Cuantificación de la modulación de la actividad de la enzima elastasa mediante análisis colorimétrico

Resumen

Este protocolo describe el desarrollo de un método de ensayo colorimétrico para determinar la capacidad de los compuestos para inhibir o activar la actividad de la elastasa.

Resumen

La elastasa, una serina proteasa, desempeña un papel esencial en la degradación de la elastina. La elastina es una proteína extracelular que ayuda a mantener la elasticidad de los tejidos en los pulmones, la piel y los vasos sanguíneos. La regulación estricta de la actividad de la elastasa es crucial para la homeostasis de los tejidos, ya que la desregulación puede contribuir a patologías como el enfisema, las arrugas y la aterosclerosis. Algunos compuestos, como los fitoquímicos naturales, han mostrado potencial para la intervención terapéutica y han atraído un interés significativo. Dilucidar los efectos moduladores de los diferentes compuestos sobre la elastasa, ya sean inhibidores o estimulantes, es crucial para desarrollar nuevas estrategias terapéuticas y cosméticas dirigidas a los trastornos asociados a la elastasa. Un método ampliamente aceptado para medir la actividad de la elastasa es el ensayo colorimétrico de elastasa. En este ensayo, se utiliza un sustrato específico para descomponer la elastasa, liberando un compuesto amarillo detectable, la p-nitroanilina (pNA). La cantidad de pNA producida refleja la actividad de la elastasa en la muestra y puede medirse mediante colorimetría. Este ensayo ofrece varios beneficios, que incluyen simplicidad, alta sensibilidad, resultados rápidos y adaptabilidad a diversas necesidades de investigación. El ensayo colorimétrico de elastasa sigue siendo una herramienta valiosa para estudiar cómo los compuestos afectan la actividad de la elastasa. Debido a su facilidad de uso y efectividad, este ensayo es una piedra angular de la investigación en este campo.

Introducción

La elastasa es una enzima serina proteasa que desempeña un papel crucial en la descomposición de la elastina, una proteína que proporciona elasticidad a varios tejidos del cuerpo, incluidos los pulmones, la piel y los vasos sanguíneos. La actividad de la elastasa está estrictamente regulada para mantener la homeostasis de los tejidos, y la desregulación puede provocar afecciones patológicas y dérmicas como enfisema, aterosclerosis y arrugas de la^piel.

Existen varios tipos de elastasas, cada uno con características y funciones específicas. Las elastasas de neutrófilos, producidas por los neutrófilos, son importantes en la respuesta inmunitaria y la inflamación. Estas enzimas pueden degradar una amplia variedad de proteínas extracelulares y están involucradas en enfermedades inflamatorias crónicas². Las elastasas pancreáticas, por otro lado, desempeñan un papel en la digestión de proteínas en el intestino delgado³. Distinguir entre estas elastasas es crucial para desarrollar terapias específicas para diferentes enfermedades.

Los niveles saludables de elastina y las vías que regulan la actividad de la elastasa ayudan a preservar la elasticidad de la piel y previenen el envejecimiento prematuro. Factores como el envejecimiento, la radiación UV, la inflamación, la predisposición genética, los contaminantes ambientales y la nutrición influyen significativamente en la actividad y degradación de la elastasa⁴. Un área de interés emergente es el estudio de las elastocinas, fragmentos bioactivos generados por la degradación de la elastina por la elastasa. Estas moléculas pueden inducir efectos biológicos significativos, incluyendo aumento de la inflamación, calcificación de fibras elásticas y deposición de lípidos, entre otros⁵. Las elastocinas pueden influir en la progresión de enfermedades asociadas con la degradación de la elastina y ofrecer una diana potencial para nuevas intervenciones terapéuticas (Figura 1).

Algunos compuestos, como los fitoquímicos naturales, han ganado una atención significativa por sus posibles efectos terapéuticos y cosméticos, incluida su capacidad para modular la actividad de la elastasa⁶. Por ejemplo, se ha demostrado que la quercetina, un flavonoide que se encuentra en las manzanas y las cebollas, inhibe eficazmente la actividad de la elastasa, lo que contribuye a^{sus efectos} antiinflamatorios y antienvejecimiento. La curcumina, el compuesto bioactivo de la cúrcuma, es otro fitoquímico bien estudiado que exhibe inhibición de la elastasa, ofreciendo efectos protectores contra el envejecimiento y la inflamación de la^piel. Además, el galato de epigalocatequina (EGCG), la catequina principal en el té verde, ha demostrado una potente actividad inhibidora de la elastasa, lo que lo convierte en un compuesto valioso para las formulaciones de cuidado de la piel destinadas a preservar la elasticidad^{de la} piel. Estos ejemplos subrayan el potencial de los fitoquímicos como inhibidores naturales de la elastasa, proporcionando una base para el desarrollo de nuevos productos terapéuticos y cosméticos.

Actualmente, el ensayo colorimétrico de elastasa es un método ampliamente utilizado para medir la actividad de la elastasa 7,10,11,12,13. Este ensayo se basa en la capacidad de la enzima para hidrolizar un sustrato específico, N-succinil-(Ala)3-nitroanilide (SANA), en ácidos succinilamino y p-nitroanilina (pNA). El pNA es un cromóforo de color amarillo que puede detectarse fácilmente a 410 nm utilizando un espectrofotómetro (Figura 2). La tasa de producción de pNA es directamente proporcional a la actividad de la elastasa en la muestra¹⁴.

Este método tiene una amplia gama de aplicaciones en diversos campos de investigación. A través de este método, los investigadores pueden identificar rápidamente la capacidad de los compuestos para modular la actividad de la elastasa, investigar los mecanismos de acción de los inhibidores de la elastasa y evaluar la eficacia de estos inhibidores en modelos celulares y animales de enfermedades relacionadas con la elastasa. Además, el ensayo se puede utilizar para estudiar diferentes mecanismos de inhibición, como la inhibición competitiva o no competitiva, proporcionando información valiosa sobre cómo los compuestos naturales o sintéticos modulan la actividad de la elastasa.

El ensayo de modulación de la actividad de la elastasa ofrece varias ventajas sobre otros métodos para medir la actividad de la elastasa. Es simple y fácil de realizar, requiere una experiencia técnica mínima y se puede realizar en un entorno de laboratorio estándar¹⁵. Además, el ensayo es muy sensible y puede detectar pequeños cambios en la actividad de la elastasa. El ensayo proporciona resultados rápidos y cuantitativos, lo que permite un análisis de datos eficiente. Además, se puede adaptar a varios formatos, incluyendo el cribado de alto rendimiento y los estudios cinéticos¹⁶.

Sin embargo, el ensayo también tiene varias limitaciones, como la baja especificidad del sustrato (ya que es específico de la elastasa) y la susceptibilidad a la interferencia de otros componentes de la muestra, como compuestos coloreados o inhibidores de la hidrólisis de pNA. Por lo tanto, los investigadores deben considerar estas limitaciones y utilizar métodos complementarios para investigar de manera integral los mecanismos que subyacen a la acción de los inhibidores de la elastasa¹⁷.

Existen métodos alternativos de monitorización de la actividad de la elastasa, como la zimografía, que ofrece una excelente herramienta para identificar y diferenciar varias isoformas de elastasa, lo cual es crucial cuando se estudian las contribuciones específicas de los diferentes subtipos de elastasa a un proceso de enfermedad en particular. Sin embargo, la zimografía es una técnica semicuantitativa y requiere pasos adicionales para su visualización; Por lo tanto, en comparación con el método espectrofotométrico, la zimografía es menos eficiente para el análisis de alto rendimiento¹⁸. Los ensayos fluorométricos ofrecen una mayor sensibilidad al método espectrofotométrico, proporcionando límites de detección más bajos. Esto permite un análisis más sensible de la actividad de la elastasa y las interacciones de los moduladores, proporcionando una imagen más completa de los procesos enzimáticos¹⁹. Sin embargo, los ensayos fluorométricos requieren instrumentación especializada y pueden ser susceptibles a la interferencia de ciertos compuestos en muestras biológicas. Los ensayos radiométricos alcanzan una sensibilidad excepcional, lo que los hace ideales para la detección de niveles muy bajos de actividad elastasa. Sin embargo, el uso de materiales radiactivos requiere equipos especializados, protocolos de seguridad estrictos y procedimientos adecuados de eliminación de desechos, lo que plantea desafíos logísticos y preocupaciones de seguridad²⁰. Los inmunoensayos destacan por su versatilidad y pueden utilizarse para medir directamente la actividad de la elastasa o cuantificar complejos de inhibidores de elastasa, lo que proporciona información sobre la eficacia de los inhibidores. Además, los inmunoensayos se pueden adaptar para trabajar con muestras biológicas complejas, como homogeneizados de tejidos, a diferencia del método SANA. Sin embargo, el desarrollo y la validación de inmunoensayos pueden llevar mucho tiempo y requerir anticuerpos específicos, lo que puede generar costos más altos que los de los enfoques espectrofotométricos más simples²¹.

El ensayo colorimétrico de modulación de la actividad de la elastasa es una herramienta valiosa para investigar la capacidad de cualquier compuesto para modificar la actividad de la elastasa. Debido a su simplicidad, sensibilidad y adaptabilidad, el método es ampliamente utilizado en diversos entornos de investigación. Sin embargo, los investigadores deben considerar las limitaciones del ensayo y utilizar métodos complementarios para determinar de manera integral los mecanismos subyacentes a la actividad de los inhibidores de la elastasa.

Protocolo

Los detalles de los reactivos y el equipo utilizado para este estudio se enumeran en la Tabla de Materiales.

1. Preparación de tampón de reacción base Tris de 0,2 M (RB)

1. Pesar la base Tris correspondiente utilizando una balanza analítica.
2. Transfiera la base Tris a un vaso de precipitados y agregue agua desionizada usando un cilindro graduado.
3. Revuelva la solución con un agitador magnético hasta que la base Tris se disuelva por completo.
4. Ajuste el pH a 8.0 agregando 4 N HCl gota a gota. Use un medidor de pH para controlar el pH.
5. Una vez alcanzado el pH deseado, transfiera la solución a un matraz volumétrico y llénela hasta la marca de volumen deseada con agua desionizada.
6. Transfiera el tampón a una botella de almacenamiento etiquetada y guárdelo a temperatura ambiente hasta que lo use.

2. Preparación de la muestra

1. Pese con precisión la cantidad requerida de las muestras utilizando una balanza analítica. Para este estudio, 1 mg de cada muestra es suficiente.
2. Disolver las muestras en RB hasta la concentración deseada. Se pueden analizar diferentes concentraciones de muestra, siendo 1 mg/mL una buena referencia.
3. Utilice un mezclador de vórtice para asegurarse de que las muestras se disuelvan por completo.
4. Guarde las muestras preparadas en hielo hasta que estén listas para su uso.
   NOTA: Si la muestra tiene una coloración fuerte que podría interferir con las lecturas de absorbancia, prepare los controles de color siguiendo el mismo procedimiento pero sin agregar enzima elastasa en pasos posteriores.

3. Preparación de la enzima elastasa

1. Preparar una solución de trabajo de elastasa en RB a una concentración final de 10 μg/mL. Utilice la siguiente ecuación para calcular el volumen requerido de solución madre:
   Volumen de existencias (μL) = Volumen final deseado (μL) x Concentración final deseada (μg/mL)/Concentración de existencias (μg/mL)
2. Guarde la solución de elastasa preparada en hielo hasta que esté lista para usar.
   NOTA: Tenga en cuenta la actividad específica de la enzima proporcionada por el proveedor, que puede variar entre lotes. Además, la actividad enzimática puede disminuir después de la congelación; Prepare soluciones frescas cuando sea posible.

4. Preparación del sustrato SANA

1. Prepare 0,8 mM de solución de SANA disolviendo la cantidad adecuada de polvo de SANA en RB. Utilice la siguiente ecuación:
   Masa de SANA (mg) = Volumen final deseado (μL) × Concentración final deseada (mM) × Peso molecular (mg/mmol)/1000
2. Proteja la solución de la luz y guárdela a 4 °C hasta su uso.

5. Preparación de la solución madre de fluoruro de fenilmetilsulfonilo (PMSF)

1. Prepare 100 mM de solución madre de PMSF en isopropanol.
2. Guarde la solución de PMSF preparada en hielo hasta que esté lista para usar.
   NOTA: Alicuota la solución de PMSF en volúmenes más pequeños (por ejemplo, 100 μL) y almacene a -20 °C para evitar ciclos de congelación y descongelación.

6. Configuración del ensayo

1. Prepare las siguientes soluciones por triplicado en tubos de microcentrífuga:
   1. Control negativo: Pipeta 800 μL de RB.
   2. Control del vehículo: Añadir 600 μL de RB y 200 μL del disolvente utilizado para disolver la muestra.
   3. Control de inhibición positiva: Añadir 24 μL de solución madre de PMSF y 776 μL de RB.
   4. Control de isopropanol: Añadir 24 μL de isopropanol y 776 μL de RB.
   5. Muestras: Pipetear 200 μL de la solución de muestra preparada y añadir 600 μL de RB.
   6. Controles de color (si es necesario): Pipetear 200 μL de la solución de muestra y añadir 800 μL de RB.
2. Agregue 100 μL de la solución de elastasa (10 μg/mL) a cada tubo, excepto para los controles de color.
3. Incubar todos los tubos a temperatura ambiente durante 20 min.
4. Añadir 100 μL de solución de sustrato SANA (0,8 mM) a cada tubo, excepto los controles de color.
5. Mezcle bien las soluciones invirtiendo suavemente los tubos varias veces. Transfiera 300 μL de cada tubo a una placa de 96 pocillos, lo que garantiza mediciones triplicadas para cada muestra.
6. Coloque la placa de 96 pocillos en un lector de microplacas configurado a 410 nm. Mida la absorbancia periódicamente, cada minuto, durante 20 minutos o hasta que la señal se estabilice. Configure el lector para que mida a temperatura ambiente.
   NOTA: Si el lector de placas admite mediciones cinéticas, prográmelo para que tome lecturas automáticamente a intervalos establecidos. De lo contrario, registre manualmente la absorbancia en los puntos de tiempo deseados.

7. Análisis de datos

1. Normalice los resultados estableciendo el control de inhibición positiva (PMSF) como 100% de inhibición y el control negativo (RB solamente) como 0% de inhibición.
2. Calcule el porcentaje de inhibición de cada muestra utilizando la siguiente fórmula:
   % Inhibición = 100 - [(Absorbancia de la muestra - Absorbancia de control del vehículo - Absorbancia de control de color)/(Absorbancia de control negativo - Absorbancia de control positivo - Absorción de control de isopropanol)] × 100
3. Utilice software de gráficos para trazar los porcentajes de inhibición de cada concentración de muestra en comparación con la concentración de muestra para visualizar el efecto inhibidor.

Resultados

Una vez completado el protocolo, se pueden obtener los datos de absorbancia necesarios para realizar los cálculos pertinentes y cuantificar la capacidad de las muestras para modular la actividad de la elastasa. En la Figura 3 se destaca la ubicación de los pozos con los diferentes controles y muestras. En el caso de muestras coloreadas, como la utilizada en este ejemplo, es necesario agregar controles de color para minimizar la interferencia espectrofotom?...

Discusión

En el presente método, los efectos moduladores de los fitoquímicos sobre las enzimas elastasa se examinan mediante un ensayo colorimétrico. La elastasa, una serina proteasa crucial para la degradación de la elastina, desempeña un papel importante en el mantenimiento de la elasticidad de los tejidos en varios órganos. El ensayo colorimétrico de elastasa descrito en este trabajo ofrece un método sencillo, sensible y rápido para medir la actividad de la elastasa.

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
96 Well Cell Culture Plate	Corning Incorporated	3599	Flat bottom with lid, polystyrene
Cell Imaging Multimode Reader	Agilent	BioTek Cytation 1	Used with Gen5 software
Elastase From Porcine Pancreas	Sigma-Aldrich	E7885	CAS 39445-21-1; 25,9 kDa
Isopropanol 99.5%	Fisher Scientific	AC184130010	CAS 67-63-0; C3H8O; 60.10 g/mol
N-Succinil-(Ala)3-nitroanilide	Sigma-Aldrich	S4760	CAS 52299-14-6; C19H25N5O8 ; 451.43 g/mol
pH Meter	Hach Lange	sensION+ PH31	With magnetic stirrer and sensor holder
Phenylmethanesulfonyl Fluoride	Sigma-Aldrich	P7626	CAS 329-98-6; C7H7FO2S; 174,19 g/mol
Tris For Molecular Biology	PanReac AppliChem	A2264	CAS 77-86-1; C4H11NO3; 121,14 g/mol