כימות אפנון פעילות אנזים אלסטאז באמצעות אנליזה קולורימטרית

Summary

פרוטוקול זה מתאר את הפיתוח של שיטת בדיקה קולורימטרית לקביעת היכולת של תרכובות לעכב או להפעיל פעילות אלסטאז.

Abstract

אלסטאז, פרוטאז סרין, ממלא תפקיד חיוני בפירוק אלסטין. אלסטין הוא חלבון חוץ-תאי המסייע בשמירה על גמישות רקמות בריאות, בעור ובכלי הדם. רגולציה הדוקה של פעילות האלסטאז חיונית להומאוסטזיס רקמות, שכן חוסר ויסות יכול לתרום לפתולוגיות כגון אמפיזמה, קמטים וטרשת עורקים. תרכובות מסוימות, כגון פיטוכימיקלים טבעיים, הראו פוטנציאל להתערבות טיפולית ומשכו עניין רב. הבהרת ההשפעות המודולריות של תרכובות שונות על אלסטאז, בין אם מעכבות או גירוי, חיונית לפיתוח אסטרטגיות טיפוליות וקוסמטיות חדשניות המתמקדות בהפרעות הקשורות לאלסטאז. שיטה מקובלת למדידת פעילות האלסטאז היא בדיקת האלסטאז הקולורימטרי. בבדיקה זו, מצע מסוים משמש לפירוק אלסטאז, שחרור תרכובת צהובה ניתנת לזיהוי, p-nitroaniline (pNA). כמות ה-pNA המיוצרת משקפת את פעילות האלסטאז בדגימה וניתן למדוד אותה באמצעות קולורימטריה. בדיקה זו מציעה מספר יתרונות, כולל פשטות, רגישות גבוהה, תוצאות מהירות ויכולת הסתגלות לצרכי מחקר שונים. בדיקת האלסטאז הקולורימטרי נותרה כלי רב ערך לחקר האופן שבו תרכובות משפיעות על פעילות האלסטאז. בשל קלות השימוש והאפקטיביות שלה, בדיקה זו היא אבן פינה של מחקר בתחום זה.

Introduction

אלסטאז הוא אנזים פרוטאז סרין הממלא תפקיד מכריע בפירוק אלסטין, חלבון המספק גמישות לרקמות שונות בגוף, כולל הריאות, העור וכלי הדם. פעילות האלסטאז מווסתת היטב כדי לשמור על הומאוסטזיס רקמות, וחוסר ויסות יכול להוביל למצבים פתולוגיים ועוריים כגון אמפיזמה, טרשת עורקים וקמטים^{בעור 1}.

ישנם מספר סוגים של אלסטאזות, כל אחד עם מאפיינים ספציפיים ופונקציות. אלסטזות נויטרופילים, המיוצרות על ידי נויטרופילים, חשובות בתגובה החיסונית ובדלקת. אנזימים אלה יכולים לפרק מגוון רחב של חלבונים חוץ-תאיים ומעורבים במחלות דלקתיות כרוניות². אלסטזות הלבלב, לעומת זאת, ממלאות תפקיד בעיכול חלבונים במעי הדק³. הבחנה בין אלסטזות אלה חיונית לפיתוח טיפולים ספציפיים למחלות שונות.

רמות בריאות של אלסטין ומסלולים המווסתים את פעילות האלסטאז מסייעים בשמירה על גמישות העור ומונעים הזדקנות מוקדמת. גורמים כגון הזדקנות, קרינת UV, דלקת, נטייה גנטית, מזהמים סביבתיים ותזונה משפיעים באופן משמעותי על הפעילות והפירוק של אלסטאז⁴. תחום עניין מתפתח הוא המחקר של elastokines, מקטעים ביו-אקטיביים שנוצרו על ידי השפלה של אלסטין על ידי elastase. מולקולות אלה יכולות לגרום להשפעות ביולוגיות משמעותיות, כולל דלקת מוגברת, הסתיידות סיבים אלסטיים ושקיעת שומנים, בין היתר⁵. אלסטוקינים עשויים להשפיע על התקדמות מחלות הקשורות לפירוק אלסטין ולהציע יעד פוטנציאלי להתערבויות טיפוליות חדשות (איור 1).

תרכובות מסוימות, כגון פיטוכימיקלים טבעיים, זכו לתשומת לב משמעותית בשל ההשפעות הטיפוליות והקוסמטיות האפשריות שלהם, כולל יכולתם לווסת את פעילות האלסטאז⁶. לדוגמה, קוורצטין, פלבנואיד המצוי בתפוחים ובבצל, הוכח כמעכב ביעילות את פעילות האלסטאז, מה שתורם להשפעתו האנטי דלקתית והאנטי אייג'ינג⁷. כורכומין, התרכובת הביו-אקטיבית של כורכום, הוא פיטוכימיקל נוסף שנחקר היטב ומציג עיכוב אלסטאז, ומציע השפעות מגינות מפני הזדקנות העור ודלקת⁸. נוסף על כך, אפיגלוקטכין גלאט (EGCG), הקטכין העיקרי בתה ירוק, הדגים פעילות מעכבת אלסטאז חזקה, מה שהופך אותו לתרכובת רבת ערך עבור תכשירים לטיפוח העור שמטרתם לשמר את גמישות העור⁹. דוגמאות אלה מדגישות את הפוטנציאל של פיטוכימיקלים כמעכבי אלסטאז טבעיים, ומספקים בסיס לפיתוח מוצרים טיפוליים וקוסמטיים חדשים.

כיום, בדיקת האלסטאז הקולרימטרי היא שיטה נפוצה למדידת פעילות האלסטאז 7,10,11,12,13. בדיקה זו מסתמכת על יכולתו של האנזים לבצע הידרוליזה של סובסטרט מסוים, N-succinyl-(Ala)3-nitroanilide (SANA), לחומצות succinylamino ו-p-nitroaniline (pNA). pNA הוא כרומופור בצבע צהוב שניתן לזהות בקלות ב-410 ננומטר באמצעות ספקטרופוטומטר (איור 2). קצב ייצור ה-pNA עומד ביחס ישר לפעילות האלסטאז במדגם¹⁴.

לשיטה זו מגוון רחב של יישומים בתחומי מחקר שונים. באמצעות שיטה זו, חוקרים יכולים לזהות במהירות את היכולת של תרכובות לווסת את פעילות האלסטאז, לחקור את מנגנוני הפעולה של מעכבי אלסטאז, ולהעריך את היעילות של מעכבים אלה במודלים תאיים ובעלי חיים של מחלות הקשורות לאלסטאז. בנוסף, ניתן להשתמש בבדיקה כדי לחקור מנגנונים שונים של עיכוב, כגון עיכוב תחרותי או לא תחרותי, ולספק מידע רב ערך על האופן שבו תרכובות טבעיות או סינתטיות מווסתות את פעילות האלסטאז.

בדיקת אפנון פעילות האלסטאז מציעה מספר יתרונות על פני שיטות אחרות למדידת פעילות אלסטאז. הוא פשוט וקל לביצוע, דורש מומחיות טכנית מינימלית, וניתן לבצע אותו בתנאי מעבדה סטנדרטיים¹⁵. בנוסף, הבדיקה רגישה מאוד ויכולה לזהות שינויים קטנים בפעילות האלסטאז. הבדיקה מספקת תוצאות מהירות וכמותיות, ומאפשרת ניתוח נתונים יעיל. יתר על כן, ניתן להתאים אותו לפורמטים שונים, כולל סינון בתפוקה גבוהה ומחקרים קינטיים¹⁶.

עם זאת, לבדיקה יש גם מספר מגבלות, כגון ספציפיות מצע נמוכה (מכיוון שהיא ספציפית לאלסטאז), ורגישות להפרעות מרכיבים אחרים בדגימה, כגון תרכובות צבעוניות או מעכבי הידרוליזה pNA. לכן, על החוקרים לשקול מגבלות אלה ולהשתמש בשיטות משלימות כדי לחקור באופן מקיף את המנגנונים העומדים בבסיס פעולתם של מעכבי אלסטאז¹⁷.

ישנן שיטות חלופיות לניטור פעילות אלסטאז, כגון זימוגרפיה, המציעה כלי מצוין לזיהוי והבחנה בין איזופורמים שונים של אלסטאז, שהוא חיוני כאשר לומדים את התרומות הספציפיות של תת-סוגים שונים של אלסטאז לתהליך מחלה מסוים. עם זאת, זימוגרפיה היא טכניקה כמותית למחצה ודורשת צעדים נוספים להדמיה; לפיכך, בהשוואה לשיטה הספקטרופוטומטרית, זימוגרפיה יעילה פחות לניתוח תפוקה גבוהה¹⁸. בדיקות פלואורומטריות מציעות רגישות מוגברת לשיטה הספקטרופוטומטרית, ומספקות מגבלות גילוי נמוכות יותר. זה מאפשר ניתוח רגיש יותר של פעילות אלסטאז ואינטראקציות אפנן, מתן תמונה מלאה יותר של תהליכים אנזימטיים¹⁹. עם זאת, בדיקות פלואורומטריות דורשות מכשור מיוחד ויכולות להיות רגישות להפרעות מתרכובות מסוימות בדגימות ביולוגיות. בדיקות רדיומטריות משיגות רגישות יוצאת דופן, מה שהופך אותן לאידיאליות לזיהוי רמות נמוכות מאוד של פעילות אלסטאז. עם זאת, השימוש בחומרים רדיואקטיביים מחייב ציוד מיוחד, פרוטוקולי בטיחות מחמירים ונהלי סילוק פסולת נאותים, המציבים אתגרים לוגיסטיים ובעיות בטיחות²⁰. Immunoassays בולטים על הרבגוניות שלהם וניתן להשתמש בהם כדי למדוד פעילות אלסטאז ישירות או לכמת קומפלקסים מעכבי אלסטאז, מתן תובנות לגבי יעילות מעכב. בנוסף, ניתן להתאים בדיקות חיסוניות לעבודה עם דגימות ביולוגיות מורכבות, כגון הומוגנאטים של רקמות, בניגוד לשיטת SANA. עם זאת, פיתוח ואימות של בדיקות חיסוניות יכול לקחת זמן רב ולדרוש נוגדנים ספציפיים, מה שעלול להוביל לעלויות גבוהות יותר מאלה של גישות ספקטרופוטומטריות פשוטות יותר²¹.

בדיקת אפנון פעילות האלסטאז הקולורימטרי היא כלי רב ערך לחקר היכולת של כל תרכובת לשנות את פעילות האלסטאז. בשל פשטותה, רגישותה ויכולת ההסתגלות שלה, השיטה נמצאת בשימוש נרחב במסגרות מחקר שונות. עם זאת, על החוקרים לשקול את מגבלות הבדיקה ולהשתמש בשיטות משלימות כדי לקבוע באופן מקיף את המנגנונים העומדים בבסיס פעילותם של מעכבי אלסטאז.

Protocol

פרטי הריאגנטים והציוד ששימש למחקר זה מפורטים בטבלת החומרים.

1. הכנת חיץ תגובת בסיס 0.2 M Tris (RB)

1. לשקול את בסיס Tris המתאים באמצעות איזון אנליטי.
2. מעבירים את בסיס הטריס לכוס ומוסיפים מים נטולי יונים, באמצעות גליל מדורג.
3. ערבבו את התמיסה עם מערבל מגנטי עד להמסה מוחלטת של בסיס הטריס.
4. כוונן את ה- pH ל- 8.0 על ידי הוספת 4 N HCl טיפתית. השתמש במד pH כדי לפקח על ה- pH.
5. לאחר שמגיעים ל- pH הרצוי, מעבירים את התמיסה לבקבוק נפחי וממלאים לסימן הנפח הרצוי במים נטולי יונים.
6. העבירו את המאגר לבקבוק אחסון מסומן ואחסנו אותו בטמפרטורת החדר עד לשימוש.

2. הכנת מדגם

1. שקלול מדויק של הכמות הנדרשת של הדגימות באמצעות איזון אנליטי. עבור מחקר זה, 1 מ"ג של כל מדגם מספיק.
2. ממיסים את הדגימות ב-RB לריכוז הרצוי. ניתן לבדוק ריכוזי דגימה שונים, כאשר 1 מ"ג / מ"ל הוא התייחסות טובה.
3. השתמש במערבל מערבולת כדי להבטיח שהדגימות מומסות במלואן.
4. אחסנו את הדגימות המוכנות על קרח עד שיהיו מוכנות לשימוש.
   הערה: אם הדגימה כוללת צבע חזק שעלול להפריע לקריאות הספיגה, הכינו בקרות צבע על-ידי ביצוע אותו הליך אך מבלי להוסיף אנזים אלסטאז בשלבים מאוחרים יותר.

3. הכנת אנזים אלסטאז

1. הכינו תמיסת עבודה של אלסטאז ב-RB בריכוז סופי של 10 מיקרוגרם/מ"ל. השתמש במשוואה הבאה כדי לחשב את הנפח הנדרש של פתרון המלאי:
   נפח מלאי (μL) = נפח סופי רצוי (μL) x ריכוז סופי רצוי (מיקרוגרם/מ"ל)/ריכוז מלאי (מק"ג/מ"ל)
2. אחסנו את תמיסת האלסטאז המוכנה על קרח עד שתהיה מוכנה לשימוש.
   הערה: שקול את הפעילות הספציפית של האנזים כפי שסופקה על-ידי הספק, שעשויה להשתנות בין האצוות. כמו כן, פעילות האנזים עשויה לרדת לאחר הקפאה; הכינו פתרונות חדשים במידת האפשר.

4. הכנת מצע SANA

1. הכן 0.8 מ"מ של תמיסת SANA על ידי המסת הכמות המתאימה של אבקת SANA ב-RB. השתמש במשוואה הבאה:
   מסת SANA (מ"ג) = נפח סופי רצוי (μL) × ריכוז סופי רצוי (mM) × משקל מולקולרי (מ"ג/mmol)/1000
2. יש להגן על התמיסה מפני אור ולאחסן אותה בטמפרטורה של 4°C עד לשימוש.

5. הכנת תמיסת המניות פנילמתיל-סולפוניל פלואוריד (PMSF)

1. הכן 100 mM של תמיסת מלאי PMSF באיזופרופנול.
2. אחסנו את תמיסת PMSF המוכנה על קרח עד שתהיה מוכנה לשימוש.
   הערה: יש לאחסן את תמיסת PMSF בנפחים קטנים יותר (למשל, 100 μL) ולאחסן בטמפרטורה של -20°C כדי למנוע מחזורי הקפאה-הפשרה.

6. הגדרת הבדיקה

1. הכינו את התמיסות הבאות בטריפליקט בצינורות מיקרוצנטריפוגה:
   1. שליטה שלילית: פיפטה 800 μL של RB.
   2. בקרת רכב: הוסף 600 μL של RB ו 200 μL של הממס המשמש להמסת הדגימה.
   3. בקרת עיכוב חיובית: הוסף 24 μL של תמיסת מלאי PMSF ו- 776 μL של RB.
   4. בקרת איזופרופנול: הוסף 24 μL של isopropanol ו 776 μL של RB.
   5. דוגמאות: פיפטה 200 μL של פתרון מדגם מוכן ולהוסיף 600 μL של RB.
   6. בקרות צבע (במידת הצורך): פיפטה 200 μL של הפתרון לדוגמה ולהוסיף 800 μL של RB.
2. הוסף 100 μL של תמיסת האלסטאז (10 מיקרוגרם/מ"ל) לכל צינור, למעט פקדי הצבע.
3. יש לדגור על כל הצינורות בטמפרטורת החדר למשך 20 דקות.
4. הוסף 100 μL של תמיסת מצע SANA (0.8 mM) לכל צינור, למעט פקדי הצבע.
5. ערבבו היטב את התמיסות על ידי היפוך עדין של הצינורות מספר פעמים. העבר 300 μL מכל צינור לצלחת של 96 בארות, תוך הבטחת מדידות משולשות עבור כל דגימה.
6. הניחו את הצלחת בעלת 96 הבארות בקורא מיקרו-צלחות המוגדר ל-410 ננומטר. מדוד את הספיגה מעת לעת, כל דקה, במשך 20 דקות או עד שהאות מתייצב. הגדר את הקורא למדוד בטמפרטורת החדר.
   הערה: אם קורא הלוחות תומך במדידות קינטיות, תכנת אותו לבצע קריאות באופן אוטומטי במרווחי זמן קבועים. אחרת, רשום ידנית את הספיגה בנקודות הזמן הרצויות.

7. ניתוח נתונים

1. נרמל את התוצאות על ידי הגדרת בקרת עיכוב חיובית (PMSF) כעיכוב 100% ואת הבקרה השלילית (RB בלבד) כעיכוב 0%.
2. חשב את אחוז העיכוב עבור כל דגימה באמצעות הנוסחה הבאה:
   % עיכוב = 100 - [(ספיגת דגימה - ספיגת בקרת רכב - ספיגת בקרת צבע)/(ספיגת בקרה שלילית - ספיגת בקרה חיובית - ספיגת בקרת איזופרופנול)] × 100
3. השתמש בתוכנת גרפים כדי להתוות את אחוזי העיכוב עבור כל ריכוז דגימה כנגד ריכוז הדגימה כדי להמחיש את אפקט המעכב.

תוצאות

לאחר השלמת הפרוטוקול, ניתן לקבל את נתוני הספיגה הדרושים לביצוע החישובים הרלוונטיים ולכימות יכולת הדגימות לווסת את פעילות האלסטאז. איור 3 מדגיש את מיקום הבארות בעזרת הבקרות והדגימות השונות. במקרה של דגימות צבעוניות, כמו זו המשמשת בדוגמה זו, יש צורך להוסיף...

Discussion

בשיטה הנוכחית נבדקות ההשפעות המודולריות של פיטוכימיקלים על אנזימי אלסטאז באמצעות בדיקה קולורימטרית. אלסטאז, פרוטאז סרין החיוני לפירוק אלסטין, ממלא תפקיד משמעותי בשמירה על גמישות הרקמה באיברים שונים. בדיקת האלסטאז הקולורימטרי המתוארת בעבודה זו מציעה שיטה פשוטה, רגישה ?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
96 Well Cell Culture Plate	Corning Incorporated	3599	Flat bottom with lid, polystyrene
Cell Imaging Multimode Reader	Agilent	BioTek Cytation 1	Used with Gen5 software
Elastase From Porcine Pancreas	Sigma-Aldrich	E7885	CAS 39445-21-1; 25,9 kDa
Isopropanol 99.5%	Fisher Scientific	AC184130010	CAS 67-63-0; C3H8O; 60.10 g/mol
N-Succinil-(Ala)3-nitroanilide	Sigma-Aldrich	S4760	CAS 52299-14-6; C19H25N5O8 ; 451.43 g/mol
pH Meter	Hach Lange	sensION+ PH31	With magnetic stirrer and sensor holder
Phenylmethanesulfonyl Fluoride	Sigma-Aldrich	P7626	CAS 329-98-6; C7H7FO2S; 174,19 g/mol
Tris For Molecular Biology	PanReac AppliChem	A2264	CAS 77-86-1; C4H11NO3; 121,14 g/mol