Analyse des malformations craniomaxillo-faciales chez la souris à l’aide de la microtomodensitométrie tridimensionnelle

Résumé

Ici, nous décrivons en profondeur une méthode, basée sur la tomographie micro-informatisée, pour segmenter et mesurer des modèles 3D d’os craniomaxillo-faciaux chez la souris, afin de mieux évaluer le développement de l’os craniomaxillo-facial chez la souris que ce qui est possible avec les méthodes actuelles.

Résumé

Pour modéliser les malformations craniofaciales causées par une carence en vitamine A (DAV), nous avons exprimé une mutation du récepteur rétinoïde dominant-négatif dans les ostéoblastes pour inhiber spécifiquement l’activité transcriptionnelle de RAR chez la souris. Cette approche nous a permis d’étudier les effets de la DAV sur l’hypominéralisation crânienne, la déformation mandibulaire et l’hypoplasie claviculaire dans des cas cliniques. Dans cette étude, la tomodensitométrie (microTDM) de la région craniomaxillo-faciale de souris a représenté un outil précieux pour étudier la croissance et le développement de ce modèle animal. L’estimation manuelle des images est à la fois chronophage et imprécise. Par conséquent, nous présentons ici une approche simple, efficace et précise pour segmenter et quantifier les images microCT de chaque os craniomaxillo-facial. Le logiciel MicroCT a été utilisé pour trancher la mandibule, l’os frontal, l’os pariétal, l’os nasal, le prémaxillaire, le maxillaire, l’os interpariétal et l’os occipital des souris et mesurer leurs longueurs et largeurs correspondantes. Cette méthode de segmentation peut être appliquée à l’étude de la croissance et du développement en biologie du développement, en biomédecine et dans d’autres sciences connexes et permet aux chercheurs d’analyser les effets des mutations génétiques sur les os craniofaciaux individuels.

Introduction

Le développement complexe du crâne et du visage humains englobe un processus morphogénétique 3D sophistiqué, orchestré de manière complexe par de nombreux gènes. Ces gènes jouent un rôle central dans la régulation des motifs complexes, la prolifération et la différenciation des tissus dérivés de diverses sources embryonnaires. Ce processus hautement coordonné souligne la complexité de la croissance et du développement craniofaciaux humains. Les malformations craniofaciales (y compris les fentes labiales et palatines, la fermeture des sutures crâniennes et l’hypoplasie faciale) survenant à la suite d’anomalies du développement représentent plus d’un tiers de toutes les malformations congénitales. En tant qu’animal modèle couramment utilisé dans la recherche biomédicale, la souris a une structure osseuse craniomaxillo-faciale complexe et délicate qui est très similaire à l’os craniomaxillo-facial humain en termes d’anatomie et de physiologie. L’étude de la biologie du développement craniomaxillo-faciale a beaucoup évolué ces dernières années avec l’avènement de nouvelles techniques en génétique de souris, en particulier dans les malformations¹.

L’acide rétinoïque (AR) est le métabolite in vivo de la vitamine^A2. La carence en vitamine A (DAV) est associée à une gamme de troubles multisystémiques graves, tels qu’un mauvais remodelage osseux, des fractures, ainsi que des malformations craniofaciales et des malformations squelettiques caractérisées par le nanisme ^3,4 . Les récepteurs rétinoïdes (RAR) sont des facteurs de transcription cruciaux dans la signalisation des rétinoïdes⁵. Un mutant RARα403 dominant-négatif (dnRARα) a^{été conçu 6} et un modèle murin établi dans lequel les ostéoblastes exprimaient dnRARα. Cela a entraîné chez les souris un nanisme, des déformations craniofaciales, une formation incomplète de l’os cortical et une augmentation mais un remodelage de l’os trabéculaire.

La microtomodensitométrie (microTDM) présente un grand potentiel pour l’étude des malformations craniomaxillo-faciales. Il possède la capacité de détecter et de suivre l’évolution des anomalies squelettiques innées et acquises dans des modèles de rongeurs. L’analyse d’imagerie MicroCT offre une exploration approfondie des perturbations de la croissance craniofaciale dans des modèles de souris génétiquement modifiées ^7,8 . De plus, l’imagerie 3D apparaît comme un outil essentiel pour délimiter les traits morphologiques, facilitant ainsi des approches d’analyse et de visualisation sur mesure⁹. La micro-tomodensitométrie a été utilisée dans plusieurs études pour analyser les phénotypes craniofaciaux, y compris la définition de repères anatomiques chez l’homme et la souris et l’analyse volumétrique de chaque os craniofacial 10,11,12. Ici, nous décrivons en détail une méthode basée sur la technologie microCT pour séparer et mesurer des modèles 3D d’os craniomaxillo-faciaux de souris afin de permettre une meilleure évaluation et analyse du développement du squelette craniomaxillo-facial de souris que ce qui est possible avec les méthodes actuelles.

Protocole

Nous avons respecté toutes les réglementations éthiques pertinentes pour les tests et la recherche sur les animaux. Toutes les procédures expérimentales sur des animaux ont été approuvées par le Comité consultatif institutionnel sur les soins et la recherche sur les animaux de la faculté de médecine du neuvième hôpital populaire de Shanghai, de l’Université Jiaotong de Shanghai.

La souche Rosa26-loxp-stop-loxp-dnRAR403 (R26^dn/dn) et la souche Osterix-Cre (Osx^Cre) (n° 006361) des souris utilisées ici ont été maintenues sur le fond C57BL/6. Des souris^{R26 dn/dn} ont été croisées avec des souris Osx^Cre pour générer OSX^Cre ; Souris^{R26 dn/dn} . Toutes les souris ont été élevées et maintenues dans des conditions spécifiques exemptes d’agents pathogènes (FPS).

1. Élevage de souris

REMARQUE : F signifie le nombre de générations de souris ; N signifie le nombre de générations d’accouplement entre les souris zygotiques et les souris de fond. Ainsi, F2+N représente la deuxième génération ainsi que tous les programmes d’élevage de souris ultérieurs. F0 signifie souris primaires.

1. Associez une souris mâle sexuellement mature à une paire de souris femelles d’un âge comparable. Commencer les inspections quotidiennes des nouveau-nés après une période initiale de 18 jours. Lors de l’identification des femelles gestantes, isolez-les si nécessaire pour assurer une prise en charge maternelle optimale. Dans le cas où aucune grossesse n’est observée dans le mois suivant l’accouplement initial, envisagez d’alterner la souris mâle entre différentes configurations de reproduction pour favoriser la fécondation.
2. Croisez des souris^{R26 dn/dn}avec des souris OSX^Cre (F0). Coupez les queues pour le génotypage et gardez le mâle OSX^Cre ; R26^dn/+souris en cage jusqu’à maturité sexuelle, c’est-à-dire à l’âge de ~6 semaines (F1).
3. Croisement OSX^Cre mâle de six semaines ; souris R26^dn/+ avec souris femelles R26^dn/dn(F2). Coupez les queues pour le génotypage et remplacez les vieilles souris reproductrices par des souris plus jeunes à temps (F2+N).

2. Préparation

1. Préparez quatre paires d’Osx^Cre de 4 semaines, OSX^Cre ; R26^dn/+ et OSX^Cre ; Souris^{R26 dn/dn} . Euthanasier individuellement les souris par l’administration d’asphyxie au dioxyde de carbone.
   REMARQUE : Pour assurer une euthanasie efficace, le débit de CO₂ doit être ajusté pour déplacer environ 30 % du volume de la cage chaque minute. Par exemple, dans une cage de 45 cm x 30 cm x 30 cm, un débit de 40 L/min est recommandé.
2. Coupez le cou de la souris avec des ciseaux tout en tenant son corps, en laissant le crâne intact.
   REMARQUE : Pour obtenir un crâne complet, ouvrez la bouche de la souris, coupez le long du coin de la bouche avec des ciseaux ophtalmiques, tirez les deux mains des deux côtés et tournez pour peler la peau de la tête de la souris.
3. Immergez les crânes de souris dans du paraformaldéhyde à 4 % pendant 48 h, puis stockez-les dans de l’éthanol à 70 %.
   ATTENTION : Le paraformaldéhyde est toxique ; porter une protection appropriée.
4. Scanner les crânes collectés à l’aide d’un scanner microCT - résolution : 4,5 μm ; tension : 70 kV ; courant : 114 μA ; filtre : 0,5 mm Al ; pas de rotation : 0,5°.
5. Stockez les images de tomodensitométrie. Les images au format DICOM sont sélectionnées pour être importées dans le logiciel et analysées.

3. Imagerie MicroCT et reconstruction 3D

REMARQUE : Tous les os utilisés dans cette étude ont été segmentés manuellement.

1. Cliquez avec le bouton droit de la souris sur la page MASQUES et sélectionnez Nouveau masque ; une nouvelle couche nommée Vert apparaît.
2. Sélectionnez la plage de seuil de 671 à 2 566 dans la page Seuillage qui s’affiche. Répétez ce processus pour toutes les couches associées. (Figure 1A).
3. Utilisez l’outil Gomme du menu Edition pour effacer manuellement les os attachés à la mandibule dans chaque couche du plan sagittal 2D (Figure 1B).
4. Sélectionnez la région de la mandibule sur le plan sagittal 2D après avoir cliqué sur l’option Croissance de la région (Figure 1C).
   ATTENTION : Assurez-vous que la région mandibulaire est complètement sélectionnée dans chaque couche ; Sinon, cela se traduira par une mandibule incomplète après reconstruction.
5. Cliquez sur la mandibule du calque nouvellement créé dans la page MASQUES et sélectionnez Calculer 3D dans le menu déroulant (Figure 1D).
6. Dans l’interface des objets 3D , cliquez avec le bouton droit de la souris sur Mandibule , puis cliquez sur Propriétés. Cliquez pour changer de couleur. Code couleur tous les modèles 3D reconstruits avec différents os.
7. Cliquez sur Mesurer dans le coin supérieur gauche et sélectionnez la distance dans le menu déroulant qui apparaît. Calculez la longueur en marquant des points dans l’image 3D (Figure 1E).
   ATTENTION : La référence pour la mesure de la largeur de l’os est la partie la plus large de l’os.
8. Dans l’interface des objets 3D , cliquez avec le bouton droit de la souris sur Mandibule , puis cliquez sur Propriétés. Module Properties-Info-Volume pour lire les valeurs de volume reconstruites pour chaque bloc osseux cranio-maxillo-facial. (Figure 1F).
9. Mesurez la mandibule, l’os frontal, l’os pariétal, l’os nasal, le prémaxillaire, le maxillaire, l’os interpariétal et l’os occipital de la même manière que ci-dessus et marquez-les individuellement avec des couleurs différentes.

4. Analyse statistique

1. Effectuer des analyses statistiques à l’aide du logiciel de votre choix. Effectuez des tests t de Student bilatéraux (n = 4/groupe).
2. Pour tous les graphiques, utilisez des barres d’erreur pour représenter les écarts-types. Considérez que les valeurs P < 0,05 sont statistiquement significatives.

Résultats

Des recherches approfondies soulignent l’impact multiforme des mutations génétiques sur la croissance, le développement et les systèmes organiques de la souris. Une évaluation complète des os craniofaciaux chez les souris mutantes nécessite des méthodes allant au-delà de l’analyse de tissus uniques ou d’images 2D en raison de leurs limites. Par conséquent, l’élucidation du développement de l’os craniofacial revêt une importance prim...

Discussion

MicroCT est un outil puissant pour obtenir des informations 3D réalistes et isotropes à partir d’échantillons biologiques denses et opaques avec une résolution micrométrique. Les données obtenues à partir de la microCT sont calibrées en fonction de la géométrie et de l’intensité, ce qui les rend particulièrement utiles pour les études quantitatives 13,14,15,16,17.

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
GraphPad Prism 6.01 Software	GraphPad Software Inc., La Jolla, CA, USA	/
Micro-CT	Quantum GX micro CT, PerkinElmer, Waltham, MA, USA	/
Mimics Medical 19.0	Materialise, Leuven, Belgium	/
Osterix-Cre (OsxCre)	/	/	from the Jackson Laboratory
Rosa26-loxp-stop-loxp-dnRARα403 strain	/	/	from the Columbia University, USA