JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

В этой статье мы подробно описываем метод, основанный на микрокомпьютерной томографии, для сегментации и измерения 3D-моделей черепно-челюстно-лицевых костей у мышей для лучшей оценки развития черепно-челюстно-лицевых костей у мышей, чем это возможно с помощью современных методов.

Аннотация

Для моделирования черепно-лицевых мальформаций, вызванных дефицитом витамина А (ВАД), мы экспрессировали доминантно-негативную мутацию рецептора ретиноида в остеобластах, чтобы специфически ингибировать транскрипционную активность RAR у мышей. Такой подход позволил нам исследовать влияние ВАД на гипоминерализацию черепа, деформацию нижней челюсти и гипоплазию ключичной мышцы в клинических случаях. В этом исследовании микрокомпьютерная томография (микрокомпьютерная томография) черепно-челюстно-лицевой области мышей представляла собой ценный инструмент для изучения роста и развития этой животной модели. Ручная оценка изображений отнимает много времени и неточна. Таким образом, здесь мы представляем прямолинейный, эффективный и точный подход к сегментации и количественной оценке микрокомпьютерных изображений каждой черепно-челюстно-лицевой кости. Программное обеспечение MicroCT использовалось для разрезания нижней челюсти, лобной кости, теменной кости, носовой кости, предчелюстной кости, верхней челюсти, межтеменной кости и затылочной кости мышей и измерения их соответствующей длины и ширины. Этот метод сегментации может быть применен для изучения роста и развития в биологии развития, биомедицине и других смежных науках и позволяет исследователям анализировать влияние генетических мутаций на отдельные черепно-лицевые кости.

Введение

Сложное развитие человеческого черепа и лица включает в себя сложный трехмерный морфогенетический процесс, искусно управляемый многочисленными генами. Эти гены играют ключевую роль в регулировании сложных структур, пролиферации и дифференцировки тканей, полученных из различных эмбриональных источников. Этот высоко скоординированный процесс подчеркивает сложность роста и развития черепно-лицевой области человека. Черепно-лицевые пороки развития (включая расщелину губы и неба, смыкание черепного шва и гипоплазию лица), возникающие в результате аномалий развития, составляют более трети всех врожденных дефектов. Будучи широко используемым модельным животным в биомедицинских исследованиях, мышь имеет сложную и тонкую черепно-челюстно-лицевую костную структуру, которая очень похожа на черепно-челюстно-лицевую кость человека с точки зрения анатомии и физиологии. В последние годы изучение черепно-челюстно-лицевой биологии развития продвинулось далеко вперед с появлением новых методов в генетике мышей, особенно при пороках развития1.

Ретиноевая кислота (РА) является метаболитом витамина А2 in vivo. Дефицит витамина А (ВАД) связан с рядом серьезных мультисистемных нарушений, таких как плохое ремоделирование костей, переломы, а также черепно-лицевые мальформации и скелетные пороки развития, характеризующиеся карликовостью 3,4. Ретиноидные рецепторы (RARs) являются важнейшими факторами транскрипции в передаче сигналов ретиноидов5. Был разработан доминантно-негативный мутант RARα403 (dnRARα) 6 и установлена мышиная модель, в которой остеобласты экспрессировали dnRARα. Это привело к тому, что у мышей проявилась карликовость, черепно-лицевые деформации, неполное формирование кортикальной кости и увеличенная, но плохо ремоделируемая трабекулярная кость.

Микрокомпьютерная томография (микрокомпьютерная томография) обладает большим потенциалом для изучения черепно-челюстно-лицевых мальформаций. Он обладает способностью обнаруживать и отслеживать эволюцию как врожденных, так и приобретенных скелетных аномалий в моделях грызунов. Анализ микрокомпьютерной томографии предлагает углубленное изучение нарушений черепно-лицевого роста в генетически модифицированных моделях мышей 7,8 . Кроме того, 3D-визуализация становится жизненно важным инструментом для определения морфологических признаков, облегчая индивидуальный анализ и подходы к визуализации9. Микрокомпьютерная томография использовалась в нескольких исследованиях для анализа черепно-лицевых фенотипов, включая определение анатомических ориентиров у людей и мышей и объемный анализ каждой черепно-лицевой кости 10,11,12. В этой статье мы подробно опишем метод, основанный на технологии микрокомпьютерной томографии для разделения и измерения 3D-моделей черепно-челюстно-лицевых костей мыши, чтобы обеспечить лучшую оценку и анализ развития черепно-челюстно-лицевого скелета мыши, чем это возможно при использовании современных методов.

протокол

Мы соблюдаем все соответствующие этические нормы в отношении испытаний и исследований на животных. Все процедуры на экспериментальных животных были одобрены Институциональным консультативным комитетом по уходу за животными и исследованиям Шанхайской девятой народной больницы, Школа медицины Шанхайского университета Цзяотун.

Оба штамма мышей Rosa26-loxp-stop-loxp-dnRARα403 (R26dn/dn) и Osterix-Cre (OsxCre) (No.006361), использованные здесь, поддерживались на фоне C57BL/6. Мыши R26dn/dn были скрещены с мышами OsxCre для получения OSXCre; Мыши R26dn/dn . Все мыши разводились и содержались в специфических условиях, свободных от патогенов (SPF).

1. Разведение мышей

ПРИМЕЧАНИЕ: F означает количество поколений мышей; N означает количество поколений спаривания между зиготическими мышами и фоновыми мышами. Таким образом, F2+N представляет собой второе поколение, а также любые последующие программы разведения мышей. F0 означает первичных мышей.

  1. Соедините половозрелого самца мыши с парой самок мышей сопоставимого возраста. Начинайте ежедневные осмотры новорожденных щенков после начального периода в 18 дней. При выявлении беременных самок изолируйте их, если это необходимо, чтобы обеспечить оптимальный уход за матерью. В случае, если в течение месяца после первоначального спаривания не наблюдается ни одной беременности, рассмотрите возможность чередования самцов мышей в различных условиях разведения, чтобы способствовать оплодотворению.
  2. Скрещивание мышейR26 dn/dnс мышами OSXCre (F0). Подрежьте хвосты для генотипирования и оставьте самца OSX Cre; R26dn/+мыши в клетках до половой зрелости, что составляет ~6 недель (F1).
  3. Кросс шестинедельного кобеля OSXCre; R26dn/+мыши с самками мышей R26dn/dn(F2). Обрезайте хвосты для генотипирования и заменяйте старых племенных мышей молодыми мышами со временем (F2+N).

2. Подготовка

  1. Подготовьте четыре пары 4-недельных OsxCre, OSXCre; R26dn/+ и OSXCre; Мыши R26dn/dn . Индивидуально усыпляйте мышей путем введения удушения углекислым газом.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для обеспечения эффективной эвтаназии скорость потокаCO2 должна быть отрегулирована таким образом, чтобы вытеснять примерно 30% объема клетки каждую минуту. Например, в клетке размером 45 см x 30 см x 30 см рекомендуется расход 40 л/мин.
  2. Разрежьте ножницами шею мыши, придерживая ее тело, оставив череп нетронутым.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы получить полный череп, откройте рот мыши, разрежьте вдоль угла рта офтальмологическими ножницами, потяните обе руки в обе стороны и вращайте, чтобы снять кожу с головы мыши.
  3. Погрузите мышиные черепа в 4% параформальдегид на 48 часов, затем храните их в 70% этаноле.
    ВНИМАНИЕ: Параформальдегид токсичен; носить соответствующую защиту.
  4. Отсканируйте собранные черепа с помощью микрокомпьютерного томографа - разрешение: 4,5 мкм; напряжение: 70 кВ; ток: 114 мкА; фильтр: 0,5 мм Al; шаг вращения: 0,5°.
  5. Храните снимки компьютерной томографии. Изображения в формате DICOM отбираются для импорта в программу и анализируются.

3. Микрокомпьютерная томография и 3D-реконструкция

Примечание: Все кости, использованные в этом исследовании, были сегментированы вручную.

  1. Нажмите правую кнопку мыши на странице МАСКИ и выберите Новая маска; появится новый слой с именем Green .
  2. Выберите диапазон пороговых значений 671-2,566 на всплывающей странице Пороговые значения . Повторите этот процесс для всех связанных слоев. (Рисунок 1А).
  3. Используйте инструмент «Ластик» в меню «Правка», чтобы вручную стереть кости, прикрепленные к нижней челюсти в каждом слое на 2D-сагиттальной плоскости (рис. 1B).
  4. Выберите область нижней челюсти на 2D сагиттальной плоскости после нажатия на опцию «Растущая область » (рисунок 1C).
    ВНИМАНИЕ: Убедитесь, что нижняя челюсть полностью выбрана в каждом слое; В противном случае это приведет к неполной нижней челюсти после реконструкции.
  5. Нажмите на только что созданный слой Mandible на странице МАСКИ и выберите Рассчитать 3D из выпадающего меню (Рисунок 1D).
  6. В интерфейсе 3D-объектов щелкните правой кнопкой мыши на Mandible и выберите Свойства. Нажмите, чтобы изменить Цвет. Цветовая кодировка всех 3D-моделей, реконструированных с разными костями.
  7. Нажмите на кнопку «Измерить » в левом верхнем углу и выберите расстояние в появившемся выпадающем меню. Рассчитайте длину , отметив точки на 3D-изображении (рис. 1E).
    ВНИМАНИЕ: Ориентиром для измерения ширины кости является самая широкая часть кости.
  8. В интерфейсе 3D-объектов щелкните правой кнопкой мыши на Mandible и выберите команду Свойства. Модуль Свойства-Информация-Объем для чтения восстановленных значений объема для каждого блока черепно-челюстно-лицевой кости. (Рисунок 1F).
  9. Измерьте нижнюю челюсть, лобную кость, теменную кость, носовую кость, предчелюстную кость, верхнюю челюсть, межтеменную кость и затылочную кость таким же образом, как указано выше, и отметьте их по отдельности разными цветами.

4. Статистический анализ

  1. Выполняйте статистический анализ с помощью выбранного программного обеспечения. Выполните двусторонний t-критерий Стьюдента (n = 4/группа).
  2. Для всех графиков используйте полосы погрешностей для представления стандартных отклонений. Рассмотрим P-значения < 0,05 статистически значимыми.

Результаты

Обширные исследования подчеркивают многогранное влияние генетических мутаций на рост, развитие и системы органов мышей. Всесторонняя оценка черепно-лицевых костей у мутантных мышей требует методов, выходящих за рамки анализа одной ткани или 2D-изоб...

Обсуждение

MicroCT является мощным инструментом для получения реалистичной и изотропной 3D-информации из плотных и непрозрачных биологических образцов с микрометровым разрешением. Данные, полученные с помощью микрокомпьютерной томографии, калибруются по геометрии и интенсивност...

Раскрытие информации

У авторов нет конфликта интересов, который можно было бы раскрыть.

Благодарности

Эта работа была частично поддержана грантами Фонда естественных наук провинции Хайнань в Китае (824MS152).

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
GraphPad Prism 6.01 SoftwareGraphPad Software Inc., La Jolla, CA, USA/
Micro-CTQuantum GX micro CT, PerkinElmer,
Waltham, MA, USA		/
Mimics Medical 19.0 Materialise, Leuven, Belgium/
Osterix-Cre (OsxCre) //from the Jackson Laboratory
Rosa26-loxp-stop-loxp-dnRARα403 strain//from the Columbia University, USA

Ссылки

  1. Chai, Y., Maxson, R. E. Recent advances in craniofacial morphogenesis. Dev Dyn. 235 (9), 2353-2375 (2006).
  2. Mason, J. B., et al. Should universal distribution of high dose vitamin A to children cease. BMJ. 360, k927 (2018).
  3. Roulier, S., Rochette-Egly, C., Rebut-Bonneton, C., Porquet, D., Evain-Brion, D. Nuclear retinoic acid receptor characterization in cultured human trophoblast cells: Effect of retinoic acid on epidermal growth factor receptor expression. Mol Cell Endocrinol. 105 (2), 165-173 (1994).
  4. Hayes, K. C., Cousins, R. J. Vitamin A deficiency and bone growth. I. Altered drift patterns. Calcif Tissue Res. 6 (2), 120-132 (1970).
  5. Ghyselinck, N. B., Duester, G. Retinoic acid signaling pathways. Development. 146 (13), dev167502 (2019).
  6. Damm, K., Heyman, R. A., Umesono, K., Evans, R. M. Functional inhibition of retinoic acid response by dominant negative retinoic acid receptor mutants. Proc Natl Acad Sci U S A. 90 (7), 2989-2993 (1993).
  7. Ford-Hutchinson, A. F., Cooper, D. M., Hallgrímsson, B., Jirik, F. R. Imaging skeletal pathology in mutant mice by microcomputed tomography. J Rheumatol. 30 (12), 2659-2665 (2003).
  8. Brewer, S., Feng, W., Huang, J., Sullivan, S., Williams, T. Wnt1-cre-mediated deletion of ap-2alpha causes multiple neural crest-related defects. Dev Biol. 267 (1), 135-152 (2004).
  9. Wong, M. D., Dorr, A. E., Walls, J. R., Lerch, J. P., Henkelman, R. M. A novel 3d mouse embryo atlas based on micro-ct. Development. 139 (17), 3248-3256 (2012).
  10. Motch Perrine, S. M., et al. Craniofacial divergence by distinct prenatal growth patterns in fgfr2 mutant mice. BMC Dev Biol. 14, 8 (2014).
  11. Percival, C. J., Huang, Y., Jabs, E. W., Li, R., Richtsmeier, J. T. Embryonic craniofacial bone volume and bone mineral density in fgfr2(+/p253r) and nonmutant mice. Dev Dyn. 243 (4), 541-551 (2014).
  12. Titiz, I., Laubinger, M., Keller, T., Hertrich, K., Hirschfelder, U. Repeatability and reproducibility of landmarks--a three-dimensional computed tomography study. Eur J Orthod. 34 (3), 276-286 (2012).
  13. Mizutani, R., Suzuki, Y. X-ray microtomography in biology. Micron. 43 (2-3), 104-115 (2012).
  14. Salomé, M., et al. A synchrotron radiation microtomography system for the analysis of trabecular bone samples. Med Phys. 26 (10), 2194-2204 (1999).
  15. Mizutani, R., et al. Three-dimensional microtomographic imaging of human brain cortex. Brain Res. 1199, 53-61 (2008).
  16. De Crespigny, A., et al. 3D micro-CT imaging of the postmortem brain. J Neurosci Methods. 171 (2), 207-213 (2008).
  17. Johnson, J. T., et al. Virtual histology of transgenic mouse embryos for high-throughput phenotyping. PLoS Genet. 2 (4), e61 (2006).
  18. Zou, W., Hunter, N., Swain, M. V. Application of polychromatic µct for mineral density determination. J Dent Res. 90 (1), 18-30 (2011).
  19. Neues, F., Epple, M. X-ray microcomputer tomography for the study of biomineralized endo- and exoskeletons of animals. Chem Rev. 108 (11), 4734-4741 (2008).
  20. Gabner, S., Böck, P., Fink, D., Glösmann, M., Handschuh, S. The visible skeleton 2.0: Phenotyping of cartilage and bone in fixed vertebrate embryos and foetuses based on x-ray microCT. Development. 147 (11), dev187633 (2020).
  21. Ermakova, O., Orsini, T., Gambadoro, A., Chiani, F., Tocchini-Valentini, G. P. Three-dimensional microCT imaging of murine embryonic development from immediate post-implantation to organogenesis: Application for phenotyping analysis of early embryonic lethality in mutant animals. Mamm Genome. 29 (3-4), 245-259 (2018).
  22. Wong, M. D., Maezawa, Y., Lerch, J. P., Henkelman, R. M. Automated pipeline for anatomical phenotyping of mouse embryos using micro-ct. Development. 141 (12), 2533-2541 (2014).
  23. Rajion, Z. A., et al. A three-dimensional computed tomographic analysis of the cervical spine in unoperated infants with cleft lip and palate. Cleft Palate Craniofac J. 43 (5), 513-518 (2006).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

215

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены