Quantification de la modulation de l’activité de l’enzyme élastase par analyse colorimétrique

Résumé

Ce protocole décrit le développement d’une méthode d’essai colorimétrique pour déterminer la capacité des composés à inhiber ou à activer l’activité de l’élastase.

Résumé

L’élastase, une protéase à sérine, joue un rôle essentiel dans la dégradation de l’élastine. L’élastine est une protéine extracellulaire qui aide à maintenir l’élasticité des tissus dans les poumons, la peau et les vaisseaux sanguins. Une régulation stricte de l’activité de l’élastase est cruciale pour l’homéostasie tissulaire, car la dérégulation peut contribuer à des pathologies telles que l’emphysème, les rides et l’athérosclérose. Certains composés, tels que les composés phytochimiques naturels, ont montré un potentiel d’intervention thérapeutique et ont suscité un intérêt considérable. L’élucidation des effets modulateurs de différents composés sur l’élastase, qu’ils soient inhibiteurs ou stimulants, est cruciale pour développer de nouvelles stratégies thérapeutiques et cosmétiques ciblant les troubles associés à l’élastase. Une méthode largement acceptée pour mesurer l’activité de l’élastase est le dosage colorimétrique de l’élastase. Dans ce test, un substrat spécifique est utilisé pour décomposer l’élastase, libérant ainsi un composé jaune détectable, la p-nitroaniline (pNA). La quantité de pNA produite reflète l’activité de l’élastase dans l’échantillon et peut être mesurée par colorimétrie. Ce test offre plusieurs avantages, notamment la simplicité, une sensibilité élevée, des résultats rapides et une adaptabilité à divers besoins de recherche. Le dosage colorimétrique de l’élastase reste un outil précieux pour étudier l’impact des composés sur l’activité de l’élastase. En raison de sa facilité d’utilisation et de son efficacité, ce test est une pierre angulaire de la recherche dans ce domaine.

Introduction

L’élastase est une enzyme protéase à sérine qui joue un rôle crucial dans la décomposition de l’élastine, une protéine qui fournit de l’élasticité à divers tissus du corps, notamment les poumons, la peau et les vaisseaux sanguins. L’activité de l’élastase est étroitement régulée pour maintenir l’homéostasie tissulaire, et la dérégulation peut entraîner des affections pathologiques et cutanées telles que l’emphysème, l’athérosclérose et les rides de la peau¹.

Il existe plusieurs types d’élastases, chacune ayant des caractéristiques et des fonctions spécifiques. Les élastases neutrophiles, produites par les neutrophiles, jouent un rôle important dans la réponse immunitaire et l’inflammation. Ces enzymes peuvent dégrader une grande variété de protéines extracellulaires et sont impliquées dans les maladies inflammatoires chroniques². Les élastases pancréatiques, quant à elles, jouent un rôle dans la digestion des protéines dans l’intestin grêle³. La distinction entre ces élastases est cruciale pour développer des thérapies spécifiques pour différentes maladies.

Des niveaux sains d’élastine et des voies qui régulent l’activité de l’élastase aident à préserver l’élasticité de la peau et à prévenir le vieillissement prématuré. Des facteurs tels que le vieillissement, les rayons UV, l’inflammation, la prédisposition génétique, les polluants environnementaux et la nutrition influencent considérablement l’activité et la dégradation de l’élastase⁴. Un domaine d’intérêt émergent est l’étude des élastokines, des fragments bioactifs générés par la dégradation de l’élastine par l’élastase. Ces molécules peuvent induire des effets biologiques importants, notamment une inflammation accrue, une calcification des fibres élastiques et un dépôt de lipides, entre autres⁵. Les élastokines peuvent influencer la progression des maladies associées à la dégradation de l’élastine et offrir une cible potentielle pour de nouvelles interventions thérapeutiques (Figure 1).

Certains composés, tels que les composés phytochimiques naturels, ont fait l’objet d’une attention considérable pour leurs effets thérapeutiques et cosmétiques potentiels, y compris leur capacité à moduler l’activité de l’élastase⁶. Par exemple, il a été démontré que la quercétine, un flavonoïde présent dans les pommes et les oignons, inhibe efficacement l’activité de l’élastase, ce qui contribue à ses effets anti-inflammatoires et anti-âge⁷. La curcumine, le composé bioactif du curcuma, est un autre composé phytochimique bien étudié qui présente une inhibition de l’élastase, offrant des effets protecteurs contre le vieillissement cutané et l’inflammation⁸. De plus, l’épigallocatéchine gallate (EGCG), la catéchine primaire du thé vert, a démontré une puissante activité inhibitrice de l’élastase, ce qui en fait un composé précieux pour les formulations de soins de la peau visant à préserver l’élasticité de la peau⁹. Ces exemples soulignent le potentiel des composés phytochimiques en tant qu’inhibiteurs naturels de l’élastase, fournissant une base pour le développement de nouveaux produits thérapeutiques et cosmétiques.

Actuellement, le dosage colorimétrique de l’élastase est une méthode largement utilisée pour mesurer l’activité de l’élastase 7,10,11,12,13. Ce test repose sur la capacité de l’enzyme à hydrolyser un substrat spécifique, le N-succinyl-(Ala)3-nitroanilide (SANA), en acides succinylaminés et en p-nitroaniline (pNA). Le pNA est un chromophore de couleur jaune qui peut être facilement détecté à 410 nm à l’aide d’un spectrophotomètre (Figure 2). Le taux de production de pNA est directement proportionnel à l’activité de l’élastase dans l’échantillon¹⁴.

Cette méthode a un large éventail d’applications dans divers domaines de recherche. Grâce à cette méthode, les chercheurs peuvent rapidement identifier la capacité des composés à moduler l’activité de l’élastase, étudier les mécanismes d’action des inhibiteurs de l’élastase et évaluer l’efficacité de ces inhibiteurs dans des modèles cellulaires et animaux de maladies liées à l’élastase. De plus, le test peut être utilisé pour étudier différents mécanismes d’inhibition, tels que l’inhibition compétitive ou non compétitive, fournissant des informations précieuses sur la façon dont les composés naturels ou synthétiques modulent l’activité de l’élastase.

Le test de modulation de l’activité de l’élastase offre plusieurs avantages par rapport aux autres méthodes de mesure de l’activité de l’élastase. Il est simple et facile à réaliser, nécessite une expertise technique minimale et peut être réalisé dans un cadre de laboratoire standard¹⁵. De plus, le test est très sensible et peut détecter de petits changements dans l’activité de l’élastase. Le test fournit des résultats rapides et quantitatifs, permettant une analyse efficace des données. De plus, il peut être adapté à divers formats, notamment le criblage à haut débit et les études cinétiques¹⁶.

Cependant, le test présente également plusieurs limites, telles qu’une faible spécificité du substrat (car il est spécifique de l’élastase) et une sensibilité à l’interférence d’autres composants de l’échantillon, tels que des composés colorés ou des inhibiteurs de l’hydrolyse de la pNA. Par conséquent, les chercheurs doivent tenir compte de ces limites et utiliser des méthodes complémentaires pour étudier de manière exhaustive les mécanismes sous-jacents à l’action des inhibiteurs de l’élastase¹⁷.

Il existe d’autres méthodes de surveillance de l’activité de l’élastase, telles que la zymographie, qui offre un excellent outil pour identifier et différencier diverses isoformes d’élastase, ce qui est crucial lors de l’étude des contributions spécifiques de différents sous-types d’élastase à un processus pathologique particulier. Cependant, la zymographie est une technique semi-quantitative et nécessite des étapes supplémentaires pour la visualisation ; Ainsi, par rapport à la méthode spectrophotométrique, la zymographie est moins efficace pour l’analyse à haut débit¹⁸. Les tests fluorométriques offrent une sensibilité accrue à la méthode spectrophotométrique, offrant des limites de détection plus basses. Cela permet une analyse plus sensible de l’activité de l’élastase et des interactions des modulateurs, fournissant une image plus complète des processus enzymatiques¹⁹. Cependant, les tests fluorométriques nécessitent une instrumentation spécialisée et peuvent être sensibles à l’interférence de certains composés dans les échantillons biologiques. Les tests radiométriques atteignent une sensibilité exceptionnelle, ce qui les rend idéaux pour la détection de très faibles niveaux d’activité de l’élastase. Cependant, l’utilisation de matières radioactives nécessite de l’équipement spécialisé, des protocoles de sécurité stricts et des procédures appropriées d’élimination des déchets, ce qui pose des défis logistiques et des problèmes de sécurité²⁰. Les immunoessais se distinguent par leur polyvalence et peuvent être utilisés pour mesurer directement l’activité de l’élastase ou quantifier les complexes élastases-inhibiteurs, fournissant ainsi des informations sur l’efficacité des inhibiteurs. De plus, les immunoessais peuvent être adaptés pour fonctionner avec des échantillons biologiques complexes, tels que des homogénats de tissus, contrairement à la méthode SANA. Cependant, la mise au point et la validation d’immunoessais peuvent prendre du temps et nécessiter des anticorps spécifiques, ce qui peut entraîner des coûts plus élevés que ceux d’approches spectrophotométriques plus simples²¹.

Le test colorimétrique de modulation de l’activité de l’élastase est un outil précieux pour étudier la capacité de tout composé à modifier l’activité de l’élastase. En raison de sa simplicité, de sa sensibilité et de son adaptabilité, la méthode est largement utilisée dans divers contextes de recherche. Cependant, les chercheurs doivent tenir compte des limites du test et utiliser des méthodes complémentaires pour déterminer de manière exhaustive les mécanismes sous-jacents à l’activité des inhibiteurs de l’élastase.

Protocole

Les détails des réactifs et de l’équipement utilisés pour cette étude sont énumérés dans la table des matériaux.

1. Préparation du tampon de réaction tris base (RB) de 0,2 M

1. Pesez la base Tris correspondante à l’aide d’une balance analytique.
2. Transférez la base Tris dans un bécher et ajoutez de l’eau déminéralisée à l’aide d’un cylindre gradué.
3. Agitez la solution à l’aide d’un agitateur magnétique jusqu’à ce que la base Tris soit complètement dissoute.
4. Ajustez le pH à 8,0 en ajoutant 4 N HCl goutte à goutte. Utilisez un pH-mètre pour surveiller le pH.
5. Une fois le pH souhaité atteint, transférez la solution dans une fiole jaugée et remplissez jusqu’au repère de volume souhaité avec de l’eau désionisée.
6. Transférez le tampon dans une bouteille de stockage étiquetée et conservez-le à température ambiante jusqu’à utilisation.

2. Préparation de l’échantillon

1. Pesez avec précision la quantité requise d’échantillons à l’aide d’une balance analytique. Pour cette étude, 1 mg de chaque échantillon est suffisant.
2. Dissoudre les échantillons dans RB à la concentration souhaitée. Différentes concentrations d’échantillons peuvent être testées, 1 mg/mL étant une bonne référence.
3. Utilisez un mélangeur vortex pour vous assurer que les échantillons sont complètement dissous.
4. Conservez les échantillons préparés sur de la glace jusqu’à ce qu’ils soient prêts à l’emploi.
   REMARQUE : Si l’échantillon présente une forte coloration susceptible d’interférer avec les lectures d’absorbance, préparez des contrôles de couleur en suivant la même procédure, mais sans ajouter d’enzyme élastase dans les étapes ultérieures.

3. Préparation de l’enzyme élastase

1. Préparer une solution de travail d’élastase dans du RB à une concentration finale de 10 μg/mL. Utilisez l’équation suivante pour calculer le volume requis de solution mère :
   Volume de la matière (μL) = Volume final souhaité (μL) x Concentration finale souhaitée (μg/mL)/Concentration de la matière (μg/mL)
2. Conservez la solution d’élastase préparée sur de la glace jusqu’à ce qu’elle soit prête à l’emploi.
   REMARQUE : Tenez compte de l’activité spécifique de l’enzyme telle que fournie par le fournisseur, qui peut varier d’un lot à l’autre. De plus, l’activité enzymatique peut diminuer après la congélation ; Préparez des solutions fraîches lorsque cela est possible.

4. Préparation du substrat SANA

1. Préparez 0,8 mM de solution SANA en dissolvant la quantité appropriée de poudre SANA dans RB. Utilisez l’équation suivante :
   Masse de SANA (mg) = Volume final souhaité (μL) × Concentration finale souhaitée (mM) × Poids moléculaire (mg/mmol)/1000
2. Protégez la solution de la lumière et conservez-la à 4 °C jusqu’à utilisation.

5. Préparation de la solution mère de fluorure de phénylméthylsulfonyle (PMSF)

1. Préparer 100 mM de solution mère de PMSF dans de l’isopropanol.
2. Conservez la solution PMSF préparée sur de la glace jusqu’à ce qu’elle soit prête à l’emploi.
   REMARQUE : Aliquoter la solution de PMSF dans de plus petits volumes (p. ex., 100 μL) et l’entreposer à -20 °C pour éviter les cycles de gel-dégel.

6. Mise en place du test

1. Préparez les solutions suivantes en trois exemplaires dans des tubes de microcentrifugation :
   1. Contrôle négatif : Pipette 800 μL de RB.
   2. Contrôle du véhicule : Ajouter 600 μL de RB et 200 μL du solvant utilisé pour dissoudre l’échantillon.
   3. Contrôle de l’inhibition positive : Ajouter 24 μL de solution mère de PMSF et 776 μL de RB.
   4. Contrôle de l’isopropanol : Ajouter 24 μL d’isopropanol et 776 μL de RB.
   5. Echantillons : Pipeter 200 μL de la solution d’échantillon préparée et ajouter 600 μL de RB.
   6. Contrôles de couleur (si nécessaire) : Pipeter 200 μL de la solution d’échantillon et ajouter 800 μL de RB.
2. Ajouter 100 μL de la solution d’élastase (10 μg/mL) dans chaque tube, à l’exception des commandes de couleur.
3. Incuber tous les tubes à température ambiante pendant 20 min.
4. Ajouter 100 μL de solution de substrat SANA (0,8 mM) dans chaque tube, à l’exception des commandes de couleur.
5. Mélangez soigneusement les solutions en retournant doucement les tubes plusieurs fois. Transférez 300 μL de chaque tube sur une plaque de 96 puits, en assurant des mesures en trois exemplaires pour chaque échantillon.
6. Placez la plaque à 96 puits dans un lecteur de microplaques réglé à 410 nm. Mesurez l’absorbance périodiquement, toutes les minutes, pendant 20 minutes ou jusqu’à ce que le signal se stabilise. Réglez le lecteur pour qu’il mesure à température ambiante.
   REMARQUE : Si le lecteur de plaques prend en charge les mesures cinétiques, programmez-le pour qu’il prenne automatiquement des mesures à des intervalles définis. Sinon, enregistrez manuellement l’absorbance aux points temporels souhaités.

7. Analyse des données

1. Normalisez les résultats en définissant le contrôle d’inhibition positive (PMSF) à 100 % d’inhibition et le contrôle négatif (RB uniquement) à 0 % d’inhibition.
2. Calculez le pourcentage d’inhibition pour chaque échantillon à l’aide de la formule suivante :
   % d’inhibition = 100 - [(Absorbance de l’échantillon - Absorbance de contrôle du véhicule - Absorbance de contrôle de couleur)/(Absorbance de contrôle négatif - Absorbance de contrôle positif - Absorbance de contrôle de l’isopropanol)] × 100
3. Utilisez un logiciel graphique pour tracer les pourcentages d’inhibition de chaque concentration d’échantillon par rapport à la concentration d’échantillon afin de visualiser l’effet inhibiteur.

Résultats

Une fois le protocole terminé, les données d’absorbance nécessaires pour effectuer les calculs pertinents et quantifier la capacité des échantillons à moduler l’activité de l’élastase peuvent être obtenues. La figure 3 met en évidence l’emplacement des puits avec les différents contrôles et échantillons. Dans le cas d’échantillons colorés, comme celui utilisé dans cet exemple, il est nécessaire d’ajouter des contrôles de couleur...

Discussion

Dans la présente méthode, les effets modulateurs des composés phytochimiques sur les enzymes élastases sont examinés à l’aide d’un dosage colorimétrique. L’élastase, une protéase à sérine cruciale pour la dégradation de l’élastine, joue un rôle important dans le maintien de l’élasticité des tissus dans divers organes. Le dosage colorimétrique de l’élastase décrit dans ce travail offre une méthode simple, sensible et rapide pour mesurer l’activité de l?...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
96 Well Cell Culture Plate	Corning Incorporated	3599	Flat bottom with lid, polystyrene
Cell Imaging Multimode Reader	Agilent	BioTek Cytation 1	Used with Gen5 software
Elastase From Porcine Pancreas	Sigma-Aldrich	E7885	CAS 39445-21-1; 25,9 kDa
Isopropanol 99.5%	Fisher Scientific	AC184130010	CAS 67-63-0; C3H8O; 60.10 g/mol
N-Succinil-(Ala)3-nitroanilide	Sigma-Aldrich	S4760	CAS 52299-14-6; C19H25N5O8 ; 451.43 g/mol
pH Meter	Hach Lange	sensION+ PH31	With magnetic stirrer and sensor holder
Phenylmethanesulfonyl Fluoride	Sigma-Aldrich	P7626	CAS 329-98-6; C7H7FO2S; 174,19 g/mol
Tris For Molecular Biology	PanReac AppliChem	A2264	CAS 77-86-1; C4H11NO3; 121,14 g/mol