JoVE Logo
Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Burada, farelerde kraniyomaksillofasiyal kemik gelişiminin mevcut yöntemlerle mümkün olandan daha iyi değerlendirilmesi için farelerde kraniyomaksillofasiyal kemiklerin 3D modellerini segmentlere ayırmak ve ölçmek için mikrobilgisayarlı tomografiye dayanan bir yöntemi derinlemesine açıklıyoruz.

Özet

A vitamini eksikliğinin (VAD) neden olduğu kraniyofasiyal malformasyonları modellemek için, farelerde RAR transkripsiyonel aktivitesini spesifik olarak inhibe etmek için osteoblastlarda baskın-negatif bir retinoid reseptör mutasyonu ifade ettik. Bu yaklaşım, klinik vakalarda VAD'nin kraniyal hipomineralizasyon, mandibular deformite ve klaviküler hipoplazi üzerindeki etkilerini araştırmamızı sağlamıştır. Bu çalışmada, farelerin kraniyomaksillofasiyal bölgesinin mikrobilgisayarlı tomografi (mikroBT) taraması, bu hayvan modelinin büyümesini ve gelişimini incelemek için değerli bir araç temsil etti. Görüntülerin manuel olarak tahmin edilmesi hem zaman alıcı hem de yanlıştır. Bu nedenle, burada, her bir kraniyomaksillofasiyal kemiğin mikroBT görüntülerini segmentlere ayırmak ve ölçmek için basit, verimli ve doğru bir yaklaşım sunuyoruz. Farelerin mandibula, frontal kemik, parietal kemik, burun kemiği, premaksilla, maksilla, interparietal kemik ve oksipital kemiği dilimlemek ve bunlara karşılık gelen uzunluk ve genişlikleri ölçmek için MicroCT yazılımı kullanıldı. Bu segmentasyon yöntemi, gelişim biyolojisi, biyotıp ve diğer ilgili bilimlerde büyüme ve gelişmeyi incelemek için uygulanabilir ve araştırmacıların genetik mutasyonların bireysel kraniyofasiyal kemikler üzerindeki etkilerini analiz etmelerine olanak tanır.

Giriş

İnsan kafatasının ve yüzünün karmaşık gelişimi, çok sayıda gen tarafından karmaşık bir şekilde düzenlenen karmaşık bir 3D morfogenetik süreci kapsar. Bu genler, çeşitli embriyonik kaynaklardan türetilen dokuların karmaşık modellerini, çoğalmasını ve farklılaşmasını düzenlemede çok önemli bir rol oynar. Bu son derece koordineli süreç, insan kraniyofasiyal büyüme ve gelişiminin karmaşıklığının altını çizmektedir. Gelişimsel anormalliklerin bir sonucu olarak ortaya çıkan kraniyofasiyal malformasyonlar (yarık dudak ve damak, kraniyal sütür kapanması ve yüz hipoplazisi dahil) tüm konjenital doğum kusurlarının üçte birinden fazlasını oluşturur. Biyomedikal araştırmalarda yaygın olarak kullanılan bir model hayvan olan fare, anatomi ve fizyoloji açısından insan kraniyomaksillofasiyal kemiğine çok benzeyen karmaşık ve hassas bir kraniyomaksillofasiyal kemik yapısına sahiptir. Kraniomaksillofasiyal gelişim biyolojisi çalışmaları, fare genetiğinde, özellikle malformasyonlarda yeni tekniklerin ortaya çıkmasıyla son yıllarda uzun bir yol kat etmiştir1.

Retinoik asit (RA), A2 vitamininin in vivo metabolitidir. A vitamini eksikliği (VAD), zayıf kemik yeniden şekillenmesi, kırıkların yanı sıra kraniyofasiyal malformasyonlar ve cücelik ile karakterize iskelet malformasyonları gibi bir dizi ciddi multisistem bozukluğu ile ilişkilidir 3,4 . Retinoid reseptörleri (RAR'lar), retinoid sinyalizasyonunda çok önemli transkripsiyon faktörleridir5. Baskın-negatif bir RARα403 mutantı (dnRARα) tasarlandı6 ve osteoblastların dnRARα'yı eksprese ettiği bir fare modeli kuruldu. Bu, farelerin cücelik, kraniyofasiyal deformiteler, eksik kortikal kemik oluşumu ve artmış ancak kötü bir şekilde yeniden şekillenmiş trabeküler kemik sergilemesine neden oldu.

Mikrobilgisayarlı tomografi (mikroBT), kraniyomaksillofasiyal malformasyonların incelenmesi için büyük bir potansiyele sahiptir. Kemirgen modellerinde hem doğuştan gelen hem de edinilmiş iskelet anormalliklerinin evrimini tespit etme ve izleme yeteneğine sahiptir. MikroCT görüntüleme analizi, genetiği değiştirilmiş fare modellerinde kraniyofasiyal büyüme bozukluklarının derinlemesine araştırılmasını sağlar 7,8 . Ayrıca, 3D görüntüleme, morfolojik özellikleri tanımlamak, özel analiz ve görselleştirme yaklaşımlarını kolaylaştırmak için hayati bir araç olarak ortaya çıkmaktadır9. Mikro-BT, insanlarda ve farelerde anatomik işaretlerin tanımlanması ve her bir kraniyofasiyal kemiğinhacimsel analizi dahil olmak üzere kraniyofasiyal fenotipleri analiz etmek için çeşitli çalışmalarda kullanılmıştır 10,11,12. Burada, fare kraniyomaksillofasiyal iskelet gelişiminin mevcut yöntemlerle mümkün olandan daha iyi değerlendirilmesini ve analiz edilmesini sağlamak için fare kraniyomaksillofasiyal kemiklerinin 3D modellerini ayırmak ve ölçmek için mikroCT teknolojisine dayalı bir yöntemi ayrıntılı olarak açıklıyoruz.

Protokol

Hayvanlar üzerinde yapılan testler ve araştırmalar için ilgili tüm etik düzenlemelere uyduk. Tüm deney hayvanı prosedürleri, Şanghay Jiaotong Üniversitesi Tıp Fakültesi, Şanghay Dokuzuncu Halk Hastanesi Kurumsal Hayvan Bakımı ve Araştırma Danışma Komitesi tarafından onaylandı.

Burada kullanılan farelerin hem Rosa26-loxp-stop-loxp-dnRARα403 suşu (R26dn/dn) hem de Osterix-Cre (OsxCre) (No.006361) suşu C57BL/6 arka planında korunmuştur. R26dn/dn fareler, OSX Cre oluşturmak için OsxCre fareleri ile çaprazlandı; R26dn/dn fareler. Tüm fareler, belirli patojen içermeyen (SPF) koşullar altında yetiştirildi ve korundu.

1. Farelerin ıslahı

NOT: F, farelerin nesil sayısı anlamına gelir; N, zigotik fareler ve arka plan fareleri arasındaki çiftleşme nesillerinin sayısı anlamına gelir. Bu nedenle, F2+N, ikinci neslin yanı sıra sonraki fare yetiştirme programlarını da temsil eder. F0 birincil fareler anlamına gelir.

  1. Cinsel olarak olgun bir erkek fareyi, benzer yaştaki bir çift dişi fare ile eşleştirin. İlk 18 günlük bir süreden sonra yeni doğan yavrular için günlük muayenelere başlayın. Hamile kadınları belirledikten sonra, en iyi anne bakımını sağlamak için gerekirse onları izole edin. İlk eşleşmeden sonraki bir ay içinde herhangi bir gebelik gözlenmemesi durumunda, döllenmeyi teşvik etmek için erkek fareyi farklı üreme kurulumları arasında değiştirmeyi düşünün.
  2. R26dn/dnfareleri ile OSXCre fareleri (F0) çaprazlayın. Genotipleme için kuyrukları kırpın ve erkek OSXCre'yi koruyun; R26dn/+fareler cinsel olarak olgunlaşana kadar, yani ~6 haftalık olana kadar kafeslerde (F1).
  3. Altı haftalık erkek OSXCre'yi çaprazlayın; R26dn/+dişi R26dn/dnfareler (F2) ile fareler. Genotipleme için kuyrukları kırpın ve eski üreyen fareleri zamanla daha genç farelerle değiştirin (F2 + N).

2. Hazırlık

  1. Dört çift 4 haftalık OsxCre, OSXCre hazırlayın; R26dn/+ ve OSXCre; R26dn/dn fareler. Karbondioksit boğulması yoluyla fareleri ayrı ayrı ötenazi yapın.
    NOT: Etkili ötenaziyi sağlamak için, CO2 akış hızı, her dakika kafesin hacminin yaklaşık% 30'unu yer değiştirecek şekilde ayarlanmalıdır. Örneğin, 45 cm x 30 cm x 30 cm ölçülerindeki bir kafeste 40 L/dk'lık bir akış hızı önerilir.
  2. Farenin boynunu vücudunu tutarken makasla kesin ve kafatasını sağlam bırakın.
    NOT: Tam bir kafatası elde etmek için farenin ağzını açın, ağzın köşesini oftalmik makasla kesin, her iki elinizi her iki tarafa çekin ve farenin kafasının derisini soymak için döndürün.
  3. Fare kafataslarını 48 saat boyunca% 4 paraformaldehite batırın, ardından% 70 etanol içinde saklayın.
    DİKKAT: Paraformaldehit toksiktir; Uygun koruma kullanın.
  4. Toplanan kafataslarını bir mikroCT tarayıcı ile tarayın - çözünürlük: 4.5 μm; voltaj: 70 kV; akım: 114 μA; filtre: 0,5 mm Al; dönme adımı: 0,5 °.
  5. CT tarama görüntülerini saklayın. DICOM formatındaki görüntüler yazılıma aktarılmak üzere seçilir ve analiz edilir.

3. MikroCT görüntüleme ve 3D rekonstrüksiyon

NOT: Bu çalışmada kullanılan tüm kemikler manuel olarak segmentlere ayrılmıştır.

  1. MASKELER sayfasında farenin sağ tuşuna tıklayın ve Yeni maske'yi seçin; Yeşil adlı yeni bir katman görünür.
  2. Açılan Thresholding (Eşikleme ) sayfasında 671-2.566 eşik aralığını seçin. İlgili tüm katmanlar için bu işlemi tekrarlayın. (Şekil 1A).
  3. 2B sagital düzlemdeki her katmanda mandibulaya bağlı kemikleri manuel olarak silmek için Düzenle menüsündeki Silgi aracını kullanın (Şekil 1B).
  4. Bölge Büyütme seçeneğine tıkladıktan sonra 2D sagital düzlemde mandibula bölgesini seçin (Şekil 1C).
    DİKKAT: Her katmanda mandibular bölgenin eksiksiz olarak seçildiğinden emin olun; Aksi takdirde, rekonstrüksiyondan sonra eksik bir mandibula ile sonuçlanacaktır.
  5. MASKELER sayfasında yeni oluşturulan Mandibul katmanına tıklayın ve açılır menüden 3D'yi Hesapla'yı seçin (Şekil 1D).
  6. 3B nesneler arayüzünde, Mandible'a sağ tıklayın ve Özellikler'e tıklayın. Rengi değiştirmek için tıklayın. Farklı kemiklerle yeniden yapılandırılan tüm 3D modelleri renk koduyla kodlayın.
  7. Sol üst köşedeki Ölç'e tıklayın ve beliren açılır menüden mesafeyi seçin. 3D görüntüdeki noktaları işaretleyerek uzunluğu hesaplayın (Şekil 1E).
    DİKKAT: Kemik genişliğini ölçmek için referans, kemiğin en geniş kısmıdır.
  8. 3B nesneler arayüzünde, Mandible'a sağ tıklayın ve Özellikler'e tıklayın. Her kraniyomaksillofasiyal kemik bloğu için yeniden yapılandırılmış hacim değerlerini okumak için Özellikler-Bilgi-Hacim modülü. (Şekil 1F).
  9. Mandibula, frontal kemik, parietal kemik, burun kemiği, premaksilla, maksilla, interparietal kemik ve oksipital kemiği yukarıdakiyle aynı şekilde ölçün ve bunları farklı renklerle ayrı ayrı işaretleyin.

4. İstatistiksel analiz

  1. Tercih ettiğiniz yazılımı kullanarak istatistiksel analiz yapın. İki kuyruklu Öğrenci t-testlerini gerçekleştirin (n = 4/grup).
  2. Tüm grafiklerde, standart sapmaları temsil etmek için hata çubuklarını kullanın. P değerlerini < 0.05 olarak istatistiksel olarak anlamlı düşünün.

Sonuçlar

Kapsamlı araştırmalar, genetik mutasyonların fare büyümesi, gelişimi ve organ sistemleri üzerindeki çok yönlü etkisinin altını çizmektedir. Mutant farelerde kraniyofasiyal kemiklerin kapsamlı bir değerlendirmesi, sınırlamaları nedeniyle tek doku veya 2D görüntü analizinin ötesinde yöntemler gerektirir. Bu nedenle, kraniyofasiyal kemik gelişiminin aydınlatılması, insan kraniyofasiyal bozukluklarının araştırılması için bü...

Tartışmalar

MikroCT, mikrometre çözünürlüğü ile yoğun ve opak biyolojik örneklerden gerçekçi ve izotropik 3D bilgi elde etmek için güçlü bir araçtır. MikroBT'den elde edilen veriler geometri ve yoğunluk için kalibre edilir, bu da onu özellikle kantitatif çalışmalar için yararlı kılar 13,14,15,16,17. Kemik ve diş...

Açıklamalar

Yazarların açıklanacak herhangi bir çıkar çatışması yoktur.

Teşekkürler

Bu çalışma kısmen Çin'in Hainan İl Doğa Bilimleri Vakfı'ndan (824MS152) alınan hibelerle desteklenmiştir.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
GraphPad Prism 6.01 SoftwareGraphPad Software Inc., La Jolla, CA, USA/
Micro-CTQuantum GX micro CT, PerkinElmer,
Waltham, MA, USA		/
Mimics Medical 19.0 Materialise, Leuven, Belgium/
Osterix-Cre (OsxCre) //from the Jackson Laboratory
Rosa26-loxp-stop-loxp-dnRARα403 strain//from the Columbia University, USA

Referanslar

  1. Chai, Y., Maxson, R. E. Recent advances in craniofacial morphogenesis. Dev Dyn. 235 (9), 2353-2375 (2006).
  2. Mason, J. B., et al. Should universal distribution of high dose vitamin A to children cease. BMJ. 360, k927 (2018).
  3. Roulier, S., Rochette-Egly, C., Rebut-Bonneton, C., Porquet, D., Evain-Brion, D. Nuclear retinoic acid receptor characterization in cultured human trophoblast cells: Effect of retinoic acid on epidermal growth factor receptor expression. Mol Cell Endocrinol. 105 (2), 165-173 (1994).
  4. Hayes, K. C., Cousins, R. J. Vitamin A deficiency and bone growth. I. Altered drift patterns. Calcif Tissue Res. 6 (2), 120-132 (1970).
  5. Ghyselinck, N. B., Duester, G. Retinoic acid signaling pathways. Development. 146 (13), dev167502 (2019).
  6. Damm, K., Heyman, R. A., Umesono, K., Evans, R. M. Functional inhibition of retinoic acid response by dominant negative retinoic acid receptor mutants. Proc Natl Acad Sci U S A. 90 (7), 2989-2993 (1993).
  7. Ford-Hutchinson, A. F., Cooper, D. M., Hallgrímsson, B., Jirik, F. R. Imaging skeletal pathology in mutant mice by microcomputed tomography. J Rheumatol. 30 (12), 2659-2665 (2003).
  8. Brewer, S., Feng, W., Huang, J., Sullivan, S., Williams, T. Wnt1-cre-mediated deletion of ap-2alpha causes multiple neural crest-related defects. Dev Biol. 267 (1), 135-152 (2004).
  9. Wong, M. D., Dorr, A. E., Walls, J. R., Lerch, J. P., Henkelman, R. M. A novel 3d mouse embryo atlas based on micro-ct. Development. 139 (17), 3248-3256 (2012).
  10. Motch Perrine, S. M., et al. Craniofacial divergence by distinct prenatal growth patterns in fgfr2 mutant mice. BMC Dev Biol. 14, 8 (2014).
  11. Percival, C. J., Huang, Y., Jabs, E. W., Li, R., Richtsmeier, J. T. Embryonic craniofacial bone volume and bone mineral density in fgfr2(+/p253r) and nonmutant mice. Dev Dyn. 243 (4), 541-551 (2014).
  12. Titiz, I., Laubinger, M., Keller, T., Hertrich, K., Hirschfelder, U. Repeatability and reproducibility of landmarks--a three-dimensional computed tomography study. Eur J Orthod. 34 (3), 276-286 (2012).
  13. Mizutani, R., Suzuki, Y. X-ray microtomography in biology. Micron. 43 (2-3), 104-115 (2012).
  14. Salomé, M., et al. A synchrotron radiation microtomography system for the analysis of trabecular bone samples. Med Phys. 26 (10), 2194-2204 (1999).
  15. Mizutani, R., et al. Three-dimensional microtomographic imaging of human brain cortex. Brain Res. 1199, 53-61 (2008).
  16. De Crespigny, A., et al. 3D micro-CT imaging of the postmortem brain. J Neurosci Methods. 171 (2), 207-213 (2008).
  17. Johnson, J. T., et al. Virtual histology of transgenic mouse embryos for high-throughput phenotyping. PLoS Genet. 2 (4), e61 (2006).
  18. Zou, W., Hunter, N., Swain, M. V. Application of polychromatic µct for mineral density determination. J Dent Res. 90 (1), 18-30 (2011).
  19. Neues, F., Epple, M. X-ray microcomputer tomography for the study of biomineralized endo- and exoskeletons of animals. Chem Rev. 108 (11), 4734-4741 (2008).
  20. Gabner, S., Böck, P., Fink, D., Glösmann, M., Handschuh, S. The visible skeleton 2.0: Phenotyping of cartilage and bone in fixed vertebrate embryos and foetuses based on x-ray microCT. Development. 147 (11), dev187633 (2020).
  21. Ermakova, O., Orsini, T., Gambadoro, A., Chiani, F., Tocchini-Valentini, G. P. Three-dimensional microCT imaging of murine embryonic development from immediate post-implantation to organogenesis: Application for phenotyping analysis of early embryonic lethality in mutant animals. Mamm Genome. 29 (3-4), 245-259 (2018).
  22. Wong, M. D., Maezawa, Y., Lerch, J. P., Henkelman, R. M. Automated pipeline for anatomical phenotyping of mouse embryos using micro-ct. Development. 141 (12), 2533-2541 (2014).
  23. Rajion, Z. A., et al. A three-dimensional computed tomographic analysis of the cervical spine in unoperated infants with cleft lip and palate. Cleft Palate Craniofac J. 43 (5), 513-518 (2006).

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

Geli im BiyolojisiSay 215Kraniyofasiyal kemik geli imikraniyofasiyal deformiteboyutlumikro bilgisayarl tomografig r nt f zyonumanuel segmentasyonlu

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır