Quantifizierung der Modulation der Elastase-Enzymaktivität durch kolorimetrische Analyse

Zusammenfassung

Dieses Protokoll beschreibt die Entwicklung eines kolorimetrischen Assay-Verfahrens zur Bestimmung der Fähigkeit von Verbindungen, die Elastaseaktivität zu hemmen oder zu aktivieren.

Zusammenfassung

Elastase, eine Serinprotease, spielt eine wesentliche Rolle beim Elastinabbau. Elastin ist ein extrazelluläres Protein, das zur Aufrechterhaltung der Gewebeelastizität in Lunge, Haut und Blutgefäßen beiträgt. Eine strenge Regulierung der Elastaseaktivität ist entscheidend für die Homöostase des Gewebes, da eine Dysregulation zu Pathologien wie Emphysem, Falten und Atherosklerose beitragen kann. Einige Verbindungen, wie z. B. natürlich vorkommende sekundäre Pflanzenstoffe, haben Potenzial für therapeutische Eingriffe gezeigt und großes Interesse geweckt. Die Aufklärung der modulatorischen Wirkungen verschiedener Verbindungen auf die Elastase, ob hemmend oder stimulierend, ist entscheidend für die Entwicklung neuartiger therapeutischer und kosmetischer Strategien zur Behandlung von Elastase-assoziierten Erkrankungen. Eine weithin akzeptierte Methode zur Messung der Elastaseaktivität ist der kolorimetrische Elastase-Assay. In diesem Assay wird ein spezifisches Substrat verwendet, um Elastase abzubauen, wobei eine nachweisbare gelbe Verbindung, p-Nitroanilin (pNA), freigesetzt wird. Die Menge an produziertem pNA spiegelt die Elastaseaktivität in der Probe wider und kann durch Kolorimetrie gemessen werden. Dieser Assay bietet mehrere Vorteile, darunter Einfachheit, hohe Empfindlichkeit, schnelle Ergebnisse und Anpassungsfähigkeit an verschiedene Forschungsanforderungen. Der kolorimetrische Elastase-Assay ist nach wie vor ein wertvolles Instrument, um zu untersuchen, wie sich Verbindungen auf die Elastaseaktivität auswirken. Aufgrund seiner Benutzerfreundlichkeit und Wirksamkeit ist dieser Assay ein Eckpfeiler der Forschung auf diesem Gebiet.

Einleitung

Elastase ist ein Serinprotease-Enzym, das eine entscheidende Rolle beim Abbau von Elastin spielt, einem Protein, das verschiedenen Geweben im Körper, einschließlich der Lunge, der Haut und der Blutgefäße, Elastizität verleiht. Die Elastaseaktivität wird streng reguliert, um die Homöostase des Gewebes aufrechtzuerhalten, und eine Dysregulation kann zu pathologischen und dermalen Zuständen wie Emphysem, Arteriosklerose und Hautfalten führen¹.

Es gibt verschiedene Arten von Elastasen, jede mit spezifischen Eigenschaften und Funktionen. Neutrophile Elastasen, die von Neutrophilen produziert werden, sind wichtig für die Immunantwort und Entzündung. Diese Enzyme können eine Vielzahl von extrazellulären Proteinen abbauen und sind an chronischen Entzündungskrankheiten beteiligt². Pankreas-Elastasen hingegen spielen eine Rolle bei der Proteinverdauung im Dünndarm³. Die Unterscheidung zwischen diesen Elastasen ist entscheidend für die Entwicklung spezifischer Therapien für verschiedene Krankheiten.

Ein gesunder Elastinspiegel und Signalwege, die die Elastaseaktivität regulieren, helfen, die Elastizität der Haut zu erhalten und vorzeitiger Hautalterung vorzubeugen. Faktoren wie Alterung, UV-Strahlung, Entzündungen, genetische Veranlagung, Umweltschadstoffe und Ernährung beeinflussen die Aktivität und den Abbau von Elastase⁴ maßgeblich. Ein aufstrebendes Interessengebiet ist die Erforschung von Elastokinen, bioaktiven Fragmenten, die durch den Abbau von Elastin durch Elastase entstehen. Diese Moleküle können signifikante biologische Wirkungen hervorrufen, darunter erhöhte Entzündungen, elastische Faserverkalkung und Lipidablagerung, um nur einige zu nennen⁵. Elastokine können das Fortschreiten von Krankheiten, die mit dem Elastinabbau verbunden sind, beeinflussen und bieten ein potenzielles Ziel für neue therapeutische Interventionen (Abbildung 1).

Einige Verbindungen, wie z. B. natürlich vorkommende sekundäre Pflanzenstoffe, haben aufgrund ihrer potenziellen therapeutischen und kosmetischen Wirkungen, einschließlich ihrer Fähigkeit, die Elastaseaktivität zu modulieren, erhebliche Aufmerksamkeit erregt⁶. Zum Beispiel hat sich gezeigt, dass Quercetin, ein Flavonoid, das in Äpfeln und Zwiebeln vorkommt, die Elastase-Aktivität wirksam hemmt, was zu seiner entzündungshemmenden und Anti-Aging-Wirkung beiträgt⁷. Curcumin, die bioaktive Verbindung in Kurkuma, ist ein weiterer gut untersuchter sekundärer Pflanzenstoff, der eine Elastase-Hemmung aufweist und eine schützende Wirkung gegen Hautalterung und Entzündungen bietet⁸. Darüber hinaus hat Epigallocatechingallat (EGCG), das primäre Catechin in grünem Tee, eine starke Elastase-hemmende Wirkung gezeigt, was es zu einer wertvollen Verbindung für Hautpflegeformulierungen macht, die darauf abzielen, die Hautelastizität zu erhalten⁹. Diese Beispiele unterstreichen das Potenzial von sekundären Pflanzenstoffen als natürliche Elastasehemmer, die eine Grundlage für die Entwicklung neuer therapeutischer und kosmetischer Produkte bilden.

Derzeit ist der kolorimetrische Elastase-Assay eine weit verbreitete Methode zur Messung der Elastase-Aktivität 7,10,11,12,13. Dieser Assay beruht auf der Fähigkeit des Enzyms, ein spezifisches Substrat, N-Succinyl-(Ala)3-nitroanilid (SANA), in Succinylaminosäuren und p-Nitroanilin (pNA) zu hydrolysieren. pNA ist ein gelb gefärbtes Chromophor, das bei 410 nm mit einem Spektralphotometer leicht nachgewiesen werden kann (Abbildung 2). Die Rate der pNA-Produktion ist direkt proportional zur Elastaseaktivität in Probe¹⁴.

Diese Methode hat ein breites Anwendungsspektrum in verschiedenen Forschungsbereichen. Mit dieser Methode können Forscher schnell die Fähigkeit von Verbindungen identifizieren, die Elastaseaktivität zu modulieren, die Wirkmechanismen von Elastase-Inhibitoren untersuchen und die Wirksamkeit dieser Inhibitoren in Zell- und Tiermodellen von Elastase-bedingten Krankheiten bewerten. Darüber hinaus kann der Assay verwendet werden, um verschiedene Mechanismen der Hemmung zu untersuchen, wie z. B. kompetitive oder nicht-kompetitive Hemmung, und liefert wertvolle Informationen darüber, wie natürliche oder synthetische Verbindungen die Elastaseaktivität modulieren.

Der Assay zur Modulation der Elastaseaktivität bietet mehrere Vorteile gegenüber anderen Methoden zur Messung der Elastaseaktivität. Es ist einfach und leicht durchzuführen, erfordert nur minimales technisches Know-how und kann in einer Standardlaborumgebung durchgeführt werden¹⁵. Darüber hinaus ist der Assay hochempfindlich und kann kleine Veränderungen der Elastaseaktivität nachweisen. Der Assay liefert schnelle und quantitative Ergebnisse und ermöglicht eine effiziente Datenanalyse. Darüber hinaus kann es an verschiedene Formate angepasst werden, einschließlich Hochdurchsatz-Screening und kinetische Studien¹⁶.

Der Assay weist jedoch auch mehrere Einschränkungen auf, wie z. B. eine geringe Substratspezifität (da er spezifisch für Elastase ist) und eine Anfälligkeit für Interferenzen durch andere Komponenten in der Probe, wie z. B. farbige Verbindungen oder Inhibitoren der pNA-Hydrolyse. Daher müssen die Forscher diese Einschränkungen berücksichtigen und komplementäre Methoden anwenden, um die Mechanismen, die der Wirkung von Elastase-Hemmern zugrunde liegen, umfassend zu untersuchen¹⁷.

Es gibt alternative Methoden zur Überwachung der Elastase-Aktivität, wie z. B. die Zymographie, die ein hervorragendes Werkzeug zur Identifizierung und Differenzierung verschiedener Elastase-Isoformen bietet, was für die Untersuchung der spezifischen Beiträge verschiedener Elastase-Subtypen zu einem bestimmten Krankheitsprozess von entscheidender Bedeutung ist. Die Zymographie ist jedoch eine semi-quantitative Technik und erfordert zusätzliche Schritte zur Visualisierung; Daher ist die Zymographie im Vergleich zur spektrophotometrischen Methode für die Hochdurchsatzanalyse weniger effizient¹⁸. Fluorometrische Assays bieten eine erhöhte Empfindlichkeit gegenüber der spektrophotometrischen Methode und bieten niedrigere Nachweisgrenzen. Dies ermöglicht eine sensitivere Analyse der Elastaseaktivität und der Modulatorinteraktionen und liefert ein vollständigeres Bild der enzymatischen Prozesse¹⁹. Fluorometrische Assays erfordern jedoch spezielle Instrumente und können anfällig für Interferenzen durch bestimmte Verbindungen in biologischen Proben sein. Radiometrische Assays erreichen eine außergewöhnliche Empfindlichkeit und eignen sich daher ideal für den Nachweis sehr geringer Elastase-Aktivität. Die Verwendung von radioaktivem Material erfordert jedoch spezielle Ausrüstung, strenge Sicherheitsprotokolle und ordnungsgemäße Abfallentsorgungsverfahren, was logistische Herausforderungen und Sicherheitsbedenken mit sich bringt²⁰. Immunoassays zeichnen sich durch ihre Vielseitigkeit aus und können zur direkten Messung der Elastaseaktivität oder zur Quantifizierung von Elastase-Inhibitor-Komplexen verwendet werden, um Einblicke in die Wirksamkeit von Inhibitoren zu erhalten. Darüber hinaus können Immunoassays im Gegensatz zur SANA-Methode an die Arbeit mit komplexen biologischen Proben, wie z. B. Gewebehomogenaten, angepasst werden. Die Entwicklung und Validierung von Immunoassays kann jedoch zeitaufwändig sein und spezifische Antikörper erfordern, was möglicherweise zu höheren Kosten führt als bei einfacheren spektrophotometrischen Ansätzen²¹.

Der kolorimetrische Assay zur Modulation der Elastaseaktivität ist ein wertvolles Werkzeug, um die Fähigkeit einer Verbindung zu untersuchen, die Elastaseaktivität zu modifizieren. Aufgrund ihrer Einfachheit, Sensitivität und Anpassungsfähigkeit wird die Methode in verschiedenen Forschungsumgebungen eingesetzt. Die Forscher müssen jedoch die Grenzen des Assays berücksichtigen und komplementäre Methoden verwenden, um die Mechanismen, die der Aktivität von Elastase-Hemmern zugrunde liegen, umfassend zu bestimmen.

Protokoll

Die Einzelheiten zu den Reagenzien und den für diese Studie verwendeten Geräten sind in der Materialtabelle aufgeführt.

1. Herstellung von 0,2 M Tris-Basenreaktionspuffer (RB)

1. Wiegen Sie die entsprechende Tris-Base mit einer Analysenwaage.
2. Den Tris-Boden in ein Becherglas geben und mit einem Messzylinder entionisiertes Wasser hinzufügen.
3. Rühren Sie die Lösung mit einem Magnetrührer um, bis sich die Tris-Basis vollständig aufgelöst hat.
4. Stellen Sie den pH-Wert auf 8,0 ein, indem Sie tropfenweise 4 N HCl hinzufügen. Verwenden Sie ein pH-Messgerät, um den pH-Wert zu überwachen.
5. Sobald der gewünschte pH-Wert erreicht ist, wird die Lösung in einen Messkolben überführt und bis zur gewünschten Volumenmarkierung mit deionisiertem Wasser gefüllt.
6. Füllen Sie den Puffer in eine beschriftete Vorratsflasche um und lagern Sie ihn bis zur Verwendung bei Raumtemperatur.

2. Vorbereitung der Probe

1. Wiegen Sie die erforderliche Menge der Proben mit einer Analysenwaage genau. Für diese Studie ist 1 mg jeder Probe ausreichend.
2. Lösen Sie die Proben in RB auf die gewünschte Konzentration auf. Es können verschiedene Probenkonzentrationen getestet werden, wobei 1 mg/ml eine gute Referenz ist.
3. Verwenden Sie einen Vortex-Mischer, um sicherzustellen, dass die Proben vollständig aufgelöst sind.
4. Lagern Sie die vorbereiteten Proben bis zur Verwendung auf Eis.
   HINWEIS: Wenn die Probe eine starke Färbung aufweist, die die Absorptionswerte beeinträchtigen könnte, bereiten Sie die Farbkontrollen vor, indem Sie das gleiche Verfahren befolgen, jedoch ohne Zugabe von Elastase-Enzym in späteren Schritten.

3. Vorbereitung des Elastase-Enzyms

1. Bereiten Sie eine Arbeitslösung von Elastase in RB in einer Endkonzentration von 10 μg/ml vor. Verwenden Sie die folgende Gleichung, um das erforderliche Volumen der Stammlösung zu berechnen:
   Stammvolumen (μL) = Gewünschtes Endvolumen (μL) x Gewünschte Endkonzentration (μg/mL)/Stammkonzentration (μg/mL)
2. Lagern Sie die vorbereitete Elastaselösung bis zur Verwendung auf Eis.
   HINWEIS: Berücksichtigen Sie die vom Lieferanten angegebene spezifische Aktivität des Enzyms, die zwischen den Chargen variieren kann. Außerdem kann die Enzymaktivität nach dem Einfrieren abnehmen; Bereiten Sie nach Möglichkeit frische Lösungen vor.

4. Vorbereitung des SANA-Untergrundes

1. Bereiten Sie 0,8 mM SANA-Lösung vor, indem Sie die entsprechende Menge SANA-Pulver in RB auflösen. Verwenden Sie die folgende Gleichung:
   Masse von SANA (mg) = Gewünschtes Endvolumen (μL) × Gewünschte Endkonzentration (mM) × Molekulargewicht (mg/mmol)/1000
2. Schützen Sie die Lösung vor Licht und lagern Sie sie bis zur Verwendung bei 4 °C.

5. Herstellung der Phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF)-Stammlösung

1. Bereiten Sie eine 100 mM PMSF-Stammlösung in Isopropanol vor.
2. Lagern Sie die vorbereitete PMSF-Lösung bis zur Verwendung auf Eis.
   HINWEIS: Aliquotieren Sie die PMSF-Lösung in kleinere Volumina (z. B. 100 μl) und lagern Sie sie bei -20 °C, um Gefrier-Tau-Zyklen zu vermeiden.

6. Einrichten des Assays

1. Bereiten Sie die folgenden Lösungen in dreifacher Ausfertigung in Mikrozentrifugenröhrchen vor:
   1. Negativkontrolle: Pipettieren Sie 800 μl RB.
   2. Fahrzeugkontrolle: Fügen Sie 600 μl RB und 200 μl des Lösungsmittels hinzu, das zum Auflösen der Probe verwendet wird.
   3. Positive Inhibitionskontrolle: Fügen Sie 24 μl PMSF-Stammlösung und 776 μl RB hinzu.
   4. Isopropanol-Kontrolle: Fügen Sie 24 μl Isopropanol und 776 μl RB hinzu.
   5. Proben: Pipettieren Sie 200 μl der vorbereiteten Probenlösung und fügen Sie 600 μl RB hinzu.
   6. Farbkontrollen (falls erforderlich): Pipettieren Sie 200 μl der Probenlösung und fügen Sie 800 μl RB hinzu.
2. Geben Sie 100 μl der Elastaselösung (10 μg/ml) in jedes Röhrchen, mit Ausnahme der Farbkontrollen.
3. Inkubieren Sie alle Röhrchen 20 Minuten lang bei Raumtemperatur.
4. Geben Sie 100 μl SANA-Substratlösung (0,8 mM) in jedes Röhrchen, mit Ausnahme der Farbkontrollen.
5. Mischen Sie die Lösungen gründlich, indem Sie die Röhrchen mehrmals vorsichtig umdrehen. Übertragen Sie 300 μl aus jedem Röhrchen auf eine 96-Well-Platte, um dreifache Messungen für jede Probe zu gewährleisten.
6. Setzen Sie die 96-Well-Platte in einen Mikroplatten-Reader ein, der auf 410 nm eingestellt ist. Messen Sie die Absorption regelmäßig jede Minute für 20 Minuten oder bis sich das Signal stabilisiert hat. Stellen Sie das Lesegerät so ein, dass es bei Raumtemperatur misst.
   HINWEIS: Wenn der Plattenleser kinetische Messungen unterstützt, programmieren Sie ihn so, dass er in festgelegten Intervallen automatisch Messwerte vornimmt. Andernfalls erfassen Sie die Absorption zu den gewünschten Zeitpunkten manuell.

7. Datenanalyse

1. Normalisieren Sie die Ergebnisse, indem Sie die positive Hemmungskontrolle (PMSF) auf 100 % Hemmung und die negative Kontrolle (nur RB) auf 0 % Hemmung einstellen.
2. Berechnen Sie den prozentualen Prozentsatz der Hemmung für jede Probe mit der folgenden Formel:
   % Hemmung = 100 - [(Absorption der Probe - Absorption der Vehikelkontrolle - Absorption der Farbkontrolle)/(Absorption der Negativkontrolle - Absorption der Positivkontrolle - Isopropanol-Absorption)] × 100
3. Verwenden Sie eine Grafiksoftware, um die Hemmprozentsätze für jede Probenkonzentration im Vergleich zur Probenkonzentration darzustellen und so die hemmende Wirkung zu visualisieren.

Ergebnisse

Sobald das Protokoll abgeschlossen ist, können die Absorptionsdaten erhalten werden, die erforderlich sind, um die entsprechenden Berechnungen durchzuführen und die Kapazität der Proben zur Modulation der Elastaseaktivität zu quantifizieren. Abbildung 3 zeigt die Lage der Bohrlöcher mit den verschiedenen Kontrollen und Proben. Im Falle von farbigen Proben, wie der in diesem Beispiel verwendeten, ist es notwendig, Farbsteuerungen hinzuzufügen, um spektr...

Diskussion

In der vorliegenden Methode werden die modulatorischen Wirkungen von sekundären Pflanzenstoffen auf Elastase-Enzyme mit Hilfe eines kolorimetrischen Assays untersucht. Elastase, eine Serinprotease, die für den Elastinabbau entscheidend ist, spielt eine wichtige Rolle bei der Aufrechterhaltung der Gewebeelastizität in verschiedenen Organen. Der in dieser Arbeit beschriebene kolorimetrische Elastase-Assay bietet eine einfache, empfindliche und schnelle Methode zur Messung der Elastase-A...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
96 Well Cell Culture Plate	Corning Incorporated	3599	Flat bottom with lid, polystyrene
Cell Imaging Multimode Reader	Agilent	BioTek Cytation 1	Used with Gen5 software
Elastase From Porcine Pancreas	Sigma-Aldrich	E7885	CAS 39445-21-1; 25,9 kDa
Isopropanol 99.5%	Fisher Scientific	AC184130010	CAS 67-63-0; C3H8O; 60.10 g/mol
N-Succinil-(Ala)3-nitroanilide	Sigma-Aldrich	S4760	CAS 52299-14-6; C19H25N5O8 ; 451.43 g/mol
pH Meter	Hach Lange	sensION+ PH31	With magnetic stirrer and sensor holder
Phenylmethanesulfonyl Fluoride	Sigma-Aldrich	P7626	CAS 329-98-6; C7H7FO2S; 174,19 g/mol
Tris For Molecular Biology	PanReac AppliChem	A2264	CAS 77-86-1; C4H11NO3; 121,14 g/mol