Quantificando a modulação da atividade da enzima elastase por meio de análise colorimétrica

Resumo

Este protocolo descreve o desenvolvimento de um método de ensaio colorimétrico para determinar a capacidade dos compostos de inibir ou ativar a atividade da elastase.

Resumo

A elastase, uma serina protease, desempenha um papel essencial na degradação da elastina. A elastina é uma proteína extracelular que ajuda a manter a elasticidade dos tecidos nos pulmões, pele e vasos sanguíneos. A regulação rígida da atividade da elastase é crucial para a homeostase tecidual, pois a desregulação pode contribuir para patologias como enfisema, rugas e aterosclerose. Alguns compostos, como fitoquímicos naturais, mostraram potencial para intervenção terapêutica e atraíram interesse significativo. Elucidar os efeitos modulatórios de diferentes compostos na elastase, sejam inibitórios ou estimulatórios, é crucial para o desenvolvimento de novas estratégias terapêuticas e cosméticas direcionadas a distúrbios associados à elastase. Um método amplamente aceito para medir a atividade da elastase é o ensaio de elastase colorimétrica. Neste ensaio, um substrato específico é usado para quebrar a elastase, liberando um composto amarelo detectável, a p-nitroanilina (pNA). A quantidade de pNA produzida reflete a atividade da elastase na amostra e pode ser medida por colorimetria. Este ensaio oferece vários benefícios, incluindo simplicidade, alta sensibilidade, resultados rápidos e adaptabilidade a várias necessidades de pesquisa. O ensaio de elastase colorimétrica continua sendo uma ferramenta valiosa para estudar como os compostos afetam a atividade da elastase. Devido à sua facilidade de uso e eficácia, este ensaio é uma pedra angular da pesquisa neste campo.

Introdução

A elastase é uma enzima serina protease que desempenha um papel crucial na quebra da elastina, uma proteína que fornece elasticidade a vários tecidos do corpo, incluindo pulmões, pele e vasos sanguíneos. A atividade da elastase é rigidamente regulada para manter a homeostase do tecido, e a desregulação pode levar a condições patológicas e dérmicas, como enfisema, aterosclerose e rugas na pele¹.

Existem vários tipos de elastases, cada uma com características e funções específicas. As elastases de neutrófilos, produzidas por neutrófilos, são importantes na resposta imune e na inflamaçã....

Protocolo

Os detalhes dos reagentes e do equipamento usado para este estudo estão listados na Tabela de Materiais.

1. Preparação do tampão de reação de base Tris 0,2 M (RB)

1. Pese a base Tris correspondente usando uma balança analítica.
2. Transfira a base Tris para um copo e adicione água deionizada usando um cilindro graduado.
3. Agite a solução com um agitador magnético até que a base Tris esteja completamente dissolvida.
4. Ajuste o pH para 8,0 adicionando 4 N HCl gota a gota. Use um medidor de pH para monitorar o pH.
5. Uma vez atingido o pH....

Discussão

No presente método, os efeitos modulatórios de fitoquímicos sobre enzimas elastase são examinados usando um ensaio colorimétrico. A elastase, uma serina protease crucial para a degradação da elastina, desempenha um papel significativo na manutenção da elasticidade do tecido em vários órgãos. O ensaio de elastase colorimétrica descrito neste trabalho oferece um método simples, sensível e rápido para medir a atividade da elastase.

Nesse contexto,.......

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
96 Well Cell Culture Plate	Corning Incorporated	3599	Flat bottom with lid, polystyrene
Cell Imaging Multimode Reader	Agilent	BioTek Cytation 1	Used with Gen5 software
Elastase From Porcine Pancreas	Sigma-Aldrich	E7885	CAS 39445-21-1; 25,9 kDa
Isopropanol 99.5%	Fisher Scientific	AC184130010	CAS 67-63-0; C3H8O; 60.10 g/mol
N-Succinil-(Ala)3-nitroanilide	Sigma-Aldrich	S4760	CAS 52299-14-6; C19H25N5O8 ; 451.43 g/mol
pH Meter	Hach Lange	sensION+ PH31	With magnetic stirrer and sensor holder
Phenylmethanesulfonyl Fluoride	Sigma-Aldrich	P7626	CAS 329-98-6; C7H7FO2S; 174,19 g/mol
Tris For Molecular Biology	PanReac AppliChem	A2264	CAS 77-86-1; C4H11NO3; 121,14 g/mol