フィーダーフリー条件下で培養したヒト多能性幹細胞におけるCRISPR-Cas9媒介遺伝子欠失

要約

提示された方法は、高効率のレンチウイルス媒介遺伝子送達システムを使用して、L2HGDH遺伝子を標的とするsgRNAを安定的に発現するヒト胚性幹細胞(hESC)株H9におけるCRISPR媒介遺伝子ノックアウトの生成を説明するものです。

要約

ゲノム編集のためのCRISPR-Cas9システムは、幹細胞を含む哺乳類細胞の遺伝子機能研究に革命をもたらしました。しかし、この手法を特に多能性幹細胞に実用化するには、時間や労力がかかる、編集効率が低いなどの課題があります。ここでは、L2HGDH遺伝子のsgRNAを安定的に発現するヒト胚性幹細胞(hESC)系統において、高効率で安定したレンチウイルス媒介遺伝子送達システムを用いて、CRISPR媒介遺伝子ノックアウトを作製する方法について述べる。L2HGDH遺伝子のエクソン1を標的とするsgRNAを化学合成し、高効率な単一ベクター系でCas9とsgRNAの構成的発現を組み合わせたlentiCRISPR v2-puroベクターにクローニングすることで、hESC感染に対するレンチウイルス力価の高値とピューロマイシンによる安定選択を実現しました。ピューロマイシン選択細胞をさらに増殖させ、限定希釈法を用いて単一細胞クローンを得た。単一クローンを増殖させ、ウェスタンブロット分析を用いてL2HGDH発現を100%減少させることで確認されたように、L2HGDH遺伝子のホモ接合型ノックアウトクローンをいくつか取得しました。さらに、MSBSP-PCRを用いて、CRISPR変異部位を、選択したホモ接合クローンにおけるCas9のPAM認識配列の上流にマッピングした。正確な挿入/欠失を解析するためにサンガーシーケンシングを実施し、クローンの機能特性評価を行いました。この方法は、以前に報告された非ウイルス性遺伝子導入法と比較して、ホモ接合性欠失の割合が有意に高かった。このレポートはL2HGDH遺伝子に焦点を当てていますが、この堅牢で費用対効果の高いアプローチは、遺伝子機能研究のために多能性幹細胞の他の遺伝子のホモ接合ノックアウトを作成するために使用できます。

概要

ヒト胚性幹細胞(hESC)と人工多能性幹細胞(iPSC)は、体内のあらゆる細胞に分化する可能性を秘めた幹細胞です。これらの細胞は、ヒトの発生を研究するだけでなく、さまざまな疾患の根底にあるメカニズムを理解するための貴重なツールとして機能し、再生医療、疾患モデリング、および創薬に大きな期待を寄せています。このような研究には、特定の遺伝子が生物の発生、機能、および調節にどのように寄与しているかを調査することが含まれます^1,2。

遺伝子の機能を解読するために、遺伝子ノックアウトや過剰発現などの遺伝子操作やゲノム編集など、さまざまな手法やアプローチが用いられています。その中でも、CRISPR-Cas9技術は、遺伝子ノックアウトおよび遺伝子編集研究のための最も効率的なアプローチとして浮上しています^1,2,3。CRISPR-Cas9システムは、特定の目的のDNA配列を同定して結合するために特別に設計されたシングルガイドRNA(sgRNA)分子を利用して機能します。分子ガイドとして機能するsgRNAは、Cas9酵素を修飾が必要なゲノム内の正確な位置に導きます。結合すると、Cas9は指定された部位でDNAの二本鎖切断を開始します。DNAの切断に続いて、細胞の固有の修復メカニズムが活性化されます。これらには、非相同末端結合(NHEJ)と相同組換え修復(HDR)の2つの主要な修復経路が含まれます。NHEJはしばしば、切断部位に挿入または欠失(インデル)を引き起こし、遺伝子の破壊または不活性化につながります。逆に、HDRは、切断部位に新しいDNA配列を挿入することを可能にし、標的とした遺伝子改変の導入を容易にする⁴。

多能性幹細胞における遺伝子欠失の重要性を考慮して、hESC/iPSCにおけるCRISPR-Cas9を介した遺伝子ノックアウトに関するいくつかのプロトコルが発表されています。しかし、これらのプロトコルの多くは、非常に時間がかかり、労働集約的である、非ウイルス性遺伝子送達法の使用による効率が低いなど、大きな制限に直面しています⁵。これらの課題は、hESC/iPS細胞ではさらに顕著であり、これらの細胞は他の細胞タイプと比較して編集効率が低いことが知られています⁵。これらの制限の一部は、Cas9およびsgRNAを含むプラスミド導入の効率を高めることで対処できます。これは、レンチウイルスベクターシステムを使用して成功裏に達成でき、遺伝子編集の結果を大幅に改善できます。レンチウイルスのパッケージングプロトコルは確立されており、わかりやすいため、経験の浅い研究者でも研究室で簡単に採用できます。レンチウイルスは、hESCやiPS細胞など、さまざまな細胞種で高い感染効率を示します。したがって、Cas9-sgRNA発現にレンチウイルスシステムを利用することは、遺伝子機能研究のためのhESC/iPS細胞の日常的な遺伝子編集実験に最適です。

ここでは、従来のプロトコルよりも比較的短い時間で、hESCの高効率CRISPR-Cas9ベースの遺伝子欠失のためのシンプルでわかりやすい方法を提供します(図1)。Cas9とsgRNAを構成的に発現するレンチウイルスベクターが使用されてきましたが、Cas9の発現を制御するために、薬物誘導性のCas9発現に簡単に置き換えることができます。

プロトコル

本研究で使用した遺伝子配列、試薬、および機器の詳細は、 資料表に記載されています。

1. シングルガイドRNA(sgRNA)の設計、クローニング、レンチウイルスベクターの作製

注: L2HGDH 遺伝子のエクソン1を標的とする2つの異なるsgRNA配列は、どちらもQiuら⁶から適応され、それぞれ配列1および2のAGGおよびTGGのPAM部位が使用される。両方のsgRNAの長さは20 bpで、末端を修飾して、前の報告⁶で説明したように、制限酵素Bsmb1を標的ベクター(LentiCRISPRv2)にクローニングするためのリンカー配列を追加しました。リンカー配列は、クローニングを目的としたsgRNAの設計中に追加されました。

1. アニール化学合成されたsgRNA6およびクローンを、^{以前に報告された}7と同様に最適化されたプロトコルを使用してBsmb1シングルカットレンチウイルスベクター、LentiCRISPRv2に作製します。
2. 標準化および最適化されたプロトコール⁷を使用して、レンチウイルスのパッケージングと濃縮を進めます。
3. レンチウイルスの作製には、DMEM、10% FBS、1x ペニシリン/ストレプトマイシン(P/S)を使用してHEK293T細胞(1 × 10⁵ 細胞/cm²)を播種し、湿度の高い条件下で5%_CO2 の雰囲気下、37°Cの組織培養インキュベーターで一晩インキュベートします。
4. 90%がコンフルエントな場合^{、エントリーベクター}(エンプティバックボーンまたはsgRNA発現プラスミド)およびパッケージングプラスミドとHEK293T細胞を共トランスフェクションし、前述のように低コストのカチオン性ポリマーPEIを使用します7。
5. トランスフェクション後48時間および72時間でレンチウイルス上清(LVS)粒子を含む馴化培地を回収し、ショ糖クッションを使用して超遠心分離を進め、チューブを1,25,000 x g で4°Cで2時間回転させます。
6. LVS粒子濃度をPBS中の元の容量の少なくとも200倍まで進め、分量し、使用するまで-80°Cで保存します。
7. レンチウイルス粒子の力価を測定するには、製造元の指示に従ってqPCR レンチウイルス力価キットを使用します( 材料の表を参照)。

2. レンチウイルス感染と単一細胞クローン増殖

1. LVS粒子による感染の場合、500 μLの培地に完全なマトリゲル(1:50)コーティングされたP24ウェルプレートに1 × 10⁵ 細胞/0.5 mLのhESC培養培地(基礎培地+ P / S + 10 μMのRock Inhibitor)を1個10個入れたhESC(H9)細胞懸濁液をシードし、細胞が接着するまで一晩インキュベートします。LVSに感染しないが、ピューロマイシンで処理された追加のウェルを播種して、非感染コントロールとして機能します。
   注:細胞カウントは、手動血球計算盤または自動セルカウンターを使用して実行できます。
2. 翌日、感染の多重度(MOI)が10の細胞に8μg/mLのポリブレンを感染させ、37°Cで8時間インキュベートした後、培地を新鮮なhESC培地+ Rock InhibitorなしのP/Sで交換し、細胞が90%コンフルエントになるまで培養を続けます。
3. 細胞が90%の密度(通常は感染後48〜72時間)に達したときに、培地に0.8 μg/mL濃度のピューロマイシンを補充してピューロマイシンの選択を開始し、非感染細胞(対照群)ですべての細胞が死ぬまで選択を続けます。
4. 選択が完了したら(通常は4〜6日)、安定細胞を分割し(1:4)、凍結保存とさらなる分析のために増殖します。
5. L2HGDH-sgRNA-1を発現する細胞を用いて、シングルセル選択とクローン増殖を行う⁶.
6. この目的のために、500細胞/10 mLの完全増殖培地に相当する細胞懸濁液を調製し、この懸濁液100 μLを96ウェルプレートの各ウェルに播種します。
7. 細胞を3日間放置してから観察します。
8. シングルクローンを生成するウェルをマークし、コロニーがさらに拡大、凍結保存、および分析するのに十分なサイズ(通常は2週間)に達するまで、1日おきに培地を交換します。

3. gDNA抽出、MS-BSP PCR、サンガーシーケンシング

1. 製造元の指示に従って、ゲノムDNA単離キットを使用して細胞からgDNAを単離します( 材料の表を参照)。
2. Mutation Sites Based Specific Primers(MS-BSP)解析⁸を使用して、PAM認識配列の上流の変異部位のマッピングを進めます。
3. このため、偏りのない右プライマーL2H-UMSBSP-R1は、エクソン1の外側の領域を増幅して任意のターゲットを増幅するように設計されています。
4. sgRNAと同一の配列を持つバイアスレフトプライマーL2H-BMSBSP-F1を設計し、PAM認識配列に近いターゲット配列を増幅します。
   注:PCRの非常に高いストリンジェントな条件下では、生成物は変異していないクローンのゲル上で観察されます。PAM認識配列の上流付近に変異を示すCRISPRノックアウトクローンでは、生成物は観察されません。
5. 一塩基対変異をマッピングするために、PCRは L2HGDH の全エクソン1にまたがる468 bp配列を増幅し、サンガーシーケンシングに続いてclustalw⁸を用いたマルチシーケンスアライメント解析を行います。

4. hESC分化と胚様体(EB)形成アッセイ

1. デュアルSMAD阻害法^9,10,11を使用して以前に説明したように確立されたプロトコルに従って、神経外胚葉の運命に向けたhESC(H9)のコントロールおよび異なるCRISPRクローンの指向性分化を進めます。
2. 90%のコンフルエント度で、細胞をLDN193189(200 nM)およびSB431542(10 μM)で最初の24時間100% KSR培地で処理し、その後XAV939(2 μM)をさらに2日間添加します。
3. 3日後、N2培地(DMEM/F12に1x N2サプリメント、1x P/S、1x P/S、1%(v/v)10 mM MEM、および0.1%(v/v)2-メルカプトエタノール(75%、50%、25%)を添加したノックアウトDMEM)の割合を減らします。)を 8 日間かけて 100% N2 培地に注入します。
4. 12日目の開始時に、PAX6を神経外胚葉マーカーとして使用して免疫染色のために細胞を固定します。
5. 中胚葉および内胚葉の運命決定研究では、以前の出版物^12,13で説明されている低分子CHIR99021ベースのアプローチを採用します。
6. このためには、細胞が70%のコンフルエント度に達したら、Definitive Endoderm(DE)培地で3 μMのCHIR99021で24時間処理した後、Brachuaryを中胚葉特異的マーカーとして使用して免疫染色を固定します。
7. 内胚葉期では、FOXA2を使用して免疫染色のために固定する前に、CHIR99021を添加せずにDE培地のみでさらに24時間細胞を培養します。
8. EB形成アッセイでは、顕微鏡写真を撮る前に、マトリゲルを使用せずに細胞を懸濁条件下で24時間培養せずに、低接着細胞表面に細胞を播種します。

5. ウェスタンブロット解析

1. PBSを使用して細胞を2回洗浄し、1% SDSおよび1xプロテアーゼおよびホスファターゼ阻害剤カクテルを含む1x RIPAバッファーを使用して溶解します。
2. ライセートを16,000 x g で4°Cで10分間遠心分離し、その後上清を回収します。
3. 製造元の指示に従って、BCAタンパク質アッセイキットを使用して全細胞タンパク質を定量します。4×ローディング色素サンプルバッファーを使用して、サンプルを2 μg/μLに調整します。
4. タンパク質サンプルを70°Cで10分間変性させ、各サンプルを等量ロードし、4%-12%グラジエントSDS-PAGEゲル⁷ を使用して分離し、続いて100Vの定電圧で4°Cで1時間PVDFメンブレンに移します。
5. 5%脱脂乳を使用してメンブレンをブロックし、一次抗体希釈液中で4°Cで一晩、回転しながらインキュベートします。
6. 次に、PBSTバッファーを使用してメンブレンを5回洗浄し、HRP標識した適切な二次抗体で室温で1時間インキュベートします。
7. メンブレンをPBST 5xで再度洗浄し、化学発光基質とインキュベートし、X線フィルムを使用して現像します。

6. 免疫染色

1. P4ウェルプレートに細胞を播種し、固定前に少なくとも24時間インキュベートして、細胞が表面に適切に付着できるようにします。
2. 細胞をPBSで3回洗浄して、死んだ細胞と培地成分を除去し、続いて4%PFAを使用して室温で15分間固定します。
3. 0.3% triton X-100を使用して細胞を透過処理し、続いてPBS中の2% BSAを室温で1時間使用して非特異的結合をブロッキングします。
4. サンプルを一次抗体(OCT4、NANOG、SOX2、KI67、PAX6、Brachuary、FOXA2)と1% BSAで希釈し、4°Cで一晩インキュベートします。
5. 細胞をPBSで3回洗浄し、適切な二次抗体(ヤギ抗マウス488、ヤギ抗ウサギ488、ヤギ抗マウス546、ヤギ抗ウサギ546、ヤギ抗ウサギ546)と1%BSAで希釈し、室温で1時間インキュベートします。
6. 最後に、サンプルをPBS 3xで洗浄し、DAPIで対比染色し、蛍光顕微鏡を使用して画像化します。

結果

lentiCRISPRv2ピューロにおけるL2HGDH sgRNAのクローニング
lentiCRISPRv2ピューロベクターを市販で入手し( 「Table of Materials」を参照)、BsmB1で消化した結果、1.8 Kbのスタッファーフラグメントが放出されました。 図2Aに示すように、ベクターの完全な消化が観察されました。各コンストラクトについて、リバースsgRNA配列をプラ?...

ディスカッション

この研究では、CRISPR-Cas9技術を通じて、hESCの遺伝子欠失を高効率かつ費用対効果の高い方法で実現する方法を標準化しました。この方法は、hESCの感染からシングルセルクローンの選択と増殖まで、3〜4週間以内にhESCのL2HGDH遺伝子のホモ接合性欠失を達成することに成功しました(表1)。CRISPR-Cas9を介した遺伝子操作は、ほとんどの細胞で一過性トランスフ?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
2-MERCAPTOETHANOL	Invitrogen	31350010
38.5 mL, Sterile + Certified Free Open-Top Thinwall Ultra-Clear Tubes	Beckman Coulter	C14292
Accutase	Stem cell technologies	7920
bFGF Recombinant human	Invitrogen	PHG0261
Brachyury Rabbit mAb	Abclonal	A5078
BsmBI-v2	NEB	R0739S
chir99021	Tocris	4423/10
Corning Matrigel Basement Membrane Matrix, LDEV-free	Corning	354234
Cyclopamine	Stem cell technologies	72074
DMEM media	Invitrogen	11995073
DMEM NUTRIENT MIX F12	Invitrogen	11320033
DPBS w/o: Ca and Mg	PAN Biotech	P04-36500
Fetal bovie serum	Invitrogen	10270106
FoxA2/HNF3β	CST	8186
GAPDH (14C10) Rabbit mAb Antibody	CST	2118S
Gentle Cell Dissociation Reagent	Stem cell technologies	7174
HyClone Non Essential Amino Acids (NEAA) 100x Solution	GE healthcare	SH30238.01
Ki-67 (D3B5) Rabbit mAb	CST	9129
KnockOut Serum Replacement	Invitrogen	10828028
L GLUTAMINE, 100x	Invitrogen	2924190090
L2H-BMSBSP-F1	Macrogen		CGTGCGGGTTCGCGTCTGGG
L2HGDH Polyclonal antibody	Proteintech	15707-1-AP
L2HGDH-SgRNA1-F	Macrogen		CACCGCGTGCGG GTTCGCGTCTGGG
L2HGDH-SgRNA1-R	Macrogen		AAACCCCAGACGC GAACCCGCACGC
L2HGDH-SgRNA2-F	Macrogen		CACCGCCCGCGG GCTTTTCGCCGG
L2HGDH-SgRNA2-R	Macrogen		AAACCCGGCGAA AAGCCCGCGGGC
L2H-SeqF1	Macrogen		GCTAAAGAGCGC GGGTCCTCGG
L2H-SeqR1	Macrogen		GTGGACGGGTTG TTCAAAGCCAGAG
L2H-UMSBSP-R1	Macrogen		GTGGACGGGTTG TTCAAAGCCAGAG
LentiCRISPRv2	Addgene	52961
mTesR1 complete media	Stem cell technologies	85850
Nanog Antibody	CST	3580
NEUROBASAL MEDIUM 1x CTS	Invitrogen	A1371201
Neuropan 2 Supplement 100x	PAN Biotech	P07-11050
Neuropan 27 Supplement 50x	PAN Biotech	P07-07200
Oct-4 Antibody	CST	2750
Pax6 (D3A9V) XP Rabbit mAb	CST	60433
PENICILLIN STREPTOMYCIN SOL	Invitrogen	15140122
pMD2.G	Addgene	12259
Polybrene infection reagent	Sigma	TR1003- G
Polyethylenimine, branched	Sigma	408727
psPAX2.0	Addgene	12260
Puromycin	Invitrogen	A1113802
qPCR Lentivirus Titer Kit	Abm	LV900
Rock inhibitor Y-27632 dihydrochloride	Tocris	1254
SB 431542	Tocris	1614/10
Sox2 Antibody	CST	2748
Sucrose	Sigma	57-50-1
TRYPSIN .05% EDTA	Invitrogen	25300062
U6-459F	Macrogen		GAGGGCCTATT TCCCATGATTC
Wizard Genomic DNA Purification Kit	Promega	A1120
XAV 939	Tocris	3748/10