比色分析によるエラスターゼ酵素活性の調節の定量化

要約

このプロトコルは、化合物がエラスターゼ活性を阻害または活性化する能力を決定するための比色アッセイ方法の開発について説明しています。

要約

エラスターゼは、セリンプロテアーゼであり、エラスチンの分解に不可欠な役割を果たします。エラスチンは、肺、皮膚、血管の組織の弾力性を維持するのに役立つ細胞外タンパク質です。エラスターゼ活性の厳密な調節は、組織の恒常性維持にとって重要であり、調節不全は肺気腫、しわ、アテローム性動脈硬化症などの病状に寄与する可能性があります。天然に存在する植物化学物質などの一部の化合物は、治療介入の可能性を示しており、大きな関心を集めています。エラスターゼに対するさまざまな化合物の調節効果を解明することは、抑制性か刺激性かを問わず、エラスターゼ関連障害を標的とする新しい治療および美容戦略を開発するために重要です。エラスターゼ活性を測定するための広く受け入れられている方法は、比色エラスターゼアッセイです。このアッセイでは、特定の基質を使用してエラスターゼを分解し、検出可能な黄色の化合物であるp-ニトロアニリン(pNA)を放出します。生成されるpNAの量は、サンプル中のエラスターゼ活性を反映しており、比色測定で測定できます。このアッセイには、シンプルさ、高感度、迅速な結果、さまざまな研究ニーズへの適応性など、いくつかの利点があります。比色エラスターゼアッセイは、化合物がエラスターゼ活性にどのように影響するかを研究するための貴重なツールであり続けています。その使いやすさと有効性により、このアッセイはこの分野の研究の基礎となっています。

概要

エラスターゼは、肺、皮膚、血管など、体内のさまざまな組織に弾力性を与えるタンパク質であるエラスチンの分解に重要な役割を果たすセリンプロテアーゼ酵素です。エラスターゼ活性は、組織の恒常性を維持するために厳密に制御されており、調節不全は、肺気腫、アテローム性動脈硬化症、皮膚のしわなどの病理学的および真皮的な状態につながる可能性があります¹。

エラスターゼにはいくつかの種類があり、それぞれに特定の特性と機能があります。好中球によって産生される好中球エラスターゼは、免疫応答と炎症に重要です。これらの酵素は、さまざまな細胞外タンパク質を分解することができ、慢性炎症性疾患^{に関与しています2}。一方、膵臓エラスターゼは、小腸でのタンパク質消化に役割を果たします³。これらのエラスターゼを区別することは、さまざまな疾患に対する特定の治療法を開発するために重要です。

健康的なレベルのエラスチンとエラスターゼ活性を調節する経路は、肌の弾力性を維持し、早期老化を防ぐのに役立ちます。老化、紫外線、炎症、遺伝的素因、環境汚染物質、栄養などの要因は、エラスターゼ⁴の活性と分解に大きく影響します。新たな関心分野は、エラスターゼによるエラスチンの分解によって生成される生理活性フラグメントであるエラストカインの研究です。これらの分子は、炎症の増加、弾性繊維の石灰化、脂質沈着など、重大な生物学的影響を誘発する可能性があります⁵。エラストカインは、エラスチン分解に関連する疾患の進行に影響を及ぼし、新たな治療介入の標的となる可能性があります(図1)。

天然に存在する植物化学物質などの一部の化合物は、エラスター^ゼ活性を調節する能力を含む、その潜在的な治療効果および美容効果について大きな注目を集めています6。例えば、リンゴやタマネギに含まれるフラボノイドであるケルセチンは、エラスターゼ活性を効果的に阻害することが示されており、これはその抗炎症作用とアンチエイジング作用に寄与しています⁷。ターメリックの生理活性化合物であるクルクミンは、エラスターゼ阻害を示す別のよく研究された植物化学物質であり、皮膚の老化や炎症に対する保護効果を提供します⁸。さらに、緑茶の主要なカテキンであるエピガロカテキンガレート(EGCG)は、強力なエラスターゼ阻害活性を示しており、肌の弾力性を維持することを目的としたスキンケア製剤の貴重な化合物となっています⁹。これらの例は、天然のエラスターゼ阻害剤としてのファイトケミカルの可能性を強調しており、新しい治療薬や化粧品の開発の基盤を提供します。

現在、比色エラスターゼアッセイは、エラスターゼ活性を測定するために広く使用されている方法^である7,10,11,12,13。このアッセイは、特定の基質であるN-サクシニル-(Ala)₃-ニトロアニリド(SANA)をサクシニルアミノ酸とp-ニトロアニリン(pNA)に加水分解する酵素の能力に依存しています。pNAは黄色の発色団で、分光光度計を使用して410 nmで容易に検出できます(図2)。pNAの生成速度は、サンプル¹⁴のエラスターゼ活性に正比例します。

この手法は、様々な研究分野で幅広い応用がなされています。この方法により、研究者は化合物がエラスターゼ活性を調節する能力を迅速に特定し、エラスターゼ阻害剤の作用機序を調査し、エラスターゼ関連疾患の細胞モデルおよび動物モデルにおけるこれらの阻害剤の有効性を評価することができます。さらに、このアッセイは、競合的または非競合的阻害など、さまざまな阻害メカニズムの研究に使用でき、天然または合成化合物がエラスターゼ活性をどのように調節するかについての貴重な情報を提供します。

エラスターゼ活性調節アッセイは、エラスターゼ活性を測定するための他の方法に比べていくつかの利点を提供します。これはシンプルで簡単に実行でき、技術的な専門知識は最小限で済み、標準的な実験室環境で実施できます¹⁵。さらに、このアッセイは非常に感度が高く、エラスターゼ活性の小さな変化を検出できます。このアッセイは迅速かつ定量的な結果を提供し、効率的なデータ解析を可能にします。さらに、ハイスループットスクリーニングやキネティックスタディ¹⁶など、さまざまなフォーマットに適応させることができます。

しかし、このアッセイには、基質特異性が低い(エラスターゼに特異的であるため)ことや、サンプル中の他の成分(着色化合物やpNA加水分解の阻害剤など)からの干渉に対する感受性など、いくつかの制限もあります。したがって、研究者はこれらの制限を考慮し、補完的な方法を使用して、エラスターゼ阻害剤の作用の根底にあるメカニズムを包括的に調査する必要があります¹⁷。

エラスターゼ活性モニタリングの代替方法があり、ザイモグラフィーは、さまざまなエラスターゼアイソフォームを同定し、区別するための優れたツールを提供し、これは、特定の疾患プロセスに対する異なるエラスターゼサブタイプの特定の寄与を研究する際に重要です。ただし、ザイモグラフィーは半定量的な手法であり、視覚化には追加の手順が必要です。したがって、分光光度法と比較して、ザイモグラフィーはハイスループット分析の効率が低くなります¹⁸。蛍光アッセイは、分光光度法に対する感度が向上し、検出限界が低くなります。これにより、エラスターゼ活性およびモジュレーター相互作用のより高感度な解析が可能になり、酵素プロセスのより完全な全体像が得られる¹⁹。ただし、蛍光アッセイには特殊な装置が必要であり、生体サンプル中の特定の化合物からの干渉を受けやすい場合があります。ラジオメトリックアッセイは優れた感度を達成し、非常に低いレベルのエラスターゼ活性の検出に理想的です。しかし、放射性物質の使用には、特殊な機器、厳格な安全プロトコル、および適切な廃棄物処理手順が必要であり、物流上の課題と安全上の懸念が生じます²⁰。イムノアッセイは、その汎用性が際立っており、エラスターゼ活性を直接測定したり、エラスターゼ-阻害剤複合体を定量したりするために使用できるため、阻害剤の有効性に関する洞察が得られます。さらに、イムノアッセイは、SANA法とは異なり、組織ホモジネートなどの複雑な生体サンプルを扱うように適合させることができます。しかし、イムノアッセイの開発とバリデーションには時間がかかり、特異的な抗体が必要になるため、単純な分光光度法のアプローチよりもコストが高くなる可能性がある²¹。

比色エラスターゼ活性調節アッセイは、任意の化合物がエラスターゼ活性を修飾する能力を調査するための貴重なツールです。そのシンプルさ、感度、適応性により、この方法はさまざまな研究環境で広く使用されています。ただし、研究者はアッセイの限界を考慮し、補完的な方法を使用して、エラスターゼ阻害剤の活性の根底にあるメカニズムを包括的に決定する必要があります。

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プロトコル

本試験に使用した試薬および機器の詳細は、 資料表に記載されています。

1. 0.2 Mトリス塩基反応バッファー(RB)の調製

1. 分析天びんを使用して、対応するトリス塩基を計量します。
2. トリスベースをビーカーに移し、メスシリンダーを使用して脱イオン水を追加します。
3. トリスベースが完全に溶解するまで、マグネチックスターラーで溶液を攪拌します。
4. pHを8.0に調整し、4 N HClを滴下します。pHメーターを使用してpHを監視します。
5. 所望のpHに達したら、溶液をメスフラスコに移し、脱イオン水で所望の容量マークまで充填します。
6. バッファーをラベル付きの保存ボトルに移し、使用するまで室温で保管します。

2. サンプル調製

1. 分析天びんを使用して、必要な量のサンプルを正確に計量します。この研究では、各サンプル1mgで十分です。
2. サンプルをRBに溶解して目的の濃度にします。さまざまなサンプル濃度を試験できますが、1 mg/mLが適切な参考値です。
3. ボルテックスミキサーを使用して、サンプルが完全に溶解していることを確認します。
4. 準備したサンプルは、使用する準備ができるまで氷上に保存します。
   注:サンプルに吸光度の読み取りを妨げる可能性のある強い着色がある場合は、同じ手順に従ってカラーコントロールを準備しますが、後の手順でエラスターゼ酵素を追加しないでください。

3. エラスターゼ酵素の調製

1. 最終濃度10 μg/mLのRBでエラスターゼの作業溶液を調製します。次の式を使用して、必要なストック溶液の量を計算します。
   原液量(μL)=所望最終量(μL)×所望最終濃度(μg/mL)/原液濃度(μg/mL)
2. 調製したエラスターゼ溶液を、使用する準備ができるまで氷上に保存します。
   注:供給者が提供する酵素の比活性を考慮してください(これはバッチ間で異なる場合があります)。また、凍結後に酵素活性が低下する場合があります。可能な限り新鮮な溶液を準備します。

4. SANA基板の調製

1. RBに適量のSANA粉末を溶解し、0.8 mMのSANA溶液を調製します。次の式を使用します。
   SANAの質量(mg)=所望の最終容積(μL)×所望の最終濃度(mM)×分子量(mg / mmol)/1000
2. 溶液を光から保護し、使用するまで4°Cで保管してください。

5. フッ化フェニルメチルスルホニル(PMSF)原液の調製

1. イソプロパノール中の 100 mM の PMSF ストック溶液を調製します。
2. 調製したPMSF溶液は、使用する準備ができるまで氷上に保存します。
   注:PMSF溶液を少量(100μLなど)に分注し、凍結融解サイクルを避けるために-20°Cで保存します。

6. アッセイのセットアップ

1. 以下の溶液をマイクロ遠心チューブに三重に調製します。
   1. ネガティブコントロール:ピペット800μLのRB。
   2. ビヒクル制御:サンプルの溶解に使用した溶媒600μLと溶媒200μLを添加します。
   3. ポジティブ阻害制御:PMSF原液24μLとRB776μLを添加します。
   4. イソプロパノールコントロール:24μLのイソプロパノールと776μLのRBを加えます。
   5. サンプル:調製したサンプル溶液200μLをピペットで取り、RB600μLを加えます。
   6. カラーコントロール(必要な場合):サンプル溶液200μLをピペットで取り、RBを800μL加えます。
2. カラーコントロールを除いて、各チューブに100μLのエラスターゼ溶液(10μg/mL)を加えます。
3. すべてのチューブを室温で20分間インキュベートします。
4. 100 μLのSANA基質溶液(0.8 mM)を各チューブに加えます(カラーコントロールを除く)。
5. チューブを数回静かに反転させて、溶液を完全に混合します。各チューブから300μLを96ウェルプレートに移し、各サンプルの3回測定を確実にします。
6. 96ウェルプレートを410 nmに設定されたマイクロプレートリーダーに入れます。吸光度は、周期的に、毎分、20分間、または信号が安定するまで測定します。リーダーを室温で測定するように設定します。
   注意: プレートリーダーが動力学測定をサポートしている場合は、設定された間隔で自動的に読み取りを行うようにプログラムしてください。それ以外の場合は、目的の時点での吸光度を手動で記録します。

7. データ分析

1. ポジティブ・インヒビション・コントロール (PMSF) を 100% インヒビションとして、ネガティブ・コントロール (RB のみ) を 0% インヒッションとして設定して、結果を正規化します。
2. 次の式を使用して、各サンプルの阻害率を計算します。
   % 阻害率 = 100 - [(サンプル吸光度 - ビヒクル制御吸光度 - 色制御吸光度)/(ネガティブコントロール吸光度 - ポジティブコントロール吸光度 - イソプロパノールコントロール吸光度)] × 100
3. グラフ作成ソフトウェアを使用して、サンプル濃度に対する各サンプル濃度の阻害率をプロットし、阻害効果を視覚化します。

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結果

プロトコールが完了すると、適切な計算を実行し、エラスターゼ活性を調節するサンプルの能力を定量化するために必要な吸光度データを取得できます。 図3 は、さまざまなコントロールとサンプルを使用したウェルの位置を示しています。この例で使用されているような色付きサンプルの場合、色が410 nmでのpNAの黄色の測定に干渉する可能性...

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ディスカッション

本方法では、植物化学物質のエラスターゼ酵素に対する調節効果を比色分析法を用いて調べる。エラスチンの分解に重要なセリンプロテアーゼであるエラスターゼは、さまざまな臓器の組織の弾力性を維持する上で重要な役割を果たしています。この研究で説明されている比色エラスターゼアッセイは、エラスターゼ活性を測定するためのシンプルで高感度かつ迅速...

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資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
96 Well Cell Culture Plate	Corning Incorporated	3599	Flat bottom with lid, polystyrene
Cell Imaging Multimode Reader	Agilent	BioTek Cytation 1	Used with Gen5 software
Elastase From Porcine Pancreas	Sigma-Aldrich	E7885	CAS 39445-21-1; 25,9 kDa
Isopropanol 99.5%	Fisher Scientific	AC184130010	CAS 67-63-0; C3H8O; 60.10 g/mol
N-Succinil-(Ala)3-nitroanilide	Sigma-Aldrich	S4760	CAS 52299-14-6; C19H25N5O8 ; 451.43 g/mol
pH Meter	Hach Lange	sensION+ PH31	With magnetic stirrer and sensor holder
Phenylmethanesulfonyl Fluoride	Sigma-Aldrich	P7626	CAS 329-98-6; C7H7FO2S; 174,19 g/mol
Tris For Molecular Biology	PanReac AppliChem	A2264	CAS 77-86-1; C4H11NO3; 121,14 g/mol