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要約

ここでは、マイクロコンピューター断層撮影法に基づく方法で、マウスの頭蓋顎顔面骨の3Dモデルをセグメント化して測定する方法について詳しく説明します。これにより、現在の方法よりもマウスの頭蓋顎顔面骨の発達をより適切に評価できます。

要約

ビタミンA欠乏症(VAD)による頭蓋顔面奇形をモデル化するために、骨芽細胞のドミナントネガティブレチノイド受容体変異を発現させ、マウスのRAR転写活性を特異的に阻害しました。このアプローチにより、臨床例における頭蓋低石灰化、下顎変形、鎖骨形成不全に対するVADの影響を調査することができました。この研究では、マウスの頭蓋顎顔面領域のマイクロコンピューター断層撮影(microCT)スキャンは、この動物モデルの成長と発達を研究するための貴重なツールでした。画像の手動推定は、時間がかかり、不正確です。したがって、ここでは、各頭蓋顎顔面骨のマイクロCT画像をセグメント化および定量化するための、簡単で効率的かつ正確なアプローチを紹介します。MicroCTソフトウェアを使用して、マウスの下顎骨、前頭骨、頭頂骨、鼻骨、前顎骨、上顎骨、頭頂間骨、および後頭骨をスライスし、それらに対応する長さと幅を測定しました。このセグメンテーション手法は、発生生物学、生物医学、およびその他の関連科学の成長と発達の研究に適用でき、研究者は個々の頭蓋顔面骨に対する遺伝子変異の影響を分析できます。

概要

人間の頭蓋骨と顔の複雑な発達には、多数の遺伝子によって複雑に調整された洗練された3D形態形成プロセスが含まれています。これらの遺伝子は、多様な胚源に由来する組織の複雑なパターン、増殖、および分化を調節する上で極めて重要な役割を果たします。この高度に調整されたプロセスは、ヒトの頭蓋顔面の成長と発達の複雑さを強調しています。発達異常の結果として発生する頭蓋顔面奇形(口唇口蓋裂、頭蓋縫合閉鎖、顔面形成不全など)は、すべての先天性先天性欠損症の3分の1以上を占めています。生物医学研究で一般的に使用されるモデル動物として、マウスは複雑で繊細な頭蓋顎顔面骨構造を持ち、解剖学的および生理学的にヒトの頭蓋顎顔面骨と非常によく似ています。頭蓋顎顔面発生生物学の研究は、マウス遺伝学、特に奇形1における新しい技術の出現により、近年長い道のりを歩んできました。

レチノイン酸(RA)は、ビタミンA2の生体内代謝産物です。ビタミンA欠乏症(VAD)は、骨のリモデリング不良、骨折、小人症を特徴とする頭蓋顔面奇形や骨格奇形など、さまざまな深刻な多系統障害に関連しています3,4。レチノイド受容体(RAR)は、レチノイドシグナル伝達における重要な転写因子です5。ドミナントネガティブRARα403変異体(dnRARα)を設計し6、骨芽細胞がdnRARαを発現するマウスモデルを確立しました。その結果、マウスは小人症、頭蓋顔面奇形、不完全な皮質骨形成、および増加したがリモデリングが不十分な海綿骨を示しました。

マイクロコンピューター断層撮影法(microCT)は、頭蓋顎顔面奇形の研究に大きな可能性を秘めています。これは、げっ歯類モデルの先天的および後天的な骨格異常の両方の進化を検出し、追跡する能力を持っています。MicroCTイメージング解析は、遺伝子改変マウスモデル7,8における頭蓋顔面成長障害の詳細な調査を提供します。さらに、3Dイメージングは、形態学的形質を描写するための重要なツールとして浮上しており、カスタマイズされた分析と視覚化アプローチを促進します9。マイクロCTは、ヒトやマウスの解剖学的ランドマークの定義や各頭蓋顔面骨の体積分析など、頭蓋顔面の表現型を分析するためにいくつかの研究で使用されています10,11,12。ここでは、マイクロCT技術に基づいてマウス頭蓋顎顔面骨の3Dモデルを分離および測定する方法について詳しく説明します。これにより、現在の方法よりも優れたマウス頭蓋顎顔面骨格の発達の評価と分析が可能になります。

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プロトコル

私たちは、動物実験および動物研究に関連するすべての倫理規定を遵守しています。すべての実験動物の手順は、上海交通大学医学部上海第九人民病院の動物管理および研究諮問委員会によって承認されました。

ここで使用したマウスのRosa26-loxp-stop-loxp-dnRARα403系統(R26dn/dn)とOsterix-Cre(OsxCre)(No.006361)は、C57BL/6をバックグラウンドで維持した。 R26dn/dn マウスを OsxCre マウスと交配して OSXCreを生成しました。R26dn/dn マウス。すべてのマウスは、特定の病原体フリー(SPF)条件下で飼育および維持されました。

1.マウスの繁殖

注:Fはマウスの世代数を意味します。Nは、接合子マウスとバックグラウンドマウスの交配の世代数を意味します。したがって、F2+Nは、第2世代とその後のマウス育種プログラムを表します。F0 はプライマリ マウスを意味します。

  1. 性的に成熟したオスのマウスと、同等の年齢のメスのマウスのペアをペアにします。新生児の子犬の毎日の検査を、最初の18日後に開始します。妊娠中の女性を特定したら、必要に応じて隔離して、最適な母親のケアを確保します。最初のペアリングから1か月以内に妊娠が観察されない場合は、受精を促進するために、異なる繁殖セットアップ間でオスのマウスを交互にすることを検討します。
  2. R26dn/dnマウスとOSXCreマウス(F0)を交配します。ジェノタイピングのために尾をクリップし、オスのOSXCreを保持します。R26dn/+マウスは、性的に成熟するまでケージに入れ、~6週齢(F1)までケージに入れます。
  3. クロス生後6週間のオス OSXCre;R26dn/+マウスと雌のR26dn/dnマウス(F2)。ジェノタイピングのために尾部をクリップし、古い繁殖マウスを時間内に若いマウスと交換します(F2 + N)。

2. 事前準備

  1. 4週齢の OsxCre、OSXCreの4組を準備します。R26dn/+、 および OSXCre;R26dn/dn マウス。二酸化炭素窒息の投与により、マウスを個別に安楽死させます。
    注:効率的な安楽死を確保するために、CO2 の流量は、毎分ケージの体積の約30%を変位するように調整する必要があります。例えば、45 cm x 30 cm x 30 cmのケージでは、40 L/minの流量が推奨されます。
  2. マウスの首をハサミで切り、体を持って頭蓋骨をそのままにします。
    注:完全な頭蓋骨を得るには、マウスの口を開き、眼科用ハサミで口角に沿って切り、両手を両側に引っ張り、回転させてマウスの頭の皮膚をはがします。
  3. マウスの頭蓋骨を4%パラホルムアルデヒドに48時間浸し、70%エタノールで保存します。
    注意:パラホルムアルデヒドは有毒です。適切な保護具を着用してください。
  4. マイクロCTスキャナーで採取した頭蓋骨をスキャン- 分解能:4.5μm、電圧:70kV、電流:114μA、フィルター:0.5mmAl、回転ステップ:0.5°。
  5. CTスキャン画像を保存します。DICOM形式の画像を選択してソフトウェアにインポートし、分析します。

3. マイクロCTイメージングと3D再構成

注: この研究で使用されたすべての骨は、手動でセグメント化されました。

  1. MASKsページでマウスの右ボタンをクリックし、[New mask]を選択します。「緑」という名前の新しいレイヤーが表示されます。
  2. ポップアップ表示される [しきい値処理 ] ページで、しきい値範囲 671 から 2,566 を選択します。関連するすべてのレイヤーに対してこのプロセスを繰り返します。(図1A)。
  3. [編集]メニューの[消しゴム]ツールを使用して、2D矢状面上の各レイヤーの下顎骨にアタッチされたボーンを手動で消去します(図1B)。
  4. Region Growingオプションをクリックした後、2D矢状面上の下顎骨の領域を選択します(図1C)。
    注意: 下顎領域が各レイヤーで完全に選択されていることを確認してください。そうしないと、再建後に下顎骨が不完全になります。
  5. MASKSページで新しく作成したレイヤーMandibleをクリックし、ドロップダウンメニューから3D計算を選択します(図1D)。
  6. 3Dオブジェクトインターフェースで、Mandibleを右クリックし、プロパティをクリックします。クリックして色を変更します。すべての3Dモデルを異なるボーンで再構築して色分けします。
  7. 左上隅にある [測定 ]をクリックし、表示されるドロップダウンメニューから 距離 を選択します。3D画像内のポイントをマークして 長さ を計算します(図1E)。
    注意: 骨の幅を測定するための基準は、骨の最も幅の広い部分です。
  8. 3Dオブジェクトインターフェースで、Mandibleを右クリックし、プロパティをクリックします。Properties-Info-Volume モジュールを使用して、各頭蓋顎顔面骨ブロックの再構築されたボリューム値を読み取ります。(図1F)。
  9. 下顎骨、前頭骨、頭頂骨、鼻骨、上顎前骨、上顎骨、頭頂間骨、後頭骨を上記と同様に測定し、それぞれ異なる色で印をつけます。

4. 統計解析

  1. 選択したソフトウェアを使用して統計解析を実行します。両側スチューデントの t検定(n = 4/グループ)を実行します。
  2. すべてのグラフで、エラーバーを使用して標準偏差を表します。0.05< p値を統計的に有意とみなします。

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結果

広範な研究は、遺伝子変異がマウスの成長、発達、および臓器系に及ぼす多面的な影響を強調しています。変異マウスの頭蓋顔面骨を包括的に評価するには、その制限により、単一組織または2D画像解析を超える方法が必要です。したがって、頭蓋顔面骨の発達を解明することは、ヒトの頭蓋顔面疾患を研究する上で最も重要です。

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ディスカッション

MicroCTは、マイクロメートルの分解能で高密度および不透明な生体サンプルから現実的で等方的な3D情報を取得するための強力なツールです。マイクロCTから得られたデータは、形状と強度について較正されているため、定量研究13,14,15,16,17に特に有用です。

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開示事項

著者には、開示すべき利益相反はありません。

謝辞

この研究は、中国海南省自然科学基金会(824MS152)からの助成金によって部分的に支援されました。

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資料

NameCompanyCatalog NumberComments
GraphPad Prism 6.01 SoftwareGraphPad Software Inc., La Jolla, CA, USA/
Micro-CTQuantum GX micro CT, PerkinElmer,
Waltham, MA, USA		/
Mimics Medical 19.0 Materialise, Leuven, Belgium/
Osterix-Cre (OsxCre) //from the Jackson Laboratory
Rosa26-loxp-stop-loxp-dnRARα403 strain//from the Columbia University, USA

参考文献

  1. Chai, Y., Maxson, R. E. Jr Recent advances in craniofacial morphogenesis. Dev Dyn. 235 (9), 2353-2375 (2006).
  2. Mason, J. B., et al. Should universal distribution of high dose vitamin A to children cease. BMJ. 360, k927(2018).
  3. Roulier, S., Rochette-Egly, C., Rebut-Bonneton, C., Porquet, D., Evain-Brion, D. Nuclear retinoic acid receptor characterization in cultured human trophoblast cells: Effect of retinoic acid on epidermal growth factor receptor expression. Mol Cell Endocrinol. 105 (2), 165-173 (1994).
  4. Hayes, K. C., Cousins, R. J. Vitamin A deficiency and bone growth. I. Altered drift patterns. Calcif Tissue Res. 6 (2), 120-132 (1970).
  5. Ghyselinck, N. B., Duester, G. Retinoic acid signaling pathways. Development. 146 (13), dev167502(2019).
  6. Damm, K., Heyman, R. A., Umesono, K., Evans, R. M. Functional inhibition of retinoic acid response by dominant negative retinoic acid receptor mutants. Proc Natl Acad Sci U S A. 90 (7), 2989-2993 (1993).
  7. Ford-Hutchinson, A. F., Cooper, D. M., Hallgrímsson, B., Jirik, F. R. Imaging skeletal pathology in mutant mice by microcomputed tomography. J Rheumatol. 30 (12), 2659-2665 (2003).
  8. Brewer, S., Feng, W., Huang, J., Sullivan, S., Williams, T. Wnt1-cre-mediated deletion of ap-2alpha causes multiple neural crest-related defects. Dev Biol. 267 (1), 135-152 (2004).
  9. Wong, M. D., Dorr, A. E., Walls, J. R., Lerch, J. P., Henkelman, R. M. A novel 3d mouse embryo atlas based on micro-ct. Development. 139 (17), 3248-3256 (2012).
  10. Motch Perrine, S. M., et al. Craniofacial divergence by distinct prenatal growth patterns in fgfr2 mutant mice. BMC Dev Biol. 14, 8(2014).
  11. Percival, C. J., Huang, Y., Jabs, E. W., Li, R., Richtsmeier, J. T. Embryonic craniofacial bone volume and bone mineral density in fgfr2(+/p253r) and nonmutant mice. Dev Dyn. 243 (4), 541-551 (2014).
  12. Titiz, I., Laubinger, M., Keller, T., Hertrich, K., Hirschfelder, U. Repeatability and reproducibility of landmarks--a three-dimensional computed tomography study. Eur J Orthod. 34 (3), 276-286 (2012).
  13. Mizutani, R., Suzuki, Y. X-ray microtomography in biology. Micron. 43 (2-3), 104-115 (2012).
  14. Salomé, M., et al. A synchrotron radiation microtomography system for the analysis of trabecular bone samples. Med Phys. 26 (10), 2194-2204 (1999).
  15. Mizutani, R., et al. Three-dimensional microtomographic imaging of human brain cortex. Brain Res. 1199, 53-61 (2008).
  16. De Crespigny, A., et al. 3D micro-CT imaging of the postmortem brain. J Neurosci Methods. 171 (2), 207-213 (2008).
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  20. Gabner, S., Böck, P., Fink, D., Glösmann, M., Handschuh, S. The visible skeleton 2.0: Phenotyping of cartilage and bone in fixed vertebrate embryos and foetuses based on x-ray microCT. Development. 147 (11), dev187633(2020).
  21. Ermakova, O., Orsini, T., Gambadoro, A., Chiani, F., Tocchini-Valentini, G. P. Three-dimensional microCT imaging of murine embryonic development from immediate post-implantation to organogenesis: Application for phenotyping analysis of early embryonic lethality in mutant animals. Mamm Genome. 29 (3-4), 245-259 (2018).
  22. Wong, M. D., Maezawa, Y., Lerch, J. P., Henkelman, R. M. Automated pipeline for anatomical phenotyping of mouse embryos using micro-ct. Development. 141 (12), 2533-2541 (2014).
  23. Rajion, Z. A., et al. A three-dimensional computed tomographic analysis of the cervical spine in unoperated infants with cleft lip and palate. Cleft Palate Craniofac J. 43 (5), 513-518 (2006).

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