비색 분석을 통한 엘라스타제 효소 활성의 조절 정량화

요약

이 프로토콜은 엘라스타제 활성을 억제하거나 활성화하는 화합물의 능력을 결정하기 위한 비색 분석 방법의 개발을 설명합니다.

초록

세린 프로테아제인 엘라스타제는 엘라스틴 분해에 필수적인 역할을 합니다. 엘라스틴은 폐, 피부, 혈관의 조직 탄력을 유지하는 데 도움이 되는 세포외 단백질입니다. 엘라스타제 활성의 엄격한 조절은 조직 항상성에 매우 중요한데, 조절 장애는 폐기종, 주름 및 죽상동맥경화증과 같은 병리학에 기여할 수 있기 때문입니다. 자연적으로 발생하는 파이토케미컬(phytochemicals)과 같은 일부 화합물은 치료적 개입의 잠재력을 보여주었고 상당한 관심을 끌었습니다. 억제성 또는 자극성 여부에 관계없이 엘라스타제에 대한 다양한 화합물의 조절 효과를 규명하는 것은 엘라스타제 관련 질환을 대상으로 하는 새로운 치료 및 미용 전략을 개발하는 데 중요합니다. 엘라스타제 활성을 측정하기 위해 널리 사용되는 방법은 비색 엘라스타제 분석입니다. 이 분석에서는 특정 기질을 사용하여 엘라스타아제를 분해하여 검출 가능한 노란색 화합물인 p-니트로아닐린(pNA)을 방출합니다. 생성된 pNA의 양은 샘플의 엘라스타제 활성을 반영하며 비색계로 측정할 수 있습니다. 이 분석은 단순성, 높은 감도, 빠른 결과 및 다양한 연구 요구에 대한 적응성을 포함한 여러 가지 이점을 제공합니다. 비색 엘라스타제 분석은 화합물이 엘라스타제 활성에 미치는 영향을 연구하는 데 유용한 도구로 남아 있습니다. 사용 편의성과 효과로 인해 이 분석법은 이 분야 연구의 초석입니다.

서문

엘라스타제는 폐, 피부, 혈관 등 신체의 다양한 조직에 탄력을 제공하는 단백질인 엘라스틴을 분해하는 데 중요한 역할을 하는 세린 프로테아제 효소입니다. 엘라스타제 활성은 조직의 항상성을 유지하기 위해 엄격하게 조절되며, 조절 장애는 폐기종, 죽상동맥경화증, 피부 주름과 같은 병리학적 및 피부 질환을 유발할 수 있습니다¹.

엘라스타제에는 여러 유형이 있으며 각각 특정 특성과 기능을 가지고 있습니다. 호중구에 의해 생성되는 호중구 엘라스타제는 면역 반응과 염증에 중요한 역할을 합니다. 이러한 효소는 다양한 세포외 단백질을 분해할 수 있으며 만성 염증성 질환에 관여합니다². 반면에 췌장 엘라스타제는 소장에서 단백질 소화에 중요한 역할을 한다³. 이러한 엘라스타제를 구별하는 것은 다양한 질병에 대한 특정 치료법을 개발하는 데 매우 중요합니다.

건강한 수준의 엘라스틴과 엘라스타아제 활성을 조절하는 경로는 피부의 탄력을 보존하고 조기 노화를 예방하는 데 도움이 됩니다. 노화, 자외선, 염증, 유전적 소인, 환경 오염 물질 및 영양과 같은 요인은 엘라스타제⁴의 활성과 분해에 큰 영향을 미칩니다. 새로운 관심 분야는 엘라스타제에 의한 엘라스틴의 분해에 의해 생성되는 생체 활성 단편인 엘라스토카인에 대한 연구입니다. 이러한 분자는 염증 증가, 탄성 섬유 석회화, 지질 침착 등 중요한 생물학적 효과를 유발할 수 있습니다⁵. 엘라스토카인은 엘라스틴 분해와 관련된 질병의 진행에 영향을 미칠 수 있으며 새로운 치료 개입을 위한 잠재적인 표적을 제공할 수 있습니다(그림 1).

자연적으로 발생하는 파이토케미컬(phytochemicals)과 같은 일부 화합물은 엘라스타제 활성을 조절하는 능력을 포함하여 잠재적인 치료 및 미용 효과로 인해 상당한 주목을 받고 있다⁶. 예를 들어, 사과와 양파에서 발견되는 플라보노이드인 퀘르세틴은 항염증 및 노화 방지 효과에 기여하는 엘라스타아제 활동을 효과적으로 억제하는 것으로 나타났습니다⁷. 강황에 함유된 생체 활성 화합물인 커큐민(Curcumin)은 엘라스타아제 억제 작용을 보이는 또 다른 잘 연구된 식물 화학물질로, 피부 노화 및 염증에 대한 보호 효과를 제공합니다⁸. 또한 녹차의 주요 카테킨인 에피갈로카테킨 갈레이트(EGCG)는 강력한 엘라스타제 억제 활성을 입증하여 피부 탄력 보존을 목표로 하는 스킨 케어 제형에 유용한 화합물이 되었습니다⁹. 이러한 사례는 천연 엘라스타아제 억제제로서 파이토케미컬의 잠재력을 강조하며, 새로운 치료 및 화장품 개발을 위한 기반을 제공합니다.

현재 비색 엘라스타제 분석은 엘라스타제 활성을 측정하는 데 널리 사용되는 방법입니다 7,10,11,12,13. 이 분석은 특정 기질인 N-숙시닐-(Ala)₃-니트로아닐라이드(SANA)를 숙시닐아미노산 및 p-니트로아닐린(pNA)으로 가수분해하는 효소의 능력에 의존합니다. pNA는 분광 광도계를 사용하여 410nm에서 쉽게 검출할 수 있는 노란색 발색단입니다(그림 2). pNA 생성 속도는 샘플¹⁴의 엘라스타제 활성에 정비례합니다.

이 방법은 다양한 연구 분야에서 광범위하게 응용되고 있습니다. 이 방법을 통해 연구자들은 엘라스타제 활성을 조절하는 화합물의 능력을 신속하게 식별하고, 엘라스타제 억제제의 작용 메커니즘을 조사하고, 엘라스타제 관련 질병의 세포 및 동물 모델에서 이러한 억제제의 효능을 평가할 수 있습니다. 또한 이 분석은 경쟁적 또는 비경쟁적 억제와 같은 다양한 억제 메커니즘을 연구하는 데 사용할 수 있으며, 천연 또는 합성 화합물이 엘라스타제 활성을 조절하는 방법에 대한 귀중한 정보를 제공합니다.

엘라스타제 활성 조절 분석은 엘라스타제 활성을 측정하기 위한 다른 방법에 비해 몇 가지 이점을 제공합니다. 간단하고 수행하기 쉬우며 최소한의 기술 전문 지식이 필요하며 표준 실험실 환경에서 수행할 수 있습니다¹⁵. 또한 이 분석은 감도가 매우 높으며 엘라스타제 활성의 작은 변화를 감지할 수 있습니다. 이 분석은 빠르고 정량적인 결과를 제공하여 효율적인 데이터 분석을 가능하게 합니다. 또한, 고처리량 스크리닝 및 동역학 연구를 포함한 다양한 형식에 적용할 수 있습니다¹⁶.

그러나 이 분석에는 낮은 기질 특이성(엘라스타제에 특이적임) 및 유색 화합물 또는 pNA 가수분해 억제제와 같은 샘플의 다른 구성 요소의 간섭에 대한 민감성과 같은 몇 가지 제한 사항도 있습니다. 따라서 연구자들은 이러한 한계를 고려하고 보완적인 방법을 사용하여 엘라스타제 억제제⁽¹⁷)의 작용의 기저에 있는 메커니즘을 종합적으로 조사해야 한다.

자이모그래피(zymography)와 같은 엘라스타제 활성 모니터링 대체 방법이 있으며, 이는 다양한 엘라스타제 동형을 식별하고 구별하기 위한 탁월한 도구를 제공하며, 이는 특정 질병 과정에 대한 다양한 엘라스타제 아형의 특정 기여도를 연구할 때 중요합니다. 그러나 자이모그래피는 반정량적 기법이며 시각화를 위한 추가 단계가 필요합니다. 따라서, 분광광도법(spectrophotometric method)과 비교하여, 자이모그래피(zymography)는 고처리량 분석(high-throughput analysis)에 덜 효율적이다¹⁸. 형광 분석 assay는 분광광도법에 대한 향상된 감도를 제공하여 검출 한계를 낮춥니다. 이를 통해 엘라스타제 활성 및 조절제 상호작용에 대한 보다 민감한 분석이 가능하여, 효소 과정에 대한 보다 완전한 그림을 제공할 수 있다¹⁹. 그러나 형광 분석 분석은 특수 기기가 필요하며 생물학적 샘플의 특정 화합물의 간섭에 취약할 수 있습니다. 방사성 분석은 탁월한 감도를 달성하여 매우 낮은 수준의 엘라스타제 활성을 검출하는 데 이상적입니다. 그러나 방사성 물질을 사용하기 위해서는 특수 장비, 엄격한 안전 프로토콜 및 적절한 폐기물 처리 절차가 필요하며, 이는 물류 문제와 안전 문제를 야기합니다²⁰. 면역분석은 다양성이 뛰어나며 엘라스타제 활성을 직접 측정하거나 엘라스타제 억제제 복합체를 정량화하는 데 사용할 수 있어 억제제 효능에 대한 통찰력을 제공할 수 있습니다. 또한 면역분석은 SANA 분석법과 달리 조직 균질액과 같은 복잡한 생물학적 샘플에 적용되도록 조정할 수 있습니다. 그러나 면역분석을 개발하고 검증하는 것은 시간이 많이 걸리고 특정 항체가 필요할 수 있으므로 단순한 분광광도계 접근법보다 비용이 더 많이 들 수 있습니다²¹.

비색 엘라스타제 활성 조절 분석은 엘라스타제 활성을 수정하는 모든 화합물의 능력을 조사하는 데 유용한 도구입니다. 단순성, 민감성 및 적응성으로 인해 이 방법은 다양한 연구 환경에서 널리 사용됩니다. 그러나 연구자들은 분석의 한계를 고려하고 보완적인 방법을 사용하여 엘라스타제 억제제의 활성의 기저에 있는 메커니즘을 종합적으로 결정해야 합니다.

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프로토콜

이 연구에 사용된 시약 및 장비의 세부 사항은 재료 표에 나열되어 있습니다.

1. 0.2M Tris 염기 반응 완충액 (RB)의 제조

1. 분석 저울을 사용하여 해당 Tris 염기의 무게를 측정합니다.
2. Tris 베이스를 비커로 옮기고 눈금이 매겨진 실린더를 사용하여 탈이온수를 추가합니다.
3. Tris 베이스가 완전히 용해될 때까지 자석 교반기로 용액을 저어줍니다.
4. 4N HCl을 적가하여 pH를 8.0으로 조정합니다. pH 측정기를 사용하여 pH를 모니터링하십시오.
5. 원하는 pH에 도달하면 용액을 부피 플라스크로 옮기고 탈이온수로 원하는 부피 표시까지 채웁니다.
6. 버퍼를 라벨이 부착된 보관 병에 옮기고 사용할 때까지 실온에서 보관하십시오.

2. 시료 전처리

1. 분석 저울을 사용하여 필요한 양의 샘플을 정확하게 칭량합니다. 이 연구에서는 각 샘플의 1mg으로 충분합니다.
2. RB의 샘플을 원하는 농도로 용해시킵니다. 다양한 시료 농도를 테스트할 수 있으며 1mg/mL가 좋은 참고 자료가 됩니다.
3. 와류 믹서를 사용하여 샘플이 완전히 용해되었는지 확인합니다.
4. 사용할 준비가 될 때까지 준비된 샘플을 얼음에 보관하십시오.
   참고: 샘플에 흡광도 판독을 방해할 수 있는 강한 착색이 있는 경우 동일한 절차에 따라 색상 컨트롤을 준비하되 이후 단계에서 엘라스타제 효소를 추가하지 마십시오.

3. 엘라스타제 효소의 제조

1. 최종 농도 10μg/mL의 RB에서 엘라스타제의 작업 용액을 준비합니다. 다음 방정식을 사용하여 필요한 스톡 용액의 부피를 계산하십시오.
   스톡 부피(μL) = 원하는 최종 부피(μL) x 원하는 최종 농도(μg/mL)/스톡 농도(μg/mL)
2. 사용할 준비가 될 때까지 준비된 엘라스타제 용액을 얼음에 보관하십시오.
   참고: 공급업체가 제공한 효소의 특정 활성을 고려하며, 이는 배치마다 다를 수 있습니다. 또한 동결 후 효소 활성이 감소할 수 있습니다. 가능한 경우 새로운 솔루션을 준비하십시오.

4. SANA 기판의 제조

1. 적당량의 SANA 분말을 RB에 용해시켜 0.8mM의 SANA 용액을 제조한다. 다음 방정식을 사용합니다.
   SANA의 질량(mg) = 원하는 최종 부피(μL) × 원하는 최종 농도(mM) × 분자량(mg/mmol)/1000
2. 용액을 빛으로부터 보호하고 사용할 때까지 4 °C에서 보관하십시오.

5. 페닐메틸설포닐플루오라이드(PMSF) 원액의 제조

1. 이소프로판올에 100mM의 PMSF 원액을 준비합니다.
2. 준비된 PMSF 용액을 사용할 준비가 될 때까지 얼음에 보관하십시오.
   참고: PMSF 용액을 더 작은 부피(예: 100μL)로 분취하고 -20°C에서 보관하여 동결-해동 주기를 방지하십시오.

6. 어세이 설정

1. 마이크로 원심분리기 튜브에서 다음 용액을 세 번 준비합니다.
   1. 음성 대조군: 피펫 800 μL의 RB.
   2. 차량 제어: 샘플을 용해하는 데 사용되는 600μL의 RB와 200μL의 용매를 추가합니다.
   3. 양성 억제 제어: PMSF 원액 24μL와 RB 776μL를 추가합니다.
   4. 이소프로판올 제어: 24μL의 이소프로판올과 776μL의 RB를 추가합니다.
   5. 샘플: 준비된 샘플 용액 200μL를 피펫팅하고 RB 600μL를 추가합니다.
   6. 색상 제어(필요한 경우): 200μL의 샘플 용액을 피펫팅하고 800μL의 RB를 추가합니다.
2. 색상 컨트롤을 제외하고 각 튜브에 100μL의 엘라스타제 용액(10μg/mL)을 추가합니다.
3. 모든 튜브를 실온에서 20분 동안 배양합니다.
4. 색상 컨트롤을 제외하고 각 튜브에 100μL의 SANA 기판 용액(0.8mM)을 추가합니다.
5. 튜브를 여러 번 부드럽게 뒤집어 용액을 철저히 섞습니다. 각 튜브에서 300μL를 96웰 플레이트로 옮겨 각 시료에 대한 3중 측정을 보장합니다.
6. 96웰 플레이트를 410nm로 설정된 마이크로플레이트 리더에 넣습니다. 20분 동안 또는 신호가 안정화될 때까지 매분마다 주기적으로 흡광도를 측정합니다. 리더를 실온에서 측정하도록 설정하십시오.
   알림: 플레이트 리더가 운동 측정을 지원하는 경우 설정된 간격으로 자동으로 판독값을 가져오도록 프로그래밍하십시오. 그렇지 않으면 원하는 시점에서 흡광도를 수동으로 기록합니다.

7. 데이터 분석

1. PMSF(positive inhibition control)를 100% 억제로, negative control(RB만 해당)을 0% inhibition으로 설정하여 결과를 정규화합니다.
2. 다음 공식을 사용하여 각 샘플에 대한 억제 백분율을 계산합니다.
   % 억제 = 100 - [(샘플 흡광도 - 차량 제어 흡광도 - 색상 제어 흡광도)/(네거티브 대조 흡광도 - 포지티브 대조 흡광도 - 이소프로판올 대조 흡광도)] × 100
3. 그래프 소프트웨어를 사용하여 시료 농도에 대한 각 시료 농도의 억제 백분율을 표시하면 억제 효과를 시각화할 수 있습니다.

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결과

프로토콜이 완료되면 관련 계산을 수행하고 엘라스타제 활성을 조절하기 위한 샘플의 용량을 정량화하는 데 필요한 흡광도 데이터를 얻을 수 있습니다. 그림 3 은 다양한 대조군과 샘플이 있는 웰의 위치를 보여줍니다. 이 예에서 사용된 것과 같은 유색 샘플의 경우, 색상이 410nm에서 pNA의 노란색 측정을 방해할 수 있으므로 분광 광도계 간섭을 최소...

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토론

본 방법에서는 엘라스타제 효소에 대한 파이토케미컬의 조절 효과를 비색 분석을 사용하여 검사합니다. 엘라스틴 분해에 중요한 세린 프로테아제인 엘라스타제는 다양한 장기에서 조직 탄력을 유지하는 데 중요한 역할을 합니다. 이 연구에서 설명된 비색 엘라스타제 분석은 엘라스타제 활성을 측정하기 위한 간단하고 민감하며 빠른 방법을 제공합니다.

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자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
96 Well Cell Culture Plate	Corning Incorporated	3599	Flat bottom with lid, polystyrene
Cell Imaging Multimode Reader	Agilent	BioTek Cytation 1	Used with Gen5 software
Elastase From Porcine Pancreas	Sigma-Aldrich	E7885	CAS 39445-21-1; 25,9 kDa
Isopropanol 99.5%	Fisher Scientific	AC184130010	CAS 67-63-0; C3H8O; 60.10 g/mol
N-Succinil-(Ala)3-nitroanilide	Sigma-Aldrich	S4760	CAS 52299-14-6; C19H25N5O8 ; 451.43 g/mol
pH Meter	Hach Lange	sensION+ PH31	With magnetic stirrer and sensor holder
Phenylmethanesulfonyl Fluoride	Sigma-Aldrich	P7626	CAS 329-98-6; C7H7FO2S; 174,19 g/mol
Tris For Molecular Biology	PanReac AppliChem	A2264	CAS 77-86-1; C4H11NO3; 121,14 g/mol