Quantification de la modulation de l’activité de l’enzyme élastase par analyse colorimétrique

Résumé

Ce protocole décrit le développement d’une méthode d’essai colorimétrique pour déterminer la capacité des composés à inhiber ou à activer l’activité de l’élastase.

Résumé

L’élastase, une protéase à sérine, joue un rôle essentiel dans la dégradation de l’élastine. L’élastine est une protéine extracellulaire qui aide à maintenir l’élasticité des tissus dans les poumons, la peau et les vaisseaux sanguins. Une régulation stricte de l’activité de l’élastase est cruciale pour l’homéostasie tissulaire, car la dérégulation peut contribuer à des pathologies telles que l’emphysème, les rides et l’athérosclérose. Certains composés, tels que les composés phytochimiques naturels, ont montré un potentiel d’intervention thérapeutique et ont suscité un intérêt considérable. L’élucidation des effets modulateurs de différents composés sur l’élastase, qu’ils soient inhibiteurs ou stimulants, est cruciale pour développer de nouvelles stratégies thérapeutiques et cosmétiques ciblant les troubles associés à l’élastase. Une méthode largement acceptée pour mesurer l’activité de l’élastase est le dosage colorimétrique de l’élastase. Dans ce test, un substrat spécifique est utilisé pour décomposer l’élastase, libérant ainsi un composé jaune détectable, la p-nitroaniline (pNA). La quantité de pNA produite reflète l’activité de l’élastase dans l’échantillon et peut être mesurée par colorimétrie. Ce test offre plusieurs avantages, notamment la simplicité, une sensibilité élevée, des résultats rapides et une adaptabilité à divers besoins de recherche. Le dosage colorimétrique de l’élastase reste un outil précieux pour étudier l’impact des composés sur l’activité de l’élastase. En raison de sa facilité d’utilisation et de son efficacité, ce test est une pierre angulaire de la recherche dans ce domaine.

Introduction

L’élastase est une enzyme protéase à sérine qui joue un rôle crucial dans la décomposition de l’élastine, une protéine qui fournit de l’élasticité à divers tissus du corps, notamment les poumons, la peau et les vaisseaux sanguins. L’activité de l’élastase est étroitement régulée pour maintenir l’homéostasie tissulaire, et la dérégulation peut entraîner des affections pathologiques et cutanées telles que l’emphysème, l’athérosclérose et les rides de la peau¹.

Il existe plusieurs types d’élastases, chacune ayant des caractéristiques et des fonctions spécifiques. Les élastases neutrophi....

Protocole

Les détails des réactifs et de l’équipement utilisés pour cette étude sont énumérés dans la table des matériaux.

1. Préparation du tampon de réaction tris base (RB) de 0,2 M

1. Pesez la base Tris correspondante à l’aide d’une balance analytique.
2. Transférez la base Tris dans un bécher et ajoutez de l’eau déminéralisée à l’aide d’un cylindre gradué.
3. Agitez la solution à l’aide d’un agitateur magnétique jusqu’à ce que la base Tris soit complètement dissoute.
4. Ajustez le pH à 8,0 en ajoutant 4 N HCl goutte à goutte. Utilisez un pH-mètre pou....

Discussion

Dans la présente méthode, les effets modulateurs des composés phytochimiques sur les enzymes élastases sont examinés à l’aide d’un dosage colorimétrique. L’élastase, une protéase à sérine cruciale pour la dégradation de l’élastine, joue un rôle important dans le maintien de l’élasticité des tissus dans divers organes. Le dosage colorimétrique de l’élastase décrit dans ce travail offre une méthode simple, sensible et rapide pour mesurer l’activité de l?.......

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
96 Well Cell Culture Plate	Corning Incorporated	3599	Flat bottom with lid, polystyrene
Cell Imaging Multimode Reader	Agilent	BioTek Cytation 1	Used with Gen5 software
Elastase From Porcine Pancreas	Sigma-Aldrich	E7885	CAS 39445-21-1; 25,9 kDa
Isopropanol 99.5%	Fisher Scientific	AC184130010	CAS 67-63-0; C3H8O; 60.10 g/mol
N-Succinil-(Ala)3-nitroanilide	Sigma-Aldrich	S4760	CAS 52299-14-6; C19H25N5O8 ; 451.43 g/mol
pH Meter	Hach Lange	sensION+ PH31	With magnetic stirrer and sensor holder
Phenylmethanesulfonyl Fluoride	Sigma-Aldrich	P7626	CAS 329-98-6; C7H7FO2S; 174,19 g/mol
Tris For Molecular Biology	PanReac AppliChem	A2264	CAS 77-86-1; C4H11NO3; 121,14 g/mol