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요약

여기에서는 마이크로컴퓨터 단층촬영을 기반으로 하는 방법을 자세히 설명하여 마우스의 두개악안면뼈의 3D 모델을 분할하고 측정하여 현재 방법으로 가능한 것보다 마우스의 두개악안면뼈 발달을 더 잘 평가할 수 있습니다.

초록

비타민 A 결핍증(VAD)으로 인한 두개안면 기형을 모델링하기 위해 조골세포에서 우성-음성 레티노이드 수용체 돌연변이를 발현하여 마우스의 RAR 전사 활성을 특이적으로 억제했습니다. 이 접근법을 통해 임상 사례에서 VAD가 두개골 저광물화, 하악 기형 및 쇄골 형성 부전증에 미치는 영향을 조사할 수 있었습니다. 이 연구에서 생쥐의 두개악안면 영역에 대한 마이크로컴퓨터 단층촬영(microCT) 스캔은 이 동물 모델의 성장과 발달을 연구하는 데 유용한 도구였습니다. 이미지를 수동으로 추정하는 것은 시간이 많이 걸리고 부정확합니다. 따라서 여기에서는 각 두개악안면뼈의 microCT 이미지를 분할하고 정량화하기 위한 간단하고 효율적이며 정확한 접근 방식을 제시합니다. MicroCT 소프트웨어를 사용하여 마우스의 하악골, 전두골, 두정골, 코뼈, 전악골, 상악골, 두정골 및 후두골을 절단하고 해당 길이와 너비를 측정했습니다. 이 세분화 방법은 발달 생물학, 생물 의학 및 기타 관련 과학의 성장 및 발달을 연구하는 데 적용할 수 있으며 연구자들은 개별 두개안면 뼈에 대한 유전적 돌연변이의 영향을 분석할 수 있습니다.

서문

인간의 두개골과 얼굴의 복잡한 발달은 수많은 유전자에 의해 복잡하게 조정된 정교한 3D 형태 유전 과정을 포함합니다. 이러한 유전자는 다양한 배아 출처에서 파생된 조직의 복잡한 패턴, 증식 및 분화를 조절하는 데 중추적인 역할을 합니다. 이 고도로 조정된 과정은 인간 두개안면 성장 및 발달의 복잡성을 강조합니다. 발달 이상으로 인해 발생하는 두개안면 기형(구순구개열, 두개골 봉합사 폐쇄, 안면 형성 부전 포함)은 모든 선천적 결함의 1/3 이상을 차지합니다. 생물 의학 연구에서 일반적으로 사용되는 모델 동물인 마우스는 해부학 및 생리학 측면에서 인간의 두개악안면 뼈와 매우 유사한 복잡하고 섬세한 두개악안면 뼈 구조를 가지고 있습니다. 두개악안면 발달 생물학에 대한 연구는 최근 몇 년 동안 마우스 유전학, 특히 기형에 대한 새로운 기술의 출현으로 먼 길을 왔습니다1.

레티노산(RA)은 비타민 A2의 생체 내 대사 산물입니다. 비타민 A 결핍증(VAD)은 뼈 재형성 불량, 골절, 두개안면 기형 및 왜소증을 특징으로 하는 골격 기형과 같은 다양한 심각한 다계통 장애와 관련이 있습니다 3,4 . 레티노이드 수용체(Retinoid receptor, RAR)는 레티노이드 신호전달에서 중요한 전사 인자입니다5. 우성 음성 RARα403 돌연변이(dnRARα)를 설계하고6 조골세포가 dnRARα를 발현하는 마우스 모델을 확립하였다. 이로 인해 생쥐는 왜소증, 두개안면 기형, 불완전한 피질 뼈 형성, 증가했지만 제대로 개조되지 않은 섬유주 뼈를 보였습니다.

마이크로컴퓨터 단층촬영(microCT)은 두개악안면 기형 연구에 큰 잠재력을 가지고 있습니다. 설치류 모델에서 선천적 골격 이상과 후천적 골격 기형의 진화를 감지하고 추적할 수 있는 능력을 가지고 있습니다. MicroCT 이미징 분석은 유전자 변형 마우스 모델의 두개안면 성장 장애에 대한 심층적인 탐구를 제공합니다 7,8 . 또한 3D 이미징은 형태학적 특성을 묘사하는 데 필수적인 도구로 부상하여 맞춤형 분석 및 시각화 접근 방식을 용이하게 합니다9. Micro-CT는 인간과 마우스의 해부학적 랜드마크를 정의하고 각 두개안면 뼈의 체적 분석을 포함하여 두개안면 표현형을 분석하기 위해 여러 연구에서 사용되었습니다 10,11,12. 여기에서는 microCT 기술을 기반으로 마우스 두개악안면 뼈의 3D 모델을 분리 및 측정하여 현재 방법보다 마우스 두개악안면 골격 발달을 더 잘 평가하고 분석할 수 있는 방법을 자세히 설명합니다.

프로토콜

우리는 동물 실험 및 연구에 대한 모든 관련 윤리 규정을 준수하고 있습니다. 모든 실험 동물 절차는 상하이 교통대학교 의과대학 상하이 제9인민병원의 기관 동물 관리 및 연구 자문 위원회의 승인을 받았습니다.

여기에 사용된 마우스의 Rosa26-loxp-stop-loxp-dnRARα403 균주(R26dn/dn) 및 Osterix-Cre (OsxCre) (No.006361) 균주는 모두 C57BL/6 배경에서 유지되었습니다. R26dn / dn 마우스는 OSX Cre를 생성하기 위해 OsxCre 마우스와 교차되었습니다. R26dn/dn 마우스. 모든 마우스는 특정 병원체가 없는(SPF) 조건에서 사육 및 유지되었습니다.

1. 생쥐 사육

참고 : F는 마우스의 세대 수를 의미합니다. N은 접합 마우스와 배경 마우스 사이의 짝짓기 세대 수를 의미합니다. 따라서 F2+N은 2세대와 이후의 마우스 육종 프로그램을 나타냅니다. F0는 기본 마우스를 의미합니다.

  1. 성적으로 성숙한 수컷 쥐를 비슷한 나이의 암컷 쥐 한 쌍과 짝을 지어 줍니다. 초기 18일 후에 갓 태어난 새끼에 대한 일일 검사를 시작하십시오. 임신한 암컷을 확인하면 최적의 산모 관리를 위해 필요한 경우 격리합니다. 초기 짝짓기 후 한 달 이내에 임신이 관찰되지 않는 경우, 수정을 촉진하기 위해 수컷 쥐를 다른 번식 환경에서 번갈아 가며 사용하는 것을 고려하십시오.
  2. 크로스 R26dn / dn마우스OSXCre 마우스 (F0). 유전형 분석을 위해 꼬리를 자르고 수컷 OSXCre를 유지하십시오. R26dn/+생쥐는 성적으로 성숙할 때까지, 즉 생후 ~6주(F1)까지 케이지에 있습니다.
  3. 6 주 된 수컷 OSXCre를 교차시킵니다. 암컷 R26dn/dn마우스가 있는 R26dn/+마우스(F2). 유전형 분석을 위해 꼬리를 자르고 시간이 지나면 오래된 번식 마우스를 더 젊은 마우스로 교체합니다(F2+N).

2. 준비 사항

  1. 4주 된 OsxCre, OSXCre 4켤레를 준비합니다. R26dn/+ 및 OSXCre; R26dn/dn 마우스. 이산화탄소 질식 투여를 통해 생쥐를 개별적으로 안락사시킵니다.
    알림: 효율적인 안락사를 보장하기 위해 CO2 유속은 매분마다 케이지 부피의 약 30%를 대체하도록 조정해야 합니다. 예를 들어, 45cm x 30cm x 30cm 크기의 케이지에서는 40L/min의 유속이 권장됩니다.
  2. 몸체를 잡고 가위로 마우스의 목을 자르고 두개골은 그대로 둡니다.
    알림: 완전한 두개골을 얻으려면 마우스의 입을 벌리고 안과 가위로 입꼬리를 따라 자르고 양손을 양쪽으로 당기고 회전하여 마우스 머리 피부를 벗겨냅니다.
  3. 쥐의 두개골을 4% 파라포름알데히드에 48시간 동안 담근 다음 70% 에탄올에 보관합니다.
    주의: 파라포름알데히드는 독성이 있습니다. 적절한 보호구를 착용하십시오.
  4. 수집된 두개골을 microCT 스캐너로 스캔- 해상도: 4.5 μm; 전압: 70 kV; 전류: 114 μA; 필터: 0.5 mm Al; 회전 단계: 0.5°.
  5. CT 스캔 이미지를 저장합니다. DICOM 형식의 이미지를 선택하여 소프트웨어로 가져오고 분석합니다.

3. MicroCT 이미징 및 3D 재구성

참고: 이 연구에 사용된 모든 뼈는 수동으로 분할되었습니다.

  1. 마스크 페이지에서 마우스 오른쪽 버튼을 클릭하고 새 마스크를 선택합니다. 녹색이라는 새 레이어가 나타납니다.
  2. 팝업되는 Thresholding 페이지에서 임계값 범위인 671-2,566을 선택합니다. 모든 관련 레이어에 대해 이 프로세스를 반복합니다. (그림 1A).
  3. Edit 메뉴의 Eraser 도구를 사용하여 2D 시상면의 각 레이어에서 하악골에 부착된 뼈를 수동으로 지웁니다(그림 1B).
  4. Region Growing 옵션을 클릭한 후 2D 시상면에서 하악골 영역을 선택합니다(그림 1C).
    주의: 하악 영역이 각 레이어에서 완전히 선택되었는지 확인하십시오. 그렇지 않으면 재건 후 불완전한 하악골이 생깁니다.
  5. MASKS 페이지에서 새로 생성된 레이어 Mandible을 클릭하고 드롭다운 메뉴에서 Calculate 3D를 선택합니다(그림 1D).
  6. 3D 개체 인터페이스에서 Mandible을 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하고 Properties를 클릭합니다. 클릭하여 색상을 변경합니다. 색상 코드: 모든 3D 모델은 서로 다른 뼈로 재구성됩니다.
  7. 왼쪽 상단 모서리에 있는 측정을 클릭하고 나타나는 드롭다운 메뉴에서 거리를 선택합니다. 3D 이미지의 점을 표시하여 길이를 계산합니다(그림 1E).
    주의: 뼈 너비를 측정하기 위한 기준은 뼈의 가장 넓은 부분입니다.
  8. 3D 개체 인터페이스에서 Mandible을 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하고 속성을 클릭합니다. Properties-Info-Volume 모듈을 사용하여 각 두개악안면 뼈 블록에 대해 재구성된 볼륨 값을 읽을 수 있습니다. (그림 1F).
  9. 위와 같은 방법으로 하악골, 전두골, 두정골, 코뼈, 전악골, 상악골, 두정골, 후두골을 측정하고 다른 색상으로 개별적으로 표시합니다.

4. 통계 분석

  1. 선택한 소프트웨어를 사용하여 통계 분석을 수행합니다. 양측 스튜던트 t-검정을 수행합니다(n = 4/그룹).
  2. 모든 그래프에 대해 오차 막대를 사용하여 표준 편차를 나타냅니다. P-값이 통계적으로 유의< 0.05라고 가정합니다.

결과

광범위한 연구는 유전자 돌연변이가 마우스의 성장, 발달 및 장기 시스템에 미치는 다면적인 영향을 강조합니다. 돌연변이 마우스의 두개안면 뼈에 대한 포괄적인 평가는 한계로 인해 단일 조직 또는 2D 이미지 분석 이상의 방법이 필요합니다. 따라서 두개안면 뼈 발달을 규명하는 것은 인간의 두개안면 질환을 조사하는 데 가장 중요합니다.

토론

MicroCT는 마이크로미터 해상도의 조밀하고 불투명한 생물학적 샘플에서 사실적인 등방성 3D 정보를 얻을 수 있는 강력한 도구입니다. microCT에서 얻은 데이터는 기하학적 및 강도에 따라 보정되므로 정량적 연구 13,14,15,16,17에 특히 유용합니다. 뼈와 ?...

공개

저자는 공개할 이해 상충이 없습니다.

감사의 말

이 연구는 중국 하이난성 자연과학재단(824MS152)의 보조금으로 부분적으로 지원되었다.

자료

NameCompanyCatalog NumberComments
GraphPad Prism 6.01 SoftwareGraphPad Software Inc., La Jolla, CA, USA/
Micro-CTQuantum GX micro CT, PerkinElmer,
Waltham, MA, USA		/
Mimics Medical 19.0 Materialise, Leuven, Belgium/
Osterix-Cre (OsxCre) //from the Jackson Laboratory
Rosa26-loxp-stop-loxp-dnRARα403 strain//from the Columbia University, USA

참고문헌

  1. Chai, Y., Maxson, R. E. Recent advances in craniofacial morphogenesis. Dev Dyn. 235 (9), 2353-2375 (2006).
  2. Mason, J. B., et al. Should universal distribution of high dose vitamin A to children cease. BMJ. 360, k927 (2018).
  3. Roulier, S., Rochette-Egly, C., Rebut-Bonneton, C., Porquet, D., Evain-Brion, D. Nuclear retinoic acid receptor characterization in cultured human trophoblast cells: Effect of retinoic acid on epidermal growth factor receptor expression. Mol Cell Endocrinol. 105 (2), 165-173 (1994).
  4. Hayes, K. C., Cousins, R. J. Vitamin A deficiency and bone growth. I. Altered drift patterns. Calcif Tissue Res. 6 (2), 120-132 (1970).
  5. Ghyselinck, N. B., Duester, G. Retinoic acid signaling pathways. Development. 146 (13), dev167502 (2019).
  6. Damm, K., Heyman, R. A., Umesono, K., Evans, R. M. Functional inhibition of retinoic acid response by dominant negative retinoic acid receptor mutants. Proc Natl Acad Sci U S A. 90 (7), 2989-2993 (1993).
  7. Ford-Hutchinson, A. F., Cooper, D. M., Hallgrímsson, B., Jirik, F. R. Imaging skeletal pathology in mutant mice by microcomputed tomography. J Rheumatol. 30 (12), 2659-2665 (2003).
  8. Brewer, S., Feng, W., Huang, J., Sullivan, S., Williams, T. Wnt1-cre-mediated deletion of ap-2alpha causes multiple neural crest-related defects. Dev Biol. 267 (1), 135-152 (2004).
  9. Wong, M. D., Dorr, A. E., Walls, J. R., Lerch, J. P., Henkelman, R. M. A novel 3d mouse embryo atlas based on micro-ct. Development. 139 (17), 3248-3256 (2012).
  10. Motch Perrine, S. M., et al. Craniofacial divergence by distinct prenatal growth patterns in fgfr2 mutant mice. BMC Dev Biol. 14, 8 (2014).
  11. Percival, C. J., Huang, Y., Jabs, E. W., Li, R., Richtsmeier, J. T. Embryonic craniofacial bone volume and bone mineral density in fgfr2(+/p253r) and nonmutant mice. Dev Dyn. 243 (4), 541-551 (2014).
  12. Titiz, I., Laubinger, M., Keller, T., Hertrich, K., Hirschfelder, U. Repeatability and reproducibility of landmarks--a three-dimensional computed tomography study. Eur J Orthod. 34 (3), 276-286 (2012).
  13. Mizutani, R., Suzuki, Y. X-ray microtomography in biology. Micron. 43 (2-3), 104-115 (2012).
  14. Salomé, M., et al. A synchrotron radiation microtomography system for the analysis of trabecular bone samples. Med Phys. 26 (10), 2194-2204 (1999).
  15. Mizutani, R., et al. Three-dimensional microtomographic imaging of human brain cortex. Brain Res. 1199, 53-61 (2008).
  16. De Crespigny, A., et al. 3D micro-CT imaging of the postmortem brain. J Neurosci Methods. 171 (2), 207-213 (2008).
  17. Johnson, J. T., et al. Virtual histology of transgenic mouse embryos for high-throughput phenotyping. PLoS Genet. 2 (4), e61 (2006).
  18. Zou, W., Hunter, N., Swain, M. V. Application of polychromatic µct for mineral density determination. J Dent Res. 90 (1), 18-30 (2011).
  19. Neues, F., Epple, M. X-ray microcomputer tomography for the study of biomineralized endo- and exoskeletons of animals. Chem Rev. 108 (11), 4734-4741 (2008).
  20. Gabner, S., Böck, P., Fink, D., Glösmann, M., Handschuh, S. The visible skeleton 2.0: Phenotyping of cartilage and bone in fixed vertebrate embryos and foetuses based on x-ray microCT. Development. 147 (11), dev187633 (2020).
  21. Ermakova, O., Orsini, T., Gambadoro, A., Chiani, F., Tocchini-Valentini, G. P. Three-dimensional microCT imaging of murine embryonic development from immediate post-implantation to organogenesis: Application for phenotyping analysis of early embryonic lethality in mutant animals. Mamm Genome. 29 (3-4), 245-259 (2018).
  22. Wong, M. D., Maezawa, Y., Lerch, J. P., Henkelman, R. M. Automated pipeline for anatomical phenotyping of mouse embryos using micro-ct. Development. 141 (12), 2533-2541 (2014).
  23. Rajion, Z. A., et al. A three-dimensional computed tomographic analysis of the cervical spine in unoperated infants with cleft lip and palate. Cleft Palate Craniofac J. 43 (5), 513-518 (2006).

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