Quantificazione della modulazione dell'attività dell'enzima elastasi attraverso l'analisi colorimetrica

Riepilogo

Questo protocollo descrive lo sviluppo di un metodo di saggio colorimetrico per determinare la capacità dei composti di inibire o attivare l'attività dell'elastasi.

Abstract

L'elastasi, una serina proteasi, svolge un ruolo essenziale nella degradazione dell'elastina. L'elastina è una proteina extracellulare che aiuta a mantenere l'elasticità dei tessuti nei polmoni, nella pelle e nei vasi sanguigni. Una stretta regolazione dell'attività dell'elastasi è fondamentale per l'omeostasi dei tessuti, poiché la disregolazione può contribuire a patologie come l'enfisema, le rughe e l'aterosclerosi. Alcuni composti, come le sostanze fitochimiche presenti in natura, hanno mostrato un potenziale di intervento terapeutico e hanno suscitato un notevole interesse. Chiarire gli effetti modulatori di diversi composti sull'elastasi, sia inibitori che stimolanti, è fondamentale per lo sviluppo di nuove strategie terapeutiche e cosmetiche mirate ai disturbi associati all'elastasi. Un metodo ampiamente accettato per misurare l'attività dell'elastasi è il saggio colorimetrico dell'elastasi. In questo saggio, un substrato specifico viene utilizzato per scomporre l'elastasi, rilasciando un composto giallo rilevabile, la p-nitroanilina (pNA). La quantità di pNA prodotta riflette l'attività dell'elastasi nel campione e può essere misurata mediante colorimetria. Questo test offre numerosi vantaggi, tra cui semplicità, elevata sensibilità, risultati rapidi e adattabilità a varie esigenze di ricerca. Il test colorimetrico dell'elastasi rimane uno strumento prezioso per studiare l'impatto dei composti sull'attività dell'elastasi. Grazie alla sua facilità d'uso ed efficacia, questo test è una pietra miliare della ricerca in questo campo.

Introduzione

L'elastasi è un enzima della serina proteasi che svolge un ruolo cruciale nella scomposizione dell'elastina, una proteina che fornisce elasticità a vari tessuti del corpo, inclusi polmoni, pelle e vasi sanguigni. L'attività dell'elastasi è strettamente regolata per mantenere l'omeostasi dei tessuti e la disregolazione può portare a condizioni patologiche e cutanee come enfisema, aterosclerosi e rughe della pelle¹.

Esistono diversi tipi di elastasi, ognuno con caratteristiche e funzioni specifiche. Le elastasi neutrofile, prodotte dai neutrofili, sono importanti nella risposta immunitaria e nell'infiammazione. Questi enzimi possono degradare un'ampia varietà di proteine extracellulari e sono coinvolti nelle malattie infiammatorie croniche². Le elastasi pancreatiche, d'altra parte, svolgono un ruolo nella digestione delle proteine nell'intestino tenue³. Distinguere tra queste elastasi è fondamentale per lo sviluppo di terapie specifiche per diverse malattie.

Livelli sani di elastina e percorsi che regolano l'attività dell'elastasi aiutano a preservare l'elasticità della pelle e a prevenire l'invecchiamento precoce. Fattori come l'invecchiamento, le radiazioni UV, l'infiammazione, la predisposizione genetica, gli inquinanti ambientali e la nutrizione influenzano in modo significativo l'attività e la degradazione dell'elastasi⁴. Un'area emergente di interesse è lo studio delle elastochine, frammenti bioattivi generati dalla degradazione dell'elastina da parte dell'elastasi. Queste molecole possono indurre effetti biologici significativi, tra cui aumento dell'infiammazione, calcificazione delle fibre elastiche e deposizione di lipidi, tra gli altri⁵. Le elastochine possono influenzare la progressione delle malattie associate alla degradazione dell'elastina e offrire un potenziale bersaglio per nuovi interventi terapeutici (Figura 1).

Alcuni composti, come le sostanze fitochimiche presenti in natura, hanno guadagnato un'attenzione significativa per i loro potenziali effetti terapeutici e cosmetici, inclusa la loro capacità di modulare l'attività dell'elastasi⁶. Ad esempio, è stato dimostrato che la quercetina, un flavonoide presente nelle mele e nelle cipolle, inibisce efficacemente l'attività dell'elastasi, contribuendo ai suoi effetti antinfiammatori e anti-invecchiamento⁷. La curcumina, il composto bioattivo della curcuma, è un altro fitochimico ben studiato che mostra l'inibizione dell'elastasi, offrendo effetti protettivi contro l'invecchiamento cutaneo e l'infiammazione⁸. Inoltre, l'epigallocatechina gallato (EGCG), la catechina primaria del tè verde, ha dimostrato una potente attività inibitoria dell'elastasi, rendendola un composto prezioso per le formulazioni per la cura della pelle volte a preservare l'elasticità della pelle⁹. Questi esempi sottolineano il potenziale delle sostanze fitochimiche come inibitori naturali dell'elastasi, fornendo una base per lo sviluppo di nuovi prodotti terapeutici e cosmetici.

Attualmente, il test colorimetrico dell'elastasi è un metodo ampiamente utilizzato per misurare l'attività dell'elastasi 7,10,11,12,13. Questo test si basa sulla capacità dell'enzima di idrolizzare un substrato specifico, N-succinil-(Ala)3-nitroanilide (SANA), in succinilamminoacidi e p-nitroanilina (pNA). Il pNA è un cromoforo di colore giallo che può essere facilmente rilevato a 410 nm utilizzando uno spettrofotometro (Figura 2). Il tasso di produzione di pNA è direttamente proporzionale all'attività dell'elastasi nel campione¹⁴.

Questo metodo ha una vasta gamma di applicazioni in vari campi di ricerca. Attraverso questo metodo, i ricercatori possono identificare rapidamente la capacità dei composti di modulare l'attività dell'elastasi, studiare i meccanismi d'azione degli inibitori dell'elastasi e valutare l'efficacia di questi inibitori in modelli cellulari e animali di malattie correlate all'elastasi. Inoltre, il test può essere utilizzato per studiare diversi meccanismi di inibizione, come l'inibizione competitiva o non competitiva, fornendo preziose informazioni su come i composti naturali o sintetici modulano l'attività dell'elastasi.

Il saggio di modulazione dell'attività dell'elastasi offre diversi vantaggi rispetto ad altri metodi per misurare l'attività dell'elastasi. È semplice e facile da eseguire, richiede competenze tecniche minime e può essere condotto in un ambiente di laboratorio standard¹⁵. Inoltre, il test è altamente sensibile e può rilevare piccoli cambiamenti nell'attività dell'elastasi. Il test fornisce risultati rapidi e quantitativi, consentendo un'analisi efficiente dei dati. Inoltre, può essere adattato a vari formati, tra cui lo screening ad alto rendimento e gli studi cinetici¹⁶.

Tuttavia, il test presenta anche diverse limitazioni, come la bassa specificità del substrato (in quanto è specifico per l'elastasi) e la suscettibilità all'interferenza di altri componenti del campione, come composti colorati o inibitori dell'idrolisi del pNA. Pertanto, i ricercatori devono considerare queste limitazioni e utilizzare metodi complementari per studiare in modo completo i meccanismi alla base dell'azione degli inibitori dell'elastasi¹⁷.

Esistono metodi alternativi per il monitoraggio dell'attività dell'elastasi, come la zimografia, che offre uno strumento eccellente per identificare e differenziare varie isoforme di elastasi, che è fondamentale quando si studiano i contributi specifici di diversi sottotipi di elastasi a un particolare processo patologico. Tuttavia, la zimografia è una tecnica semiquantitativa e richiede passaggi aggiuntivi per la visualizzazione; Pertanto, rispetto al metodo spettrofotometrico, la zimografia è meno efficiente per l'analisi ad alto rendimento¹⁸. I saggi fluorimetrici offrono una maggiore sensibilità al metodo spettrofotometrico, fornendo limiti di rilevamento inferiori. Ciò consente un'analisi più sensibile dell'attività dell'elastasi e delle interazioni con i modulatori, fornendo un quadro più completo dei processi enzimatici¹⁹. Tuttavia, i saggi fluorimetrici richiedono strumentazione specializzata e possono essere suscettibili all'interferenza di alcuni composti nei campioni biologici. I test radiometrici raggiungono una sensibilità eccezionale, il che li rende ideali per il rilevamento di livelli molto bassi di attività dell'elastasi. Tuttavia, l'uso di materiali radioattivi richiede attrezzature specializzate, protocolli di sicurezza rigorosi e procedure di smaltimento dei rifiuti adeguate, che pongono sfide logistiche e problemi di sicurezza²⁰. I dosaggi immunologici si distinguono per la loro versatilità e possono essere utilizzati per misurare direttamente l'attività dell'elastasi o quantificare i complessi inibitori dell'elastasi, fornendo informazioni sull'efficacia degli inibitori. Inoltre, i dosaggi immunologici possono essere adattati per lavorare con campioni biologici complessi, come gli omogeneizzati tissutali, a differenza del metodo SANA. Tuttavia, lo sviluppo e la convalida di saggi immunologici possono richiedere molto tempo e anticorpi specifici, con potenziali costi più elevati rispetto a quelli degli approcci spettrofotometrici più semplici²¹.

Il saggio colorimetrico di modulazione dell'attività dell'elastasi è uno strumento prezioso per studiare la capacità di qualsiasi composto di modificare l'attività dell'elastasi. Grazie alla sua semplicità, sensibilità e adattabilità, il metodo è ampiamente utilizzato in vari contesti di ricerca. Tuttavia, i ricercatori devono considerare i limiti del test e utilizzare metodi complementari per determinare in modo completo i meccanismi alla base dell'attività degli inibitori dell'elastasi.

Protocollo

I dettagli dei reagenti e delle attrezzature utilizzate per questo studio sono elencati nella Tabella dei Materiali.

1. Preparazione del tampone di reazione base Tris 0,2 M (RB)

1. Pesare la base Tris corrispondente utilizzando una bilancia analitica.
2. Trasferire la base Tris in un becher e aggiungere acqua deionizzata utilizzando un cilindro graduato.
3. Mescolare la soluzione con un agitatore magnetico fino a quando la base Tris non è completamente sciolta.
4. Regolare il pH a 8,0 aggiungendo 4 N HCl goccia per goccia. Utilizzare un pHmetro per monitorare il pH.
5. Una volta raggiunto il pH desiderato, trasferire la soluzione in un matraccio tarato e riempire con acqua deionizzata fino alla tacca del volume desiderato.
6. Trasferisci il tampone in un flacone etichettato e conservalo a temperatura ambiente fino al momento dell'uso.

2. Preparazione del campione

1. Pesate con precisione la quantità richiesta di campioni utilizzando una bilancia analitica. Per questo studio, 1 mg di ciascun campione è sufficiente.
2. Sciogliere i campioni in RB alla concentrazione desiderata. È possibile testare diverse concentrazioni di campioni, con 1 mg/mL come buon riferimento.
3. Utilizzare un miscelatore a vortice per assicurarsi che i campioni siano completamente disciolti.
4. Conservare i campioni preparati su ghiaccio fino al momento dell'uso.
   NOTA: Se il campione ha una forte colorazione che potrebbe interferire con le letture dell'assorbanza, preparare i controlli del colore seguendo la stessa procedura ma senza aggiungere l'enzima elastasi nei passaggi successivi.

3. Preparazione dell'enzima elastasi

1. Preparare una soluzione di lavoro di elastasi in RB ad una concentrazione finale di 10 μg/mL. Utilizzare la seguente equazione per calcolare il volume richiesto della soluzione madre:
   Volume della riserva (μL) = Volume finale desiderato (μL) x Concentrazione finale desiderata (μg/mL)/Concentrazione della riserva (μg/mL)
2. Conservare la soluzione di elastasi preparata in ghiaccio fino al momento dell'uso.
   NOTA: Considerare l'attività specifica dell'enzima fornita dal fornitore, che può variare da un lotto all'altro. Inoltre, l'attività enzimatica può diminuire dopo il congelamento; Prepara soluzioni fresche quando possibile.

4. Preparazione del substrato SANA

1. Preparare 0,8 mM di soluzione SANA sciogliendo la quantità appropriata di polvere di SANA in RB. Utilizzare la seguente equazione:
   Massa di SANA (mg) = Volume finale desiderato (μL) × Concentrazione finale desiderata (mM) × Peso molecolare (mg/mmol)/1000
2. Proteggere la soluzione dalla luce e conservarla a 4 °C fino al momento dell'uso.

5. Preparazione della soluzione madre di fenilmetilsulfonilfluoruro (PMSF)

1. Preparare 100 mM di soluzione madre di PMSF in isopropanolo.
2. Conservare la soluzione PMSF preparata in ghiaccio fino al momento dell'uso.
   NOTA: Aliquotare la soluzione di PMSF in volumi più piccoli (ad es. 100 μL) e conservarla a -20 °C per evitare cicli di gelo-scongelamento.

6. Impostazione del test

1. Preparare le seguenti soluzioni in triplicato in provette da microcentrifuga:
   1. Controllo negativo: Pipetta 800 μL di RB.
   2. Controllo del veicolo: aggiungere 600 μl di RB e 200 μl del solvente utilizzato per sciogliere il campione.
   3. Controllo positivo dell'inibizione: aggiungere 24 μl di soluzione madre PMSF e 776 μl di RB.
   4. Controllo dell'isopropanolo: aggiungere 24 μl di isopropanolo e 776 μl di RB.
   5. Campioni: Pipettare 200 μl della soluzione del campione preparata e aggiungere 600 μl di RB.
   6. Controlli del colore (se necessario): Pipettare 200 μl della soluzione campione e aggiungere 800 μl di RB.
2. Aggiungere 100 μl della soluzione di elastasi (10 μg/mL) a ciascuna provetta, ad eccezione dei controlli colore.
3. Incubare tutte le provette a temperatura ambiente per 20 minuti.
4. Aggiungere 100 μl di soluzione di substrato SANA (0,8 mM) a ciascuna provetta, ad eccezione dei controlli del colore.
5. Mescolare accuratamente le soluzioni capovolgendo delicatamente i tubi più volte. Trasferire 300 μl da ciascuna provetta a una piastra a 96 pozzetti, garantendo misure triplicate per ogni campione.
6. Posizionare la piastra a 96 pozzetti in un lettore di micropiastre impostato su 410 nm. Misurare l'assorbanza periodicamente, ogni minuto, per 20 minuti o fino a quando il segnale non si stabilizza. Impostare il lettore per misurare a temperatura ambiente.
   NOTA: Se il lettore di piastre supporta le misurazioni cinetiche, programmarlo in modo che esegua automaticamente le letture a intervalli prestabiliti. In caso contrario, registrare manualmente l'assorbanza nei punti temporali desiderati.

7. Analisi dei dati

1. Normalizza i risultati impostando il controllo dell'inibizione positiva (PMSF) come inibizione del 100% e il controllo negativo (solo RB) come inibizione dello 0%.
2. Calcolare la percentuale di inibizione per ciascun campione utilizzando la seguente formula:
   % Inibizione = 100 - [(Assorbanza del campione - Assorbanza del controllo del veicolo - Assorbanza del controllo del colore)/(Assorbanza del controllo negativo - Assorbanza del controllo positivo - Assorbanza del controllo dell'isopropanolo)] × 100
3. Utilizzare il software grafico per tracciare le percentuali di inibizione per ciascuna concentrazione del campione rispetto alla concentrazione del campione per visualizzare l'effetto inibitorio.

Risultati

Una volta completato il protocollo, è possibile ottenere i dati di assorbanza necessari per eseguire i calcoli pertinenti e quantificare la capacità dei campioni di modulare l'attività dell'elastasi. La Figura 3 evidenzia la posizione dei pozzetti con i diversi controlli e campioni. Nel caso di campioni colorati, come quello utilizzato in questo esempio, è necessario aggiungere controlli colore per minimizzare l'interferenza spettrofotometrica, in quanto...

Discussione

Nel presente metodo, gli effetti modulatori delle sostanze fitochimiche sugli enzimi elastasi sono esaminati utilizzando un saggio colorimetrico. L'elastasi, una serina proteasi cruciale per la degradazione dell'elastina, svolge un ruolo significativo nel mantenimento dell'elasticità dei tessuti in vari organi. Il saggio colorimetrico dell'elastasi descritto in questo lavoro offre un metodo semplice, sensibile e rapido per misurare l'attività dell'elastasi.

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Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
96 Well Cell Culture Plate	Corning Incorporated	3599	Flat bottom with lid, polystyrene
Cell Imaging Multimode Reader	Agilent	BioTek Cytation 1	Used with Gen5 software
Elastase From Porcine Pancreas	Sigma-Aldrich	E7885	CAS 39445-21-1; 25,9 kDa
Isopropanol 99.5%	Fisher Scientific	AC184130010	CAS 67-63-0; C3H8O; 60.10 g/mol
N-Succinil-(Ala)3-nitroanilide	Sigma-Aldrich	S4760	CAS 52299-14-6; C19H25N5O8 ; 451.43 g/mol
pH Meter	Hach Lange	sensION+ PH31	With magnetic stirrer and sensor holder
Phenylmethanesulfonyl Fluoride	Sigma-Aldrich	P7626	CAS 329-98-6; C7H7FO2S; 174,19 g/mol
Tris For Molecular Biology	PanReac AppliChem	A2264	CAS 77-86-1; C4H11NO3; 121,14 g/mol