القياس الكمي لتعديل نشاط إنزيم الإيلاستاز من خلال التحليل اللوني

Summary

يصف هذا البروتوكول تطوير طريقة فحص اللونية لتحديد قدرة المركبات على تثبيط أو تنشيط نشاط الإيلاستاز.

Abstract

يلعب الإيلاستاز ، وهو بروتياز سيرين ، دورا أساسيا في تحلل الإيلاستين. الإيلاستين هو بروتين خارج الخلية يساعد في الحفاظ على مرونة الأنسجة في الرئتين والجلد والأوعية الدموية. يعد التنظيم الصارم لنشاط الإيلاستاز أمرا بالغ الأهمية لتوازن الأنسجة ، حيث يمكن أن يساهم خلل التنظيم في أمراض مثل انتفاخ الرئة والتجاعيد وتصلب الشرايين. أظهرت بعض المركبات ، مثل المواد الكيميائية النباتية التي تحدث بشكل طبيعي ، إمكانية التدخل العلاجي وجذبت اهتماما كبيرا. يعد توضيح التأثيرات المعدلة للمركبات المختلفة على الإيلاستاز ، سواء كانت مثبطة أو محفزة ، أمرا بالغ الأهمية لتطوير استراتيجيات علاجية وتجميلية جديدة تستهدف الاضطرابات المرتبطة بالإيلاستاز. طريقة مقبولة على نطاق واسع لقياس نشاط الإيلاستاز هي مقايسة الإيلاستاز اللونية. في هذا الفحص ، يتم استخدام ركيزة معينة لتكسير الإيلاستاز ، وإطلاق مركب أصفر يمكن اكتشافه ، p-nitroaniline (pNA). تعكس كمية pNA المنتجة نشاط الإيلاستاز في العينة ويمكن قياسها عن طريق قياس الألوان. يقدم هذا الاختبار العديد من الفوائد ، بما في ذلك البساطة والحساسية العالية والنتائج السريعة والقدرة على التكيف مع الاحتياجات البحثية المختلفة. يظل اختبار الإيلاستاز اللوني أداة قيمة لدراسة كيفية تأثير المركبات على نشاط الإيلاستاز. نظرا لسهولة استخدامه وفعاليته ، يعد هذا الاختبار حجر الزاوية في البحث في هذا المجال.

Introduction

الإيلاستاز هو إنزيم سيرين البروتياز الذي يلعب دورا مهما في تكسير الإيلاستين ، وهو بروتين يوفر مرونة لأنسجة مختلفة في الجسم ، بما في ذلك الرئتين والجلد والأوعية الدموية. يتم تنظيم نشاط الإيلاستاز بإحكام للحفاظ على توازن الأنسجة ، ويمكن أن يؤدي عدم التنظيم إلى حالات مرضية وجلدية مثل انتفاخ الرئة وتصلب الشرايين وتجاعيد^{الجلد 1}.

هناك عدة أنواع من اللدائن ، ولكل منها خصائص ووظائف محددة. تعتبر الإيلاستاز العدلات ، التي تنتجها العدلات ، مهمة في الاستجابة المناعية والالتهابات. يمكن لهذه الإنزيمات أن تتحلل مجموعة متنوعة من البروتينات خارج الخلية وتشارك في الأمراض الالتهابية المزمنة². من ناحية أخرى ، تلعب الإيلاستاز البنكرياسي دورا في هضم البروتين في الأمعاء^{الدقيقة 3}. يعد التمييز بين هذه اللدائن أمرا بالغ الأهمية لتطوير علاجات محددة لأمراض مختلفة.

تساعد المستويات الصحية من الإيلاستين والمسارات التي تنظم نشاط الإيلاستاز في الحفاظ على مرونة الجلد ومنع الشيخوخة المبكرة. تؤثر عوامل مثل الشيخوخة والأشعة فوق البنفسجية والالتهابات والاستعداد الوراثي والملوثات البيئية والتغذية بشكل كبير على نشاط وتدهور الإيلاستاز⁴. مجال الاهتمام الناشئ هو دراسة الإيلاستوكينات ، وهي شظايا نشطة بيولوجيا ناتجة عن تحلل الإيلاستين بواسطة الإيلاستاز. يمكن أن تؤدي هذه الجزيئات إلى تأثيرات بيولوجية كبيرة ، بما في ذلك زيادة الالتهاب وتكلس الألياف المرنة وترسب الدهون ، من بين أمور أخرى⁵. قد يؤثر الإيلاستوكينات على تطور الأمراض المرتبطة بتدهور الإيلاستين وتقدم هدفا محتملا للتدخلات العلاجية الجديدة (الشكل 1).

اكتسبت بعض المركبات ، مثل المواد الكيميائية النباتية التي تحدث بشكل طبيعي ، اهتماما كبيرا لآثارها العلاجية والتجميلية المحتملة ، بما في ذلك قدرتها على تعديل نشاط الإيلاستاز⁶. على سبيل المثال ، ثبت أن الكيرسيتين ، وهو فلافونويد موجود في التفاح والبصل ، يثبط بشكل فعال نشاط الإيلاستاز ، مما يساهم في آثاره المضادة للالتهابات والمضادة للشيخوخة⁷. الكركمين, مركب نشط بيولوجيا في الكركم, هو مادة كيميائية نباتية أخرى مدروسة جيدا تظهر تثبيط الإيلاستاز, تقدم تأثيرات وقائية ضد شيخوخة الجلد^{والالتهابات 8}. بالإضافة إلى ذلك ، أظهر epigallocatechin gallate (EGCG) ، وهو مادة الكاتشين الأساسية في الشاي الأخضر ، نشاطا مثبطا قويا للإيلاستاز ، مما يجعله مركبا قيما لتركيبات العناية بالبشرة التي تهدف إلى الحفاظ على مرونة^{الجلد 9}. تؤكد هذه الأمثلة على إمكانات المواد الكيميائية النباتية كمثبطات طبيعية للإيلاستاز ، مما يوفر أساسا لتطوير منتجات علاجية ومستحضرات تجميل جديدة.

حاليا ، يعد اختبار الإيلاستاز اللوني طريقة مستخدمة على نطاق واسع لقياس نشاط الإيلاستاز^{7،10،11،12،13}. يعتمد هذا الاختبار على قدرة الإنزيم على تحلل ركيزة معينة ، N-succinyl- (Ala) 3-nitroanilide (SANA) ، إلى أحماض السكسينيلامينو و p-nitroaniline (pNA). pNA عبارة عن صبغي أصفر اللون يمكن اكتشافه بسهولة عند 410 نانومتر باستخدام مقياس الطيف الضوئي (الشكل 2). يتناسب معدل إنتاج pNA طرديا مع نشاط الإيلاستاز في العينة¹⁴.

هذه الطريقة لها مجموعة واسعة من التطبيقات في مختلف مجالات البحث. من خلال هذه الطريقة ، يمكن للباحثين تحديد قدرة المركبات بسرعة على تعديل نشاط الإيلاستاز ، والتحقيق في آليات عمل مثبطات الإيلاستاز ، وتقييم فعالية هذه المثبطات في النماذج الخلوية والحيوانية للأمراض المرتبطة بالإيلاستاز. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن استخدام الاختبار لدراسة آليات التثبيط المختلفة ، مثل التثبيط التنافسي أو غير التنافسي ، مما يوفر معلومات قيمة حول كيفية تعديل المركبات الطبيعية أو الاصطناعية لنشاط الإيلاستاز.

يوفر اختبار تعديل نشاط الإيلاستاز العديد من المزايا مقارنة بالطرق الأخرى لقياس نشاط الإيلاستاز. إنه بسيط وسهل التنفيذ ، ويتطلب الحد الأدنى من الخبرة التقنية ، ويمكن إجراؤه في بيئة معملية^{قياسية 15}. بالإضافة إلى ذلك ، فإن الاختبار حساس للغاية ويمكنه اكتشاف التغييرات الصغيرة في نشاط الإيلاستاز. يوفر الاختبار نتائج سريعة وكمية ، مما يسمح بتحليل البيانات بكفاءة. علاوة على ذلك ، يمكن تكييفه مع أشكال مختلفة ، بما في ذلك الفحص عالي الإنتاجية والدراسات الحركية¹⁶.

ومع ذلك ، فإن الاختبار له أيضا العديد من القيود ، مثل خصوصية الركيزة المنخفضة (لأنها خاصة بالإيلاستاز) ، والقابلية للتداخل من المكونات الأخرى في العينة ، مثل المركبات الملونة أو مثبطات التحلل المائي pNA. لذلك ، يجب على الباحثين مراعاة هذه القيود واستخدام طرق تكميلية للتحقيق بشكل شامل في الآليات الكامنة وراء عمل مثبطات الإيلاستاز¹⁷.

هناك طرق بديلة لمراقبة نشاط الإيلاستاز ، مثل تصوير الزيمتر ، والذي يوفر أداة ممتازة لتحديد وتمييز الأشكال الإسوية المختلفة للإيلاستاز ، وهو أمر بالغ الأهمية عند دراسة المساهمات المحددة لأنواع فرعية مختلفة من الإيلاستاز في عملية مرض معينة. ومع ذلك ، فإن تصوير الزيموغرافيا هو تقنية شبه كمية وتتطلب خطوات إضافية للتصور. وبالتالي ، بالمقارنة مع طريقة القياس الطيفي ، فإن تصوير الزيموغرافيا أقل كفاءة لتحليل الإنتاجية^{العالية 18}. توفر المقايسات الفلورومترية حساسية متزايدة لطريقة القياس الطيفي ، مما يوفر حدودا أقل للكشف. يسمح هذا بتحليل أكثر حساسية لنشاط الإيلاستاز وتفاعلات المغير ، مما يوفر صورة أكثر اكتمالا للعمليات الأنزيمية¹⁹. ومع ذلك ، تتطلب المقايسات الفلورية أجهزة متخصصة ويمكن أن تكون عرضة للتداخل من مركبات معينة في العينات البيولوجية. تحقق المقايسات الإشعاعية حساسية استثنائية ، مما يجعلها مثالية للكشف عن مستويات منخفضة جدا من نشاط الإيلاستاز. ومع ذلك ، فإن استخدام المواد المشعة يتطلب معدات متخصصة وبروتوكولات أمان صارمة وإجراءات مناسبة للتخلص من النفايات ، مما يشكل تحديات لوجستية ومخاوف تتعلق بالسلامة²⁰. تتميز المقايسات المناعية بتعدد استخداماتها ويمكن استخدامها لقياس نشاط الإيلاستاز بشكل مباشر أو تحديد مجمعات مثبطات الإيلاستاز ، مما يوفر نظرة ثاقبة لفعالية المثبطات. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن تكييف المقايسات المناعية للعمل مع العينات البيولوجية المعقدة ، مثل متجانسات الأنسجة ، على عكس طريقة SANA. ومع ذلك ، فإن تطوير المقايسات المناعية والتحقق من صحتها يمكن أن يستغرق وقتا طويلا ويتطلب أجساما مضادة محددة ، مما قد يؤدي إلى تكاليف أعلى من تلك الخاصة بأساليب القياس الطيفي الأبسط²¹.

يعد اختبار تعديل نشاط الإيلاستاز اللوني أداة قيمة للتحقيق في قدرة أي مركب على تعديل نشاط الإيلاستاز. نظرا لبساطتها وحساسيتها وقدرتها على التكيف ، تستخدم الطريقة على نطاق واسع في بيئات البحث المختلفة. ومع ذلك ، يجب على الباحثين النظر في قيود الفحص واستخدام طرق تكميلية لتحديد الآليات الكامنة وراء نشاط مثبطات الإيلاستاز بشكل شامل.

Protocol

تفاصيل الكواشف والمعدات المستخدمة في هذه الدراسة مدرجة في جدول المواد.

1. تحضير 0.2 M Tris قاعدة التفاعل المؤقت (RB)

1. قم بوزن قاعدة Tris المقابلة باستخدام ميزان تحليلي.
2. انقل قاعدة تريس إلى دورق وأضف الماء منزوع الأيونات باستخدام أسطوانة متدرجة.
3. قلب المحلول باستخدام محرك مغناطيسي حتى تذوب قاعدة تريس تماما.
4. اضبط الرقم الهيدروجيني إلى 8.0 عن طريق إضافة 4 نيوتن حمض الهيدروكلوريك بالتنقيط. استخدم مقياس الأس الهيدروجيني لمراقبة درجة الحموضة.
5. بمجرد الوصول إلى الرقم الهيدروجيني المطلوب ، انقل المحلول إلى قارورة حجمية واملأها إلى علامة الحجم المطلوبة بالماء منزوع الأيونات.
6. انقل المخزن المؤقت إلى زجاجة تخزين تحمل علامة وقم بتخزينه في درجة حرارة الغرفة حتى الاستخدام.

2. إعداد العينة

1. قم بوزن الكمية المطلوبة من العينات بدقة باستخدام ميزان تحليلي. في هذه الدراسة ، يكفي 1 مجم من كل عينة.
2. قم بإذابة العينات في RB إلى التركيز المطلوب. يمكن اختبار تركيزات مختلفة للعينة ، مع 1 مجم / مل كمرجع جيد.
3. استخدم خلاط دوامة لضمان إذابة العينات بالكامل.
4. قم بتخزين العينات المحضرة على الثلج حتى تصبح جاهزة للاستخدام.
   ملاحظة: إذا كانت العينة تحتوي على تلوين قوي قد يتداخل مع قراءات الامتصاص، فقم بإعداد عناصر التحكم في الألوان باتباع نفس الإجراء ولكن دون إضافة إنزيم الإيلاستاز في الخطوات اللاحقة.

3. تحضير إنزيم الإيلاستاز

1. تحضير محلول عامل من الإيلاستاز في RB بتركيز نهائي قدره 10 ميكروغرام / مل. استخدم المعادلة التالية لحساب الحجم المطلوب لمحلول المخزون:
   حجم المخزون (ميكرولتر) = الحجم النهائي المطلوب (ميكرولتر) × التركيز النهائي المطلوب (ميكروغرام / مل) / تركيز المخزون (ميكروغرام / مل)
2. قم بتخزين محلول الإيلاستاز المحضر على الثلج حتى يصبح جاهزا للاستخدام.
   ملاحظة: ضع في اعتبارك النشاط المحدد للإنزيم على النحو الذي يوفره المورد ، والذي قد يختلف بين الدفعات. أيضا ، قد ينخفض نشاط الإنزيم بعد التجميد. قم بإعداد حلول جديدة عندما يكون ذلك ممكنا.

4. تحضير الركيزة SANA

1. تحضير 0.8 ملي مولار من محلول سانا عن طريق إذابة الكمية المناسبة من مسحوق سانا في RB. استخدم المعادلة التالية:
   كتلة SANA (ملغ) = الحجم النهائي المطلوب (ميكرولتر) × التركيز النهائي المطلوب (ملليمتر) × الوزن الجزيئي (مجم / ملليمول) / 1000
2. احم المحلول من الضوء واحفظه على حرارة 4 درجات مئوية حتى الاستخدام.

5. تحضير محلول مخزون فينيل ميثيل سلفونيل فلوريد (PMSF)

1. تحضير 100 ملي مولار من محلول مخزون PMSF في الأيزوبروبانول.
2. قم بتخزين محلول PMSF المحضر على الثلج حتى يصبح جاهزا للاستخدام.
   ملاحظة: قم بتقسيم محلول PMSF إلى أحجام أصغر (على سبيل المثال ، 100 ميكرولتر) وتخزينه عند -20 درجة مئوية لتجنب دورات التجميد والذوبان.

6. إعداد الفحص

1. قم بإعداد الحلول التالية بثلاث نسخ في أنابيب الطرد المركزي الدقيقة:
   1. التحكم السلبي: الماصة 800 ميكرولتر من RB.
   2. التحكم في السيارة: أضف 600 ميكرولتر من RB و 200 ميكرولتر من المذيب المستخدم لإذابة العينة.
   3. التحكم في التثبيط الإيجابي: أضف 24 ميكرولتر من محلول مخزون PMSF و 776 ميكرولتر من RB.
   4. التحكم في الأيزوبروبانول: أضف 24 ميكرولتر من الأيزوبروبانول و 776 ميكرولتر من RB.
   5. العينات: ماصة 200 ميكرولتر من محلول العينة المحضر وإضافة 600 ميكرولتر من RB.
   6. عناصر التحكم في الألوان (إذا لزم الأمر): ماصة 200 ميكرولتر من محلول العينة وإضافة 800 ميكرولتر من RB.
2. أضف 100 ميكرولتر من محلول الإيلاستاز (10 ميكروغرام / مل) إلى كل أنبوب ، باستثناء عناصر التحكم في الألوان.
3. احتضان جميع الأنابيب في درجة حرارة الغرفة لمدة 20 دقيقة.
4. أضف 100 ميكرولتر من محلول الركيزة SANA (0.8 ملم) إلى كل أنبوب ، باستثناء عناصر التحكم في الألوان.
5. امزج المحاليل جيدا عن طريق قلب الأنابيب برفق عدة مرات. انقل 300 ميكرولتر من كل أنبوب إلى لوحة سعة 96 بئرا ، مما يضمن قياسات ثلاثية لكل عينة.
6. ضع اللوحة المكونة من 96 بئرا في قارئ صفيحة دقيقة مضبوطة على 410 نانومتر. قم بقياس الامتصاص بشكل دوري ، كل دقيقة ، لمدة 20 دقيقة أو حتى تستقر الإشارة. اضبط القارئ على القياس في درجة حرارة الغرفة.
   ملاحظة: إذا كان قارئ اللوحة يدعم القياسات الحركية، فقم ببرمجته لأخذ القراءات تلقائيا على فترات زمنية محددة. خلاف ذلك ، قم بتسجيل الامتصاص يدويا في النقاط الزمنية المطلوبة.

7. تحليل البيانات

1. تطبيع النتائج عن طريق تعيين التحكم في التثبيط الإيجابي (PMSF) على أنه تثبيط بنسبة 100٪ والتحكم السلبي (RB فقط) على أنه تثبيط 0٪.
2. احسب النسبة المئوية للتثبيط لكل عينة باستخدام الصيغة التالية:
   ٪ تثبيط = 100 - [(امتصاص العينة - امتصاص التحكم في السيارة - امتصاص التحكم في الألوان) / (امتصاص التحكم السلبي - امتصاص التحكم الإيجابي - امتصاص التحكم في الأيزوبروبانول)] × 100
3. استخدم برنامج الرسوم البيانية لرسم نسب التثبيط لكل تركيز عينة مقابل تركيز العينة لتصور التأثير المثبط.

النتائج

بمجرد اكتمال البروتوكول ، يمكن الحصول على بيانات الامتصاص اللازمة لإجراء الحسابات ذات الصلة وتحديد قدرة العينات على تعديل نشاط الإيلاستاز. يسلط الشكل 3 الضوء على موقع الآبار مع الضوابط والعينات المختلفة. في حالة العينات الملونة ، مثل تلك المستخدمة في هذ...

Discussion

في الطريقة الحالية ، يتم فحص التأثيرات المعدلة للمواد الكيميائية النباتية على إنزيمات الإيلاستاز باستخدام مقايسة اللون. يلعب الإيلاستاز ، وهو بروتياز سيرين ضروري لتدهور الإيلاستين ، دورا مهما في الحفاظ على مرونة الأنسجة في الأعضاء المختلفة. يوفر اختبار الإيلاستاز الل...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
96 Well Cell Culture Plate	Corning Incorporated	3599	Flat bottom with lid, polystyrene
Cell Imaging Multimode Reader	Agilent	BioTek Cytation 1	Used with Gen5 software
Elastase From Porcine Pancreas	Sigma-Aldrich	E7885	CAS 39445-21-1; 25,9 kDa
Isopropanol 99.5%	Fisher Scientific	AC184130010	CAS 67-63-0; C3H8O; 60.10 g/mol
N-Succinil-(Ala)3-nitroanilide	Sigma-Aldrich	S4760	CAS 52299-14-6; C19H25N5O8 ; 451.43 g/mol
pH Meter	Hach Lange	sensION+ PH31	With magnetic stirrer and sensor holder
Phenylmethanesulfonyl Fluoride	Sigma-Aldrich	P7626	CAS 329-98-6; C7H7FO2S; 174,19 g/mol
Tris For Molecular Biology	PanReac AppliChem	A2264	CAS 77-86-1; C4H11NO3; 121,14 g/mol