Quantificando a modulação da atividade da enzima elastase por meio de análise colorimétrica

Resumo

Este protocolo descreve o desenvolvimento de um método de ensaio colorimétrico para determinar a capacidade dos compostos de inibir ou ativar a atividade da elastase.

Resumo

A elastase, uma serina protease, desempenha um papel essencial na degradação da elastina. A elastina é uma proteína extracelular que ajuda a manter a elasticidade dos tecidos nos pulmões, pele e vasos sanguíneos. A regulação rígida da atividade da elastase é crucial para a homeostase tecidual, pois a desregulação pode contribuir para patologias como enfisema, rugas e aterosclerose. Alguns compostos, como fitoquímicos naturais, mostraram potencial para intervenção terapêutica e atraíram interesse significativo. Elucidar os efeitos modulatórios de diferentes compostos na elastase, sejam inibitórios ou estimulatórios, é crucial para o desenvolvimento de novas estratégias terapêuticas e cosméticas direcionadas a distúrbios associados à elastase. Um método amplamente aceito para medir a atividade da elastase é o ensaio de elastase colorimétrica. Neste ensaio, um substrato específico é usado para quebrar a elastase, liberando um composto amarelo detectável, a p-nitroanilina (pNA). A quantidade de pNA produzida reflete a atividade da elastase na amostra e pode ser medida por colorimetria. Este ensaio oferece vários benefícios, incluindo simplicidade, alta sensibilidade, resultados rápidos e adaptabilidade a várias necessidades de pesquisa. O ensaio de elastase colorimétrica continua sendo uma ferramenta valiosa para estudar como os compostos afetam a atividade da elastase. Devido à sua facilidade de uso e eficácia, este ensaio é uma pedra angular da pesquisa neste campo.

Introdução

A elastase é uma enzima serina protease que desempenha um papel crucial na quebra da elastina, uma proteína que fornece elasticidade a vários tecidos do corpo, incluindo pulmões, pele e vasos sanguíneos. A atividade da elastase é rigidamente regulada para manter a homeostase do tecido, e a desregulação pode levar a condições patológicas e dérmicas, como enfisema, aterosclerose e rugas na pele¹.

Existem vários tipos de elastases, cada uma com características e funções específicas. As elastases de neutrófilos, produzidas por neutrófilos, são importantes na resposta imune e na inflamação. Essas enzimas podem degradar uma ampla variedade de proteínas extracelulares e estão envolvidas em doenças inflamatórias crônicas². As elastases pancreáticas, por outro lado, desempenham um papel na digestão de proteínas no intestino delgado³. A distinção entre essas elastases é crucial para o desenvolvimento de terapias específicas para diferentes doenças.

Níveis saudáveis de elastina e vias que regulam a atividade da elastase ajudam a preservar a elasticidade da pele e prevenir o envelhecimento prematuro. Fatores como envelhecimento, radiação UV, inflamação, predisposição genética, poluentes ambientais e nutrição influenciam significativamente a atividade e degradação da elastase⁴. Uma área emergente de interesse é o estudo de elastocinas, fragmentos bioativos gerados pela degradação da elastina pela elastase. Essas moléculas podem induzir efeitos biológicos significativos, incluindo aumento da inflamação, calcificação das fibras elásticas e deposição de lipídios, entre outros⁵. As elastocinas podem influenciar a progressão de doenças associadas à degradação da elastina e oferecer um alvo potencial para novas intervenções terapêuticas (Figura 1).

Alguns compostos, como fitoquímicos de ocorrência natural, ganharam atenção significativa por seus potenciais efeitos terapêuticos e cosméticos, incluindo sua capacidade de modular a atividade da elastase⁶. Por exemplo, a quercetina, um flavonóide encontrado em maçãs e cebolas, demonstrou inibir efetivamente a atividade da elastase, o que contribui para^{seus efeitos} anti-inflamatórios e antienvelhecimento. A curcumina, o composto bioativo da cúrcuma, é outro fitoquímico bem estudado que exibe inibição da elastase, oferecendo efeitos protetores contra o envelhecimento e a inflamação da pele⁸. Além disso, o galato de epigalocatequina (EGCG), a catequina primária do chá verde, demonstrou potente atividade inibitória da elastase, tornando-o um composto valioso para formulações de cuidados com a pele destinadas a preservar a elasticidade da pele⁹. Esses exemplos ressaltam o potencial dos fitoquímicos como inibidores naturais da elastase, fornecendo uma base para o desenvolvimento de novos produtos terapêuticos e cosméticos.

Atualmente, o ensaio de elastase colorimétrica é um método amplamente utilizado para medir a atividade da elastase 7,10,11,12,13. Este ensaio depende da capacidade da enzima de hidrolisar um substrato específico, N-succinil-(Ala)3-nitroanilida (SANA), em succinilaminoácidos e p-nitroanilina (pNA). O pNA é um cromóforo de cor amarela que pode ser facilmente detectado a 410 nm usando um espectrofotômetro (Figura 2). A taxa de produção de pNA é diretamente proporcional à atividade da elastase na amostra¹⁴.

Este método tem uma ampla gama de aplicações em vários campos de pesquisa. Por meio desse método, os pesquisadores podem identificar rapidamente a capacidade dos compostos de modular a atividade da elastase, investigar os mecanismos de ação dos inibidores da elastase e avaliar a eficácia desses inibidores em modelos celulares e animais de doenças relacionadas à elastase. Além disso, o ensaio pode ser usado para estudar diferentes mecanismos de inibição, como inibição competitiva ou não competitiva, fornecendo informações valiosas sobre como os compostos naturais ou sintéticos modulam a atividade da elastase.

O ensaio de modulação da atividade da elastase oferece várias vantagens sobre outros métodos para medir a atividade da elastase. É simples e fácil de executar, requer conhecimento técnico mínimo e pode ser conduzido em um ambiente de laboratório padrão¹⁵. Além disso, o ensaio é altamente sensível e pode detectar pequenas alterações na atividade da elastase. O ensaio fornece resultados rápidos e quantitativos, permitindo uma análise eficiente dos dados. Além disso, pode ser adaptado a vários formatos, incluindo triagem de alto rendimento e estudos cinéticos¹⁶.

No entanto, o ensaio também apresenta várias limitações, como baixa especificidade do substrato (por ser específico para elastase) e suscetibilidade à interferência de outros componentes da amostra, como compostos coloridos ou inibidores da hidrólise do pNA. Portanto, os pesquisadores devem considerar essas limitações e usar métodos complementares para investigar de forma abrangente os mecanismos subjacentes à ação dos inibidores da elastase¹⁷.

Existem métodos alternativos de monitoramento da atividade da elastase, como a zimografia, que oferece uma excelente ferramenta para identificar e diferenciar várias isoformas de elastase, o que é crucial ao estudar as contribuições específicas de diferentes subtipos de elastase para um determinado processo de doença. No entanto, a zimografia é uma técnica semiquantitativa e requer etapas adicionais para visualização; Assim, em comparação com o método espectrofotométrico, a zimografia é menos eficiente para análises de alto rendimento¹⁸. Os ensaios fluorométricos oferecem maior sensibilidade ao método espectrofotométrico, proporcionando limites de detecção mais baixos. Isso permite uma análise mais sensível da atividade da elastase e das interações do modulador, fornecendo uma imagem mais completa dos processos enzimáticos¹⁹. No entanto, os ensaios fluorométricos requerem instrumentação especializada e podem ser suscetíveis à interferência de certos compostos em amostras biológicas. Os ensaios radiométricos alcançam uma sensibilidade excepcional, tornando-os ideais para a detecção de níveis muito baixos de atividade de elastase. No entanto, o uso de materiais radioativos requer equipamentos especializados, protocolos de segurança rigorosos e procedimentos adequados de descarte de resíduos, o que representa desafios logísticos e preocupações de segurança²⁰. Os imunoensaios se destacam por sua versatilidade e podem ser usados para medir a atividade da elastase diretamente ou quantificar complexos elastase-inibidores, fornecendo informações sobre a eficácia do inibidor. Além disso, os imunoensaios podem ser adaptados para trabalhar com amostras biológicas complexas, como homogeneizados de tecidos, ao contrário do método SANA. No entanto, o desenvolvimento e a validação de imunoensaios podem ser demorados e requerem anticorpos específicos, potencialmente levando a custos mais altos do que os de abordagens espectrofotométricas mais simples²¹.

O ensaio de modulação da atividade da elastase colorimétrica é uma ferramenta valiosa para investigar a capacidade de qualquer composto de modificar a atividade da elastase. Devido à sua simplicidade, sensibilidade e adaptabilidade, o método é amplamente utilizado em vários ambientes de pesquisa. No entanto, os pesquisadores devem considerar as limitações do ensaio e usar métodos complementares para determinar de forma abrangente os mecanismos subjacentes à atividade dos inibidores da elastase.

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Protocolo

Os detalhes dos reagentes e do equipamento usado para este estudo estão listados na Tabela de Materiais.

1. Preparação do tampão de reação de base Tris 0,2 M (RB)

1. Pese a base Tris correspondente usando uma balança analítica.
2. Transfira a base Tris para um copo e adicione água deionizada usando um cilindro graduado.
3. Agite a solução com um agitador magnético até que a base Tris esteja completamente dissolvida.
4. Ajuste o pH para 8,0 adicionando 4 N HCl gota a gota. Use um medidor de pH para monitorar o pH.
5. Uma vez atingido o pH desejado, transferir a solução para um balão volumétrico e encher com água desionizada até à marca de volume desejada.
6. Transfira o tampão para um frasco de armazenamento rotulado e guarde-o em temperatura ambiente até o uso.

2. Preparação da amostra

1. Pese com precisão a quantidade necessária de amostras usando uma balança analítica. Para este estudo, 1 mg de cada amostra é suficiente.
2. Dissolver as amostras em RB até à concentração desejada. Diferentes concentrações de amostra podem ser testadas, sendo 1 mg/mL uma boa referência.
3. Use um misturador de vórtice para garantir que as amostras estejam totalmente dissolvidas.
4. Armazene as amostras preparadas no gelo até que estejam prontas para uso.
   NOTA: Se a amostra tiver uma coloração forte que possa interferir nas leituras de absorbância, prepare os controles de cor seguindo o mesmo procedimento, mas sem adicionar a enzima elastase em etapas posteriores.

3. Preparação da enzima elastase

1. Preparar uma solução de trabalho de elastase em RB a uma concentração final de 10 μg/ml. Use a seguinte equação para calcular o volume necessário de solução de estoque:
   Volume de estoque (μL) = Volume final desejado (μL) x Concentração final desejada (μg/mL)/Concentração de estoque (μg/mL)
2. Armazene a solução de elastase preparada no gelo até que esteja pronta para uso.
   NOTA: Considere a atividade específica da enzima fornecida pelo fornecedor, que pode variar entre os lotes. Além disso, a atividade enzimática pode diminuir após o congelamento; Prepare novas soluções quando possível.

4. Preparação do substrato SANA

1. Prepare 0,8 mM de solução SANA dissolvendo a quantidade apropriada de pó de SANA em RB. Use a seguinte equação:
   Massa de SANA (mg) = Volume final desejado (μL) × Concentração final desejada (mM) × Peso molecular (mg/mmol)/1000
2. Proteger a solução da luz e conservá-la a 4 °C até à utilização.

5. Preparação da solução-mãe de fluoreto de fenilmetilsulfonilo (PMSF)

1. Preparar uma solução de reserva PMSF a 100 mM em isopropanol.
2. Armazene a solução preparada de PMSF no gelo até que esteja pronta para uso.
   NOTA: Alicotar a solução de PMSF em volumes menores (por exemplo, 100 μL) e armazená-la a -20 °C para evitar ciclos de congelamento e descongelamento.

6. Configurando o ensaio

1. Preparar as seguintes soluções em triplicado em tubos de microcentrífuga:
   1. Controle negativo: Pipeta 800 μL de RB.
   2. Controle do veículo: Adicione 600 μL de RB e 200 μL do solvente usado para dissolver a amostra.
   3. Controle de inibição positiva: Adicionar 24 μL de solução estoque de PMSF e 776 μL de RB.
   4. Controle de isopropanol: Adicione 24 μL de isopropanol e 776 μL de RB.
   5. Amostras: Pipetar 200 μL da solução de amostra preparada e adicionar 600 μL de RB.
   6. Controles de cor (se necessário): Pipetar 200 μL da solução da amostra e adicionar 800 μL de RB.
2. Adicione 100 μL da solução de elastase (10 μg/mL) a cada tubo, exceto para os controles de cor.
3. Incube todos os tubos em temperatura ambiente por 20 min.
4. Adicione 100 μL de solução de substrato SANA (0,8 mM) a cada tubo, exceto para os controles de cores.
5. Misture bem as soluções invertendo suavemente os tubos várias vezes. Transfira 300 μL de cada tubo para uma placa de 96 poços, garantindo medições triplicadas para cada amostra.
6. Coloque a placa de 96 poços em um leitor de microplacas ajustado para 410 nm. Medir a absorvância periodicamente, a cada minuto, durante 20 minutos ou até que o sinal estabilize. Defina o leitor para medir à temperatura ambiente.
   NOTA: Se o leitor de placas suportar medições cinéticas, programe-o para fazer leituras automaticamente em intervalos definidos. Caso contrário, registre manualmente a absorbância nos pontos de tempo desejados.

7. Análise dos dados

1. Normalize os resultados definindo o controle de inibição positiva (PMSF) como 100% de inibição e o controle negativo (somente RB) como 0% de inibição.
2. Calcular a percentagem de inibição para cada amostra utilizando a seguinte fórmula:
   % de inibição = 100 - [(Absorbância da amostra - Absorbância do controle do veículo - Absorbância do controle da cor)/(Absorbância do controle negativo - Absorbância do controle positivo - Absorbância do controle do isopropanol)] × 100
3. Use o software gráfico para traçar as porcentagens de inibição para cada concentração de amostra em relação à concentração de amostra para visualizar o efeito inibitório.

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Resultados

Uma vez concluído o protocolo, os dados de absorbância necessários para realizar os cálculos pertinentes e quantificar a capacidade das amostras de modular a atividade da elastase podem ser obtidos. A Figura 3 destaca a localização dos poços com os diferentes controles e amostras. No caso de amostras coloridas, como a utilizada neste exemplo, é necessário adicionar controles de cores para minimizar a interferência espectrofotométrica, pois a cor p...

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Discussão

No presente método, os efeitos modulatórios de fitoquímicos sobre enzimas elastase são examinados usando um ensaio colorimétrico. A elastase, uma serina protease crucial para a degradação da elastina, desempenha um papel significativo na manutenção da elasticidade do tecido em vários órgãos. O ensaio de elastase colorimétrica descrito neste trabalho oferece um método simples, sensível e rápido para medir a atividade da elastase.

Nesse contexto,...

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Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
96 Well Cell Culture Plate	Corning Incorporated	3599	Flat bottom with lid, polystyrene
Cell Imaging Multimode Reader	Agilent	BioTek Cytation 1	Used with Gen5 software
Elastase From Porcine Pancreas	Sigma-Aldrich	E7885	CAS 39445-21-1; 25,9 kDa
Isopropanol 99.5%	Fisher Scientific	AC184130010	CAS 67-63-0; C3H8O; 60.10 g/mol
N-Succinil-(Ala)3-nitroanilide	Sigma-Aldrich	S4760	CAS 52299-14-6; C19H25N5O8 ; 451.43 g/mol
pH Meter	Hach Lange	sensION+ PH31	With magnetic stirrer and sensor holder
Phenylmethanesulfonyl Fluoride	Sigma-Aldrich	P7626	CAS 329-98-6; C7H7FO2S; 174,19 g/mol
Tris For Molecular Biology	PanReac AppliChem	A2264	CAS 77-86-1; C4H11NO3; 121,14 g/mol