CRISPR-Cas9-vermittelte Gendeletion in humanen pluripotenten Stammzellen, die unter feederfreien Bedingungen kultiviert wurden

Zusammenfassung

Die vorgestellte Methode beschreibt die Erzeugung eines CRISPR-vermittelten Gen-Knockouts in der humanen embryonalen Stammzelllinie (hESC) H9, die sgRNAs, die auf das L2HGDH-Gen abzielen, unter Verwendung eines hocheffizienten lentiviralen Gentransfersystems stabil exprimiert.

Zusammenfassung

Das CRISPR-Cas9-System für die Genom-Editierung hat die Genfunktionsstudien in Säugetierzellen, einschließlich Stammzellen, revolutioniert. Die praktische Anwendung dieser Technik, insbesondere bei pluripotenten Stammzellen, bringt jedoch einige Herausforderungen mit sich, wie z. B. die zeit- und arbeitsintensive und geringe Editierungseffizienz. Hier beschreiben wir die Erzeugung eines CRISPR-vermittelten Gen-Knockouts in einer humanen embryonalen Stammzelllinie (hESC), die sgRNAs für das L2HGDH-Gen stabil exprimiert, unter Verwendung eines hocheffizienten und stabilen lentiviralen Gentransfersystems. Die sgRNAs, die auf das Exon 1 des L2HGDH-Gens abzielen, wurden chemisch synthetisiert und in den lentiCRISPR v2-puro-Vektor kloniert, der die konstitutive Expression von sgRNAs mit Cas9 in einem hocheffizienten Einzelvektorsystem kombiniert, um höhere lentivirale Titer für hES-Infektionen und eine stabile Selektion mit Puromycin zu erreichen. Puromycin-selektierte Zellen wurden weiter expandiert, und Einzelzellklone wurden unter Verwendung der Methode der begrenzten Verdünnung erhalten. Die einzelnen Klone wurden expandiert, und es wurden mehrere homozygote Knockout-Klone für das L2HGDH-Gen erhalten, was durch eine 100%ige Reduktion der L2HGDH-Expression mittels Western-Blot-Analyse bestätigt wurde. Darüber hinaus wurde mittels MSBSP-PCR die CRISPR-Mutationsstelle stromaufwärts der PAM-Erkennungssequenz von Cas9 in den ausgewählten homozygoten Klonen kartiert. Es wurde eine Sanger-Sequenzierung durchgeführt, um die genauen Insertionen/Deletionen zu analysieren, und es wurde eine funktionelle Charakterisierung der Klone durchgeführt. Diese Methode erzeugte einen signifikant höheren Prozentsatz an homozygoten Deletionen im Vergleich zu zuvor berichteten nicht-viralen Gentransfermethoden. Obwohl sich dieser Bericht auf das L2HGDH-Gen konzentriert, kann dieser robuste und kostengünstige Ansatz verwendet werden, um homozygote Knockouts für andere Gene in pluripotenten Stammzellen für Genfunktionsstudien zu erzeugen.

Einleitung

Humane embryonale Stammzellen (hESCs) und induzierte pluripotente Stammzellen (iPSCs) sind Stammzellen mit dem Potenzial, sich in alle Zelltypen des Körpers zu differenzieren. Diese Zellen dienen als wertvolle Werkzeuge für die Erforschung der menschlichen Entwicklung sowie für das Verständnis der zugrunde liegenden Mechanismen verschiedener Krankheiten und sind somit ein enormes Versprechen für die regenerative Medizin, die Modellierung von Krankheiten und die Wirkstoffforschung. In solchen Studien wird untersucht, wie bestimmte Gene zur Entwicklung, Funktion und Regulation von Organismen beitragen ^1,2.

Um die Funktion von Genen zu entschlüsseln, werden verschiedene Techniken und Ansätze eingesetzt, darunter genetische Manipulationen wie Gen-Knockout oder -Überexpression und Genom-Editing. Unter diesen hat sich die CRISPR-Cas9-Technologie als der effizienteste Ansatz für Gen-Knockout- und Gen-Editing-Studien erwiesen ^1,2,3. Das CRISPR-Cas9-System funktioniert mit der Verwendung eines einzigen Guide-RNA (sgRNA)-Moleküls, das speziell entwickelt wurde, um eine bestimmte DNA-Sequenz von Interesse zu identifizieren und an sie zu binden. Die sgRNA fungiert als molekularer Leitfaden und leitet das Cas9-Enzym genau an die Stelle im Genom, die modifiziert werden muss. Einmal gebunden, initiiert Cas9 einen doppelsträngigen Bruch in der DNA an der angegebenen Stelle. Nach der Spaltung der DNA werden die zelleigenen Reparaturmechanismen aktiviert. Dazu gehören zwei Hauptreparaturwege: die nicht-homologe Endverbindung (NHEJ) und die homologiegerichtete Reparatur (HDR). NHEJ führt häufig zu Insertionen oder Deletionen (Indels) an der Bruchstelle, was zu einer Störung oder Inaktivierung des Gens führt. Umgekehrt ermöglicht HDR das Einfügen neuer DNA-Sequenzen an der Bruchstelle, was die Einführung gezielter genetischer Veränderungen erleichtert⁴.

Angesichts der Bedeutung von Gendeletionen in pluripotenten Stammzellen wurden mehrere Protokolle zu CRISPR-Cas9-vermittelten Gen-Knockouts in hESCs/iPSCs veröffentlicht. Viele dieser Protokolle sind jedoch mit erheblichen Einschränkungen konfrontiert, z. B. sind sie extrem zeitaufwändig, arbeitsintensiv und haben aufgrund der Verwendung nicht-viraler Genverabreichungsmethoden eine geringe Effizienz⁵. Diese Herausforderungen sind bei hESCs/iPSCs noch ausgeprägter, da diese Zellen bekanntermaßen im Vergleich zu anderen Zelltypen eine geringere Editierungseffizienz aufweisen⁵. Einige dieser Einschränkungen können durch eine Erhöhung der Effizienz der Plasmidabgabe, die Cas9 und sgRNAs enthält, behoben werden. Dies kann erfolgreich mit einem lentiviralen Vektorsystem erreicht werden, das die Ergebnisse der Geneditierung erheblich verbessern kann. Die Verpackungsprotokolle für Lentiviren sind gut etabliert und unkompliziert und ermöglichen eine einfache Anwendung in Laboren, selbst von Forschern mit begrenzter Erfahrung. Lentiviren weisen eine hohe Infektionseffizienz bei verschiedenen Zelltypen auf, einschließlich hES-Zellen und iPS-Zellen. Daher ist die Verwendung eines lentiviralen Systems für die Cas9-sgRNA-Expression ideal für routinemäßige Gen-Editing-Experimente in hESCs/iPSCs für Genfunktionsstudien.

Hier stellen wir eine einfache und unkomplizierte Methode für hocheffiziente CRISPR-Cas9-basierte Gendeletionen in hES-Zellen in einer vergleichsweise kürzeren Zeitdauer als herkömmliche Protokolle zur Verfügung (Abbildung 1). Obwohl ein lentiviraler Vektor mit konstitutiver Expression von Cas9 und sgRNA verwendet wurde, könnte er leicht durch eine medikamenteninduzierbare Cas9-Expression für eine kontrollierbare Cas9-Expression ersetzt werden.

Protokoll

Die Einzelheiten zu den in dieser Studie verwendeten Gensequenzen, Reagenzien und Geräten sind in der Materialtabelle aufgeführt.

1. Design der Single Guide RNA (sgRNA), Klonierung und Produktion lentiviraler Vektoren

HINWEIS: Es werden zwei verschiedene sgRNA-Sequenzen verwendet, die auf das Exon 1 des L2HGDH-Gens abzielen und beide von Qiu et ^al.6mit PAM-Stellen von AGG und TGG für die Sequenzen 1 bzw. 2 adaptiert wurden. Beide sgRNAs waren 20 bp lang, und die Enden wurden modifiziert, um Linkersequenzen für das Restriktionsenzym Bsmb1 hinzuzufügen, das im Zielvektor (LentiCRISPRv2) kloniert werden soll, wie im vorherigen Bericht⁶ beschrieben. Linkersequenzen wurden während des Designs von sgRNAs für Klonierungszwecke hinzugefügt.

1. Anneal synthetisierte chemisch synthetisierte sgRNAs⁶ und klonierte in den Bsmb1-Single-Cut-lentiviralen Vektor, LentiCRISPRv2, unter Verwendung eines optimierten Protokolls, wie zuvor berichtet⁷.
2. Fahren Sie mit der lentiviralen Verpackung und Konzentration unter Verwendung eines standardisierten und optimierten Protokolls^{fort 7}.
3. Für die Lentivirus-Produktion HEK293T Zellen (1 × 10⁵ Zellen/cm²) mit DMEM, 10 % FBS und 1x Penicillin/Streptomycin (P/S) säen und über Nacht in einem Gewebekultur-Inkubator bei 37 °C bei einer Atmosphäre von 5 % CO₂ unter feuchten Bedingungen inkubieren.
4. Wenn 90 % konfluent sind, co-transfizieren HEK293T Zellen mit Eintrittsvektor (leeres Rückgrat oder sgRNA-exprimierende Plasmide) und Verpackungsplasmiden unter Verwendung des kostengünstigen kationischen Polymers PEI, wie zuvor beschrieben⁷.
5. Sammeln Sie die konditionierten Medien, die Partikel des lentiviralen Überstands (LVS) enthalten, 48 h und 72 h nach der Transfektion, fahren Sie mit der Ultrazentrifugation unter Verwendung eines Saccharosekissens fort und drehen Sie die Röhrchen 2 h lang bei 4 °C bei 1,25,000 x g .
6. Fahren Sie mit der LVS-Partikelkonzentration auf mindestens das 200-fache des ursprünglichen Volumens in PBS fort, aliquotieren Sie es und lagern Sie es bis zur Verwendung bei -80 °C.
7. Bestimmen Sie den Titer von lentiviralen Partikeln mit dem qPCR Lentivirus Titer Kit gemäß den Anweisungen des Herstellers (siehe Materialtabelle).

2. Lentivirale Infektionen und einzellige klonale Vermehrung

1. Bei Infektionen mit LVS-Partikeln wird eine hESC (H9)-Zellsuspension mit 1 × 10⁵ Zellen/0,5 ml hESC-Kulturmedium (Basalmedium + P/S + 10 μM Rock-Inhibitor) auf vollständigen, mit Matrigel (1:50) beschichteten P24-Well-Platten in 500 μl Medium geseedet und über Nacht inkubiert, damit sich die Zellen anheften können. Säen Sie zusätzliche Vertiefungen aus, die nicht mit LVS infiziert, aber mit Puromycin behandelt werden, um als nicht infizierte Kontrolle zu dienen.
   HINWEIS: Die Zellzählung kann mit einem manuellen Hämozytometer oder einem automatisierten Zellzähler durchgeführt werden.
2. Am nächsten Tag infizieren Sie die Zellen bei einer Multiplizität der Infektion (MOI) von 10 zusammen mit 8 μg/ml Polybren und inkubieren Sie 8 h lang bei 37 °C, gefolgt von einem Medienaustausch mit frischem hESC-Medium + P/S ohne Rock-Inhibitor und setzen Sie die Kultivierung fort, bis die Zellen zu 90 % konfluiert sind.
3. Beginnen Sie die Puromycin-Selektion, indem Sie das Medium mit einer Konzentration von 0,8 μg/ml Puromycin ergänzen, wenn die Zellen eine Konfluenz von 90 % erreichen, was normalerweise 48-72 Stunden nach der Infektion der Fall ist, und setzen Sie die Selektion fort, bis alle Zellen in den nicht infizierten Zellen (Kontrollgruppe) absterben.
4. Nachdem die Selektion abgeschlossen ist (in der Regel 4-6 Tage), teilen Sie stabile Zellen (1:4) und expandieren Sie sie für die Kryokonservierung und weitere Analyse.
5. Führen Sie eine Einzelzellselektion und klonale Expansion mit Zellen durch, die L2HGDH-sgRNA-1^{exprimieren 6}.
6. Zu diesem Zweck wird eine Zellsuspension hergestellt, die 500 Zellen/10 ml vollständiges Wachstumsmedium entspricht, und 100 μl dieser Suspension in jede Vertiefung einer 96-Well-Platte aussäen.
7. Lassen Sie die Zellen 3 Tage lang ungestört und beobachten Sie dann.
8. Markieren Sie die Vertiefungen, die einzelne Klone liefern, und wechseln Sie das Medium jeden zweiten Tag, bis eine ausreichende Größe erreicht ist, damit die Kolonien (normalerweise 2 Wochen) weiter expandieren, kryokonservieren und analysieren können.

3. gDNA-Extraktion, MS-BSP PCR und Sanger-Sequenzierung

1. Isolieren Sie gDNA aus Zellen mit dem genomischen DNA-Isolationskit gemäß den Anweisungen des Herstellers (siehe Materialtabelle).
2. Fahren Sie mit der Kartierung der Mutationsstellen vor den PAM-Erkennungssequenzen mit Hilfe der MS-BSP-Analyse (Mutation Sites Based Specific Primers) fort⁸.
3. Zu diesem Zweck wurde ein unvoreingenommener rechter Primer L2H-UMSBSP-R1 entwickelt, um den Bereich außerhalb des Exon1 zu amplifizieren, um beliebige Ziele zu amplifizieren.
4. Entwerfen Sie einen verzerrten linken Primer L2H-BMSBSP-F1 mit einer identischen Sequenz wie sgRNA, um die Zielsequenz nahe an PAM-Erkennungssequenzen zu amplifizieren.
   HINWEIS: Bei sehr hohen strengen PCR-Bedingungen wird das Produkt bei nicht mutierten Klonen auf dem Gel beobachtet. In CRISPR-Knockout-Klonen, die Mutationen nahe dem Upstream der PAM-Erkennungssequenzen aufwiesen, wurde kein Produkt beobachtet.
5. Um Mutationen einzelner Basenpaare zu kartieren, wird eine PCR-Amplifikation einer 468 bp-Sequenz, die das gesamte Exon 1 von L2HGDH umfasst, einer Sanger-Sequenzsequenzierung unterzogen, gefolgt von einer Multiple-Sequenz-Alignment-Analyse mit clustalw⁸.

4. Assay zur hES-Differenzierung und zur Bildung des Embryoidkörpers (EB)

1. Fahren Sie mit der gerichteten Differenzierung der Kontroll- und verschiedenen CRISPR-Klone von hESCs (H9) in Richtung Neuroektodermschicksal fort, indem Sie etablierten Protokollen folgen, wie zuvor unter Verwendung der dualen smad-Hemmmethode^{beschrieben 9,10,11}.
2. Bei einer Konfluenz von 90 % werden die Zellen zunächst 24 Stunden lang mit LDN193189 (200 nM) und SB431542 (10 μM) in 100 % KSR-Medien behandelt, gefolgt von der Zugabe von XAV939 (2 μM) für weitere 2 Tage.
3. Reduzieren Sie nach 3 Tagen den Anteil an KSR-Medien (Knockout-DMEM, ergänzt mit 15 % (v/v) KSR, 1 % (v/v) L-Glutamin, 1 % (v/v) P/S, 1 % (v/v) 10 mM MEM und 0,1 % (v/v) 2-Mercaptoethanol (75 %, 50 %, 25 %) durch Kombination mit N2-Medien (DMEM/F12 ergänzt mit 1x N2-Supplement, 1x P/S, ) über einen Zeitraum von 8 Tagen auf 100 % N2-Medien übertragen.
4. Zu Beginn von Tag 12 fixieren Sie die Zellen für die Immunfärbung mit PAX6 als Neuroektodermmarker.
5. Für Studien zur Bestimmung des Mesoderms und des endodermalen Schicksals ist ein auf CHIR99021 kleiner Moleküle basierender Ansatz zu verwenden, der in früheren Veröffentlichungen^{beschrieben wurde 12,13}.
6. Wenn die Zellen eine Konfluenz von 70 % erreichen, wird sie 24 h lang mit 3 μM CHIR99021 in definitiven Endodermmedien (DE) behandelt, gefolgt von einer Fixierung zur Immunfärbung mit Brachuary als Mesoderm-spezifischem Marker.
7. Für das endodermale Stadium werden die Zellen für weitere 24 Stunden ohne Zusatz von CHIR99021 in DE-Medien kultiviert, bevor sie für die Immunfärbung mit FOXA2 fixiert werden.
8. Für den EB-Formationsassay säen Sie die Zellen auf Zelloberflächen mit geringer Adhäsion ohne Matrigel aus, um die Zellen 24 Stunden lang unter Suspensionsbedingungen zu kultivieren, bevor Sie Mikroskopaufnahmen machen.

5. Western-Blot-Analyse

1. Waschen Sie die Zellen zweimal mit PBS und lysieren Sie sie mit 1x RIPA-Puffer mit 1% SDS und 1x Protease- und Phosphatasehemmer-Cocktail.
2. Die Lysate werden durch Zentrifugation bei 16.000 x g für 10 min bei 4 °C gereinigt, gefolgt von der Sammlung der Überstände.
3. Quantifizieren Sie das Gesamtzellprotein mit dem BCA-Protein-Assay-Kit gemäß den Anweisungen des Herstellers. Stellen Sie die Proben auf 2 μg/μl mit 4 × Füllstoffpuffer ein.
4. Denaturieren Sie die Proteinproben 10 Minuten lang bei 70 °C, laden Sie gleiche Mengen jeder Probe und lösen Sie sie mit SDS-PAGE-Gelen mit einem Gradienten von 4 %^bis 12 % auf, gefolgt von der Übertragung auf die PVDF-Membran bei einer konstanten Spannung von 100 V für 1 h bei 4 °C.
5. Blockieren Sie die Membranen mit 5 % fettfreier Milch und inkubieren Sie in primären Antikörperverdünnungen bei 4 °C über Nacht mit Rotation.
6. Anschließend werden die Membranen 5x mit PBST-Puffer gewaschen und 1 h bei Raumtemperatur in HRP-konjugierten Sekundärantikörpern inkubiert.
7. Die Membranen erneut mit PBST 5x waschen, mit chemilumineszierendem Substrat inkubieren und mit Röntgenfilmen entwickeln.

6. Immunfärbung

1. Säen Sie die Zellen auf P4-Well-Platten und inkubieren Sie sie mindestens 24 Stunden lang, bevor Sie fixiert werden, um eine ordnungsgemäße Anheftung der Zellen an Oberflächen zu ermöglichen.
2. Waschen Sie die Zellen 3x mit PBS, um abgestorbene Zellen sowie Medienbestandteile zu entfernen, gefolgt von einer Fixierung mit 4% PFA für 15 Minuten bei Raumtemperatur.
3. Permeabilisieren Sie die Zellen mit 0,3 % Triton X-100, gefolgt von einer Blockierung für unspezifische Bindung durch Verwendung von 2 % BSA in PBS für 1 h bei Raumtemperatur.
4. Die Proben werden mit Primärantikörpern (OCT4, NANOG, SOX2, KI67, PAX6, Brachuary, FOXA2) inkubiert, die über Nacht bei 4 °C in 1 % BSA verdünnt werden.
5. Waschen Sie die Zellen 3x mit PBS und inkubieren Sie sie mit geeigneten Sekundärantikörpern (Ziege gegen Maus 488, Ziege gegen Kaninchen 488, Ziege gegen Maus 546, Ziege gegen Kaninchen 546), verdünnt in 1% BSA für 1 h bei Raumtemperatur.
6. Zum Schluss werden die Proben mit PBS 3x gewaschen und mit DAPI gegengefärbt und mit einem Fluoreszenzmikroskop abgebildet.

Ergebnisse

Klonierung von L2HGDH sgRNAs in lentiCRISPRv2 puro
Der lentiCRISPRv2 puro-Vektor wurde kommerziell gewonnen (siehe Materialtabelle) und mit BsmB1 verdaut, was zur Freisetzung eines 1,8 Kb großen Stufferfragments führte. Wie in Abbildung 2A gezeigt, wurde ein vollständiger Aufschluss des Vektors beobachtet. Für jedes Konstrukt wurden sechs Klone auf das Vorhandensein oder Fehlen von Inserts untersucht, wobei eine rever...

Diskussion

In dieser Studie wurde eine Methode standardisiert, die durch die CRISPR-Cas9-Technologie hocheffiziente und kostengünstige Gendeletionen in hES-Zellen ermöglicht. Mit dieser Methode wurde innerhalb von 3-4 Wochen eine homozygote Deletion des L2HGDH-Gens in hES-Zellen erreicht, beginnend mit der hES-Infektion bis hin zur einzelzelligen klonalen Selektion und Vermehrung (Tabelle 1). Obwohl CRISPR-Cas9-vermittelte Genmanipulationen in den meisten Zellen durch transiente ...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
2-MERCAPTOETHANOL	Invitrogen	31350010
38.5 mL, Sterile + Certified Free Open-Top Thinwall Ultra-Clear Tubes	Beckman Coulter	C14292
Accutase	Stem cell technologies	7920
bFGF Recombinant human	Invitrogen	PHG0261
Brachyury Rabbit mAb	Abclonal	A5078
BsmBI-v2	NEB	R0739S
chir99021	Tocris	4423/10
Corning Matrigel Basement Membrane Matrix, LDEV-free	Corning	354234
Cyclopamine	Stem cell technologies	72074
DMEM media	Invitrogen	11995073
DMEM NUTRIENT MIX F12	Invitrogen	11320033
DPBS w/o: Ca and Mg	PAN Biotech	P04-36500
Fetal bovie serum	Invitrogen	10270106
FoxA2/HNF3β	CST	8186
GAPDH (14C10) Rabbit mAb Antibody	CST	2118S
Gentle Cell Dissociation Reagent	Stem cell technologies	7174
HyClone Non Essential Amino Acids (NEAA) 100x Solution	GE healthcare	SH30238.01
Ki-67 (D3B5) Rabbit mAb	CST	9129
KnockOut Serum Replacement	Invitrogen	10828028
L GLUTAMINE, 100x	Invitrogen	2924190090
L2H-BMSBSP-F1	Macrogen		CGTGCGGGTTCGCGTCTGGG
L2HGDH Polyclonal antibody	Proteintech	15707-1-AP
L2HGDH-SgRNA1-F	Macrogen		CACCGCGTGCGG GTTCGCGTCTGGG
L2HGDH-SgRNA1-R	Macrogen		AAACCCCAGACGC GAACCCGCACGC
L2HGDH-SgRNA2-F	Macrogen		CACCGCCCGCGG GCTTTTCGCCGG
L2HGDH-SgRNA2-R	Macrogen		AAACCCGGCGAA AAGCCCGCGGGC
L2H-SeqF1	Macrogen		GCTAAAGAGCGC GGGTCCTCGG
L2H-SeqR1	Macrogen		GTGGACGGGTTG TTCAAAGCCAGAG
L2H-UMSBSP-R1	Macrogen		GTGGACGGGTTG TTCAAAGCCAGAG
LentiCRISPRv2	Addgene	52961
mTesR1 complete media	Stem cell technologies	85850
Nanog Antibody	CST	3580
NEUROBASAL MEDIUM 1x CTS	Invitrogen	A1371201
Neuropan 2 Supplement 100x	PAN Biotech	P07-11050
Neuropan 27 Supplement 50x	PAN Biotech	P07-07200
Oct-4 Antibody	CST	2750
Pax6 (D3A9V) XP Rabbit mAb	CST	60433
PENICILLIN STREPTOMYCIN SOL	Invitrogen	15140122
pMD2.G	Addgene	12259
Polybrene infection reagent	Sigma	TR1003- G
Polyethylenimine, branched	Sigma	408727
psPAX2.0	Addgene	12260
Puromycin	Invitrogen	A1113802
qPCR Lentivirus Titer Kit	Abm	LV900
Rock inhibitor Y-27632 dihydrochloride	Tocris	1254
SB 431542	Tocris	1614/10
Sox2 Antibody	CST	2748
Sucrose	Sigma	57-50-1
TRYPSIN .05% EDTA	Invitrogen	25300062
U6-459F	Macrogen		GAGGGCCTATT TCCCATGATTC
Wizard Genomic DNA Purification Kit	Promega	A1120
XAV 939	Tocris	3748/10