer olarak ters sgRNA dizisi ve vektör dizisi içinden bir ileri ...

Tartışmalar

Bu çalışma, CRISPR-Cas9 teknolojisi aracılığıyla hESC'lerde yüksek verimli ve uygun maliyetli gen delesyonlarını mümkün kılan bir yöntemi standartlaştırmıştır. Bu yöntem, hESC enfeksiyonundan başlayarak tek hücreli klonal seçim ve yayılıma kadar 3-4 hafta içinde hESC'lerde L2HGDH geninin homozigot delesyonunu başarıyla sağlamıştır (Tablo 1). CRISPR-Cas9 aracılı gen manipülasyonları çoğu hücrede geçici transfeksiyonlarla elde edileb...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
2-MERCAPTOETHANOL	Invitrogen	31350010
38.5 mL, Sterile + Certified Free Open-Top Thinwall Ultra-Clear Tubes	Beckman Coulter	C14292
Accutase	Stem cell technologies	7920
bFGF Recombinant human	Invitrogen	PHG0261
Brachyury Rabbit mAb	Abclonal	A5078
BsmBI-v2	NEB	R0739S
chir99021	Tocris	4423/10
Corning Matrigel Basement Membrane Matrix, LDEV-free	Corning	354234
Cyclopamine	Stem cell technologies	72074
DMEM media	Invitrogen	11995073
DMEM NUTRIENT MIX F12	Invitrogen	11320033
DPBS w/o: Ca and Mg	PAN Biotech	P04-36500
Fetal bovie serum	Invitrogen	10270106
FoxA2/HNF3β	CST	8186
GAPDH (14C10) Rabbit mAb Antibody	CST	2118S
Gentle Cell Dissociation Reagent	Stem cell technologies	7174
HyClone Non Essential Amino Acids (NEAA) 100x Solution	GE healthcare	SH30238.01
Ki-67 (D3B5) Rabbit mAb	CST	9129
KnockOut Serum Replacement	Invitrogen	10828028
L GLUTAMINE, 100x	Invitrogen	2924190090
L2H-BMSBSP-F1	Macrogen		CGTGCGGGTTCGCGTCTGGG
L2HGDH Polyclonal antibody	Proteintech	15707-1-AP
L2HGDH-SgRNA1-F	Macrogen		CACCGCGTGCGG GTTCGCGTCTGGG
L2HGDH-SgRNA1-R	Macrogen		AAACCCCAGACGC GAACCCGCACGC
L2HGDH-SgRNA2-F	Macrogen		CACCGCCCGCGG GCTTTTCGCCGG
L2HGDH-SgRNA2-R	Macrogen		AAACCCGGCGAA AAGCCCGCGGGC
L2H-SeqF1	Macrogen		GCTAAAGAGCGC GGGTCCTCGG
L2H-SeqR1	Macrogen		GTGGACGGGTTG TTCAAAGCCAGAG
L2H-UMSBSP-R1	Macrogen		GTGGACGGGTTG TTCAAAGCCAGAG
LentiCRISPRv2	Addgene	52961
mTesR1 complete media	Stem cell technologies	85850
Nanog Antibody	CST	3580
NEUROBASAL MEDIUM 1x CTS	Invitrogen	A1371201
Neuropan 2 Supplement 100x	PAN Biotech	P07-11050
Neuropan 27 Supplement 50x	PAN Biotech	P07-07200
Oct-4 Antibody	CST	2750
Pax6 (D3A9V) XP Rabbit mAb	CST	60433
PENICILLIN STREPTOMYCIN SOL	Invitrogen	15140122
pMD2.G	Addgene	12259
Polybrene infection reagent	Sigma	TR1003- G
Polyethylenimine, branched	Sigma	408727
psPAX2.0	Addgene	12260
Puromycin	Invitrogen	A1113802
qPCR Lentivirus Titer Kit	Abm	LV900
Rock inhibitor Y-27632 dihydrochloride	Tocris	1254
SB 431542	Tocris	1614/10
Sox2 Antibody	CST	2748
Sucrose	Sigma	57-50-1
TRYPSIN .05% EDTA	Invitrogen	25300062
U6-459F	Macrogen		GAGGGCCTATT TCCCATGATTC
Wizard Genomic DNA Purification Kit	Promega	A1120
XAV 939	Tocris	3748/10