JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

هنا ، نصف بعمق طريقة تعتمد على التصوير المقطعي المحوسب الدقيق ، لتقسيم وقياس النماذج ثلاثية الأبعاد لعظام الوجه والفكين في الفئران ، من أجل تقييم أفضل لنمو العظام القحفية والفكينية في الفئران أكثر مما هو ممكن بالطرق الحالية.

Abstract

لنمذجة التشوهات القحفية الوجهية الناجمة عن نقص فيتامين أ (VAD) ، عبرنا عن طفرة مستقبلات الريتينويد السلبية المهيمنة في بانيات العظم لتثبيط نشاط النسخ RAR على وجه التحديد في الفئران. سمح لنا هذا النهج بالتحقيق في آثار VAD على نقص المعادن في الجمجمة ، وتشوه الفك السفلي ، ونقص تنسج الترقوة في الحالات السريرية. في هذه الدراسة ، يمثل التصوير المقطعي المحوسب الدقيق (microCT) للمنطقة القحفية الوجهية والفكينية للفئران أداة قيمة لدراسة نمو وتطور هذا النموذج الحيواني. التقدير اليدوي للصور يستغرق وقتا طويلا وغير دقيق. ومن ثم ، نقدم هنا نهجا مباشرا وفعالا ودقيقا لتجزئة وقياس صور التصوير المقطعي المحوسب الدقيقة لكل عظم قحفي للوجه والفكين. تم استخدام برنامج MicroCT لتقطيع الفك السفلي ، والعظم الأمامي ، والعظام الجدارية ، وعظم الأنف ، والفك العلوي ، والفك العلوي ، والعظام بين الجدارية ، والعظام القذالية للفئران وقياس الأطوال والعرض المقابل. يمكن تطبيق طريقة التجزئة هذه لدراسة النمو والتطور في علم الأحياء التنموي والطب الحيوي والعلوم الأخرى ذات الصلة وتسمح للباحثين بتحليل آثار الطفرات الجينية على العظام القحفية الوجهية الفردية.

Introduction

يشمل التطور المعقد للجمجمة والوجه البشري عملية مورفوجينية ثلاثية الأبعاد معقدة ، مدبرة بشكل معقد بواسطة العديد من الجينات. تلعب هذه الجينات دورا محوريا في تنظيم الأنماط المعقدة والتكاثر والتمايز للأنسجة المشتقة من مصادر جنينية متنوعة. تؤكد هذه العملية المنسقة للغاية على تعقيد نمو وتطور الإنسان في القحف الوجهي. تمثل التشوهات القحفية الوجهية (بما في ذلك الشفة المشقوقة والحنك المشقوق ، وإغلاق خياطة القحف ، ونقص تنسج الوجه) التي تحدث نتيجة لتشوهات النمو أكثر من ثلث جميع العيوب الخلقية الخلقية. كحيوان نموذجي شائع الاستخدام في البحوث الطبية الحيوية ، يمتلك الفأر بنية عظمية قحفية وفسكينية معقدة وحساسة تشبه إلى حد بعيد عظم القحف والفكين البشري من حيث علم التشريح وعلم وظائف الأعضاء. قطعت دراسة بيولوجيا نمو الوجه والفكين شوطا طويلا في السنوات الأخيرة مع ظهور تقنيات جديدة في علم الوراثة للفئران ، خاصة في التشوهات1.

حمض الريتينويك (RA) هو المستقلب في الجسم الحي لفيتامين أ2. يرتبط نقص فيتامين أ (VAD) بمجموعة من الاضطرابات الخطيرة متعددة الأجهزة ، مثل ضعف إعادة تشكيل العظام والكسور وكذلك التشوهات القحفية الوجهية وتشوهات الهيكل العظمي التي تتميز بالتقزم3،4 . مستقبلات الريتينويد (RARs) هي عوامل نسخ حاسمة في إشارات الريتينويد5. تم تصميم متحولة RARα403 سلبية سائدة (dnRARα)6 وتم إنشاء نموذج فأر عبرت فيه بانيات العظم عن dnRARα. أدى ذلك إلى ظهور الفئران على التقزم ، والتشوهات القحفية الوجهية ، وتكوين العظام القشرية غير المكتمل ، وزيادة العظام التربيقية ولكن تم إعادة تشكيلها بشكل سيئ.

يتمتع التصوير المقطعي المحوسب الدقيق (microCT) بإمكانيات كبيرة لدراسة التشوهات القحفية والفكينية الوجهية. تمتلك القدرة على اكتشاف وتتبع تطور كل من تشوهات الهيكل العظمي الفطرية والمكتسبة في نماذج القوارض. يقدم تحليل التصوير المقطعي المحوسب استكشافا متعمقا لاضطرابات النمو القحفية الوجهية في نماذج الفئران المعدلة وراثيا7،8 . علاوة على ذلك ، يظهر التصوير ثلاثي الأبعاد كأداة حيوية لتحديد السمات المورفولوجية ، مما يسهل التحليل المخصص ونهج التصور9. تم استخدام التصوير المقطعي المحوسب الدقيق في العديد من الدراسات لتحليل الأنماط الظاهرية القحفية الوجهية ، بما في ذلك تحديد المعالم التشريحية في البشر والفئران والتحليل الحجمي لكل عظم قحفي وجهي10،11،12. هنا ، نصف بالتفصيل طريقة تعتمد على تقنية microCT لفصل وقياس النماذج ثلاثية الأبعاد لعظام الوجه والفكين للفأر لتمكين تقييم وتحليل أفضل لتطور الهيكل العظمي القحفي والفكيني للفأر أكثر مما هو ممكن مع الطرق الحالية.

Protocol

لقد امتثلنا لجميع اللوائح الأخلاقية ذات الصلة للتجارب والأبحاث على. تمت الموافقة على جميع الإجراءات الحيوانية التجريبية من قبل اللجنة الاستشارية المؤسسية لرعاية والبحوث التابعة لمستشفى شنغهاي الشعبي التاسع ، كلية الطب ، جامعة شنغهاي جياوتونغ.

تم الحفاظ على سلالة Rosa26-loxp-stop-loxp-dnRARα403 (R26dn / dn) و Osterix-Cre (OsxCre) (رقم 006361) سلالة الفئران المستخدمة هنا على خلفية C57BL / 6. تم عبور الفئران R26dn / dn مع فئران OsxCre لتوليد OSXCre ؛ R26dn / dn الفئران. تم تربية جميع الفئران وصيانتها في ظل ظروف محددة خالية من مسببات الأمراض (SPF).

1. تربية الفئران

ملاحظة: F تعني عدد أجيال الفئران. N يعني عدد أجيال التزاوج بين الفئران الزيجوت وفئران الخلفية. وبالتالي ، يمثل F2 + N الجيل الثاني بالإضافة إلى أي برامج تربية فئران لاحقة. F0 تعني الفئران الأولية.

  1. قم بإقران فأر ذكر ناضج جنسيا مع زوج من إناث الفئران في نفس العمر. ابدأ عمليات التفتيش اليومية للصغار حديثي الولادة بعد فترة أولية مدتها 18 يوما. عند تحديد الإناث الحوامل ، قم بعزلها إذا لزم الأمر لضمان الرعاية المثلى للأمهات. في حالة عدم ملاحظة أي حمل في غضون شهر من الاقتران الأولي ، ضع في اعتبارك تبديل الفأر الذكر بين إعدادات التكاثر المختلفة لتعزيز الإخصاب.
  2. يعبر R26[د]/[دن] فئران مع OSX[ كري] فئران ([ف0]). قص ذيول للتنميط الجيني والحفاظ على ذكر OSXCre ؛ R26dn / + الفئران في أقفاص حتى تنضج جنسيا ، وهو ~ 6 أسابيع من العمر (F1).
  3. عبر ذكر OSX Cre البالغ من العمر ستة أسابيع ؛ R26dn / + الفئران مع إناث الفئران R26dn / dn(F2). قص ذيول التنميط الجيني واستبدل فئران التكاثر القديمة بالفئران الأصغر سنا في الوقت المناسب (F2 + N).

2. التحضير

  1. تحضير أربعة أزواج من Osx Cre البالغة من العمر 4 أسابيع ، OSXCre ؛ R26dn / + ، و OSXCre ؛ R26dn / dn الفئران. القتل الرحيم للفئران بشكل فردي من خلال إعطاء الاختناق بثاني أكسيد الكربون.
    ملاحظة: لضمان القتل الرحيم الفعال ، يجب تعديل معدل تدفق ثاني أكسيد الكربون2 لإزاحة ما يقرب من 30٪ من حجم القفص كل دقيقة. على سبيل المثال ، في قفص بقياس 45 سم × 30 سم × 30 سم ، يوصى بمعدل تدفق 40 لترا / دقيقة.
  2. اقطع عنق الفأر بالمقص مع الإمساك بجسده ، مع ترك الجمجمة سليمة.
    ملاحظة: للحصول على جمجمة كاملة ، افتح فم الفأر ، واقطع على طول زاوية الفم بمقص للعيون ، واسحب كلتا يديك إلى كلا الجانبين ، وقم بتدويرها لتقشير جلد رأس الفأر.
  3. اغمر جماجم الفأر في 4٪ بارافورمالدهايد لمدة 48 ساعة ، ثم قم بتخزينها في 70٪ من الإيثانول.
    تحذير: بارافورمالدهيد سام. ارتداء الحماية المناسبة.
  4. امسح الجماجم المجمعة باستخدام ماسح ضوئي بالأشعة المقطعية الدقيقة - الدقة: 4.5 ميكرومتر ؛ الجهد: 70 كيلو فولت ؛ التيار: 114 ميكرو أمبير ؛ الفلتر: 0.5 مم Al ؛ خطوة الدوران: 0.5 درجة.
  5. تخزين صور التصوير المقطعي المحوسب. يتم تحديد الصور بتنسيق DICOM للاستيراد إلى البرنامج وتحليلها.

3. التصوير المقطعي المحوسب وإعادة بناء 3D

ملاحظة: تم تقسيم جميع العظام المستخدمة في هذه الدراسة يدويا.

  1. انقر فوق زر الماوس الأيمن في صفحة الأقنعة وحدد قناع جديد. تظهر طبقة جديدة تسمى الأخضر .
  2. حدد نطاق الحد 671-2,566 في صفحة العتبة المنبثقة. كرر هذه العملية لجميع الطبقات ذات الصلة. (الشكل 1 أ).
  3. استخدم أداة Eraser في قائمة Edit لمسح العظام المتصلة بالفك السفلي يدويا في كل طبقة على المستوى السهمي ثنائي الأبعاد (الشكل 1 ب).
  4. حدد منطقة الفك السفلي على المستوى السهمي ثنائي الأبعاد بعد النقر فوق خيار نمو المنطقة (الشكل 1 ج).
    تنبيه: تأكد من تحديد منطقة الفك السفلي بالكامل في كل طبقة. خلاف ذلك ، سيؤدي ذلك إلى فك سفلي غير مكتمل بعد إعادة البناء.
  5. انقر فوق الطبقة التي تم إنشاؤها حديثا الفك السفلي في صفحة MASKS وحدد حساب 3D من القائمة المنسدلة (الشكل 1D).
  6. في واجهة كائنات 3D ، انقر بزر الماوس الأيمن فوق الفك السفلي وانقر فوق خصائص. انقر لتغيير اللون. رمز اللون جميع النماذج ثلاثية الأبعاد التي أعيد بناؤها بعظام مختلفة.
  7. انقر فوق قياس في الزاوية اليسرى العليا وحدد المسافة من القائمة المنسدلة التي تظهر. احسب الطول عن طريق تحديد النقاط في الصورة ثلاثية الأبعاد (الشكل 1E).
    تنبيه: مرجع قياس عرض العظام هو أوسع جزء من العظم.
  8. في واجهة 3D-objects ، انقر بزر الماوس الأيمن فوق الفك السفلي وانقر فوق خصائص. وحدة الخصائص والمعلومات والحجم لقراءة قيم الحجم المعاد بناؤها لكل كتلة عظمية قحفية وسفكينية. (الشكل 1F).
  9. قم بقياس الفك السفلي ، والعظم الأمامي ، والعظم الجداري ، وعظم الأنف ، والفك العلوي ، والفك العلوي ، والعظم الجداري ، والعظم القذالي بنفس الطريقة المذكورة أعلاه وقم بتمييزها بشكل فردي بألوان مختلفة.

4. التحليل الإحصائي

  1. إجراء التحليل الإحصائي باستخدام البرنامج المفضل. قم بإجراء اختبارات t للطالب ثنائية الذيل (ن = 4 / مجموعة).
  2. بالنسبة لجميع الرسوم البيانية، استخدم أشرطة الخطأ لتمثيل الانحرافات المعيارية. ضع في اعتبارك قيم P < 0.05 ذات دلالة إحصائية.

النتائج

تؤكد الأبحاث المكثفة على التأثير متعدد الأوجه للطفرات الجينية على نمو الفئران وتطورها وأنظمة الأعضاء. يتطلب التقييم الشامل للعظام القحفية الوجهية في الفئران الطافرة طرقا تتجاوز تحليل الصور أحادية الأنسجة أو ثنائية الأبعاد نظرا لقيودها. لذلك ، فإن تو?...

Discussion

MicroCT هي أداة قوية للحصول على معلومات ثلاثية الأبعاد واقعية ومتناحية، من عينات بيولوجية كثيفة وغير شفافة بدقة ميكرومتر. تتم معايرة البيانات التي تم الحصول عليها من microCT من حيث الهندسة والكثافة ، مما يجعلها مفيدة بشكل خاص للدراسات الكمية13،14

Disclosures

ليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح للإفصاح عنه.

Acknowledgements

تم دعم هذا العمل جزئيا من خلال المنح المقدمة من مؤسسة مقاطعة هاينان للعلوم الطبيعية في الصين (824MS152).

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
GraphPad Prism 6.01 SoftwareGraphPad Software Inc., La Jolla, CA, USA/
Micro-CTQuantum GX micro CT, PerkinElmer,
Waltham, MA, USA		/
Mimics Medical 19.0 Materialise, Leuven, Belgium/
Osterix-Cre (OsxCre) //from the Jackson Laboratory
Rosa26-loxp-stop-loxp-dnRARα403 strain//from the Columbia University, USA

References

  1. Chai, Y., Maxson, R. E. Recent advances in craniofacial morphogenesis. Dev Dyn. 235 (9), 2353-2375 (2006).
  2. Mason, J. B., et al. Should universal distribution of high dose vitamin A to children cease. BMJ. 360, k927 (2018).
  3. Roulier, S., Rochette-Egly, C., Rebut-Bonneton, C., Porquet, D., Evain-Brion, D. Nuclear retinoic acid receptor characterization in cultured human trophoblast cells: Effect of retinoic acid on epidermal growth factor receptor expression. Mol Cell Endocrinol. 105 (2), 165-173 (1994).
  4. Hayes, K. C., Cousins, R. J. Vitamin A deficiency and bone growth. I. Altered drift patterns. Calcif Tissue Res. 6 (2), 120-132 (1970).
  5. Ghyselinck, N. B., Duester, G. Retinoic acid signaling pathways. Development. 146 (13), dev167502 (2019).
  6. Damm, K., Heyman, R. A., Umesono, K., Evans, R. M. Functional inhibition of retinoic acid response by dominant negative retinoic acid receptor mutants. Proc Natl Acad Sci U S A. 90 (7), 2989-2993 (1993).
  7. Ford-Hutchinson, A. F., Cooper, D. M., Hallgrímsson, B., Jirik, F. R. Imaging skeletal pathology in mutant mice by microcomputed tomography. J Rheumatol. 30 (12), 2659-2665 (2003).
  8. Brewer, S., Feng, W., Huang, J., Sullivan, S., Williams, T. Wnt1-cre-mediated deletion of ap-2alpha causes multiple neural crest-related defects. Dev Biol. 267 (1), 135-152 (2004).
  9. Wong, M. D., Dorr, A. E., Walls, J. R., Lerch, J. P., Henkelman, R. M. A novel 3d mouse embryo atlas based on micro-ct. Development. 139 (17), 3248-3256 (2012).
  10. Motch Perrine, S. M., et al. Craniofacial divergence by distinct prenatal growth patterns in fgfr2 mutant mice. BMC Dev Biol. 14, 8 (2014).
  11. Percival, C. J., Huang, Y., Jabs, E. W., Li, R., Richtsmeier, J. T. Embryonic craniofacial bone volume and bone mineral density in fgfr2(+/p253r) and nonmutant mice. Dev Dyn. 243 (4), 541-551 (2014).
  12. Titiz, I., Laubinger, M., Keller, T., Hertrich, K., Hirschfelder, U. Repeatability and reproducibility of landmarks--a three-dimensional computed tomography study. Eur J Orthod. 34 (3), 276-286 (2012).
  13. Mizutani, R., Suzuki, Y. X-ray microtomography in biology. Micron. 43 (2-3), 104-115 (2012).
  14. Salomé, M., et al. A synchrotron radiation microtomography system for the analysis of trabecular bone samples. Med Phys. 26 (10), 2194-2204 (1999).
  15. Mizutani, R., et al. Three-dimensional microtomographic imaging of human brain cortex. Brain Res. 1199, 53-61 (2008).
  16. De Crespigny, A., et al. 3D micro-CT imaging of the postmortem brain. J Neurosci Methods. 171 (2), 207-213 (2008).
  17. Johnson, J. T., et al. Virtual histology of transgenic mouse embryos for high-throughput phenotyping. PLoS Genet. 2 (4), e61 (2006).
  18. Zou, W., Hunter, N., Swain, M. V. Application of polychromatic µct for mineral density determination. J Dent Res. 90 (1), 18-30 (2011).
  19. Neues, F., Epple, M. X-ray microcomputer tomography for the study of biomineralized endo- and exoskeletons of animals. Chem Rev. 108 (11), 4734-4741 (2008).
  20. Gabner, S., Böck, P., Fink, D., Glösmann, M., Handschuh, S. The visible skeleton 2.0: Phenotyping of cartilage and bone in fixed vertebrate embryos and foetuses based on x-ray microCT. Development. 147 (11), dev187633 (2020).
  21. Ermakova, O., Orsini, T., Gambadoro, A., Chiani, F., Tocchini-Valentini, G. P. Three-dimensional microCT imaging of murine embryonic development from immediate post-implantation to organogenesis: Application for phenotyping analysis of early embryonic lethality in mutant animals. Mamm Genome. 29 (3-4), 245-259 (2018).
  22. Wong, M. D., Maezawa, Y., Lerch, J. P., Henkelman, R. M. Automated pipeline for anatomical phenotyping of mouse embryos using micro-ct. Development. 141 (12), 2533-2541 (2014).
  23. Rajion, Z. A., et al. A three-dimensional computed tomographic analysis of the cervical spine in unoperated infants with cleft lip and palate. Cleft Palate Craniofac J. 43 (5), 513-518 (2006).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

215

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved