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Resumo

Aqui, descrevemos em profundidade um método, baseado em microtomografia computadorizada, para segmentar e medir modelos 3D de ossos craniomaxilofaciais em camundongos, para melhor avaliação do desenvolvimento ósseo craniomaxilofacial em camundongos do que é possível com os métodos atuais.

Resumo

Para modelar malformações craniofaciais causadas por deficiência de vitamina A (DVA), expressamos uma mutação do receptor retinóide dominante-negativo em osteoblastos para inibir especificamente a atividade transcricional RAR em camundongos. Essa abordagem nos permitiu investigar os efeitos da DVA na hipomineralização craniana, deformidade mandibular e hipoplasia clavicular em casos clínicos. Neste estudo, a tomografia microcomputadorizada (microCT) da região craniomaxilofacial de camundongos representou uma ferramenta valiosa para estudar o crescimento e desenvolvimento desse modelo animal. A estimativa manual de imagens é demorada e imprecisa. Portanto, apresentamos aqui uma abordagem direta, eficiente e precisa para segmentar e quantificar as imagens de microCT de cada osso craniomaxilofacial. O software MicroCT foi usado para cortar a mandíbula, osso frontal, osso parietal, osso nasal, pré-maxila, maxila, osso interparietal e osso occipital de camundongos e medir seus comprimentos e larguras correspondentes. Esse método de segmentação pode ser aplicado para estudar o crescimento e o desenvolvimento em biologia do desenvolvimento, biomedicina e outras ciências relacionadas e permite que os pesquisadores analisem os efeitos de mutações genéticas em ossos craniofaciais individuais.

Introdução

O intrincado desenvolvimento do crânio e da face humanos engloba um sofisticado processo morfogenético 3D, intrincadamente orquestrado por vários genes. Esses genes desempenham um papel fundamental na regulação dos intrincados padrões, proliferação e diferenciação de tecidos derivados de diversas fontes embrionárias. Este processo altamente coordenado ressalta a complexidade do crescimento e desenvolvimento craniofacial humano. Malformações craniofaciais (incluindo fissura labiopalatina, fechamento de sutura craniana e hipoplasia facial) que ocorrem como resultado de anormalidades de desenvolvimento são responsáveis por mais de um terço de todos os defeitos congênitos congênitos. Como um animal modelo comumente usado em pesquisas biomédicas, o camundongo tem uma estrutura óssea craniomaxilofacial complexa e delicada que é muito semelhante ao osso craniomaxilofacial humano em termos de anatomia e fisiologia. O estudo da biologia do desenvolvimento craniomaxilofacial percorreu um longo caminho nos últimos anos com o advento de novas técnicas em genética de camundongos, especialmente em malformações1.

O ácido retinóico (AR) é o metabólito in vivo da vitamina A2. A deficiência de vitamina A (DVA) está associada a uma série de distúrbios multissistêmicos graves, como má remodelação óssea, fraturas, bem como malformações craniofaciais e malformações esqueléticas caracterizadas por nanismo 3,4 . Os receptores retinóides (RARs) são fatores de transcrição cruciais na sinalização retinóide5. Um mutante RARα403 dominante-negativo (dnRARα) foi projetado6 e um modelo de camundongo estabelecido no qual os osteoblastos expressavam dnRARα. Isso resultou nos camundongos exibindo nanismo, deformidades craniofaciais, formação óssea cortical incompleta e osso trabecular aumentado, mas mal remodelado.

A microtomografia computadorizada (microCT) tem grande potencial para o estudo das malformações craniomaxilofaciais. Possui a capacidade de detectar e rastrear a evolução de anormalidades esqueléticas inatas e adquiridas em modelos de roedores. A análise de imagem por microtomografia computadorizada oferece uma exploração aprofundada dos distúrbios do crescimento craniofacial em modelos de camundongos geneticamente modificados 7,8. Além disso, a imagem 3D surge como uma ferramenta vital para delinear características morfológicas, facilitando abordagens personalizadas de análise e visualização9. A micro-TC tem sido utilizada em vários estudos para analisar fenótipos craniofaciais, incluindo a definição de marcos anatômicos em humanos e camundongos e a análise volumétrica de cada osso craniofacial 10,11,12. Aqui, descrevemos em detalhes um método baseado na tecnologia microCT para separar e medir modelos 3D de ossos craniomaxilofaciais de camundongos para permitir uma melhor avaliação e análise do desenvolvimento esquelético craniomaxilofacial de camundongos do que é possível com os métodos atuais.

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Protocolo

Cumprimos todos os regulamentos éticos relevantes para testes e pesquisas em animais. Todos os procedimentos experimentais em animais foram aprovados pelo Comitê Consultivo Institucional de Pesquisa e Cuidados com Animais do Nono Hospital Popular de Xangai, Escola de Medicina, Universidade Jiaotong de Xangai.

Tanto a cepa Rosa26-loxp-stop-loxp-dnRARα403 (R26dn / dn) quanto a cepa Osterix-Cre (OsxCre) (No.006361) de camundongos usados aqui foram mantidos no fundo C57BL / 6. Camundongos R26dn/dn foram cruzados com camundongos OsxCre para gerar OSXCre; Camundongos R26dn/dn . Todos os camundongos foram criados e mantidos em condições específicas livres de patógenos (FPS).

1. Criação de ratos

NOTA: F significa o número de gerações de camundongos; N significa o número de gerações de acasalamento entre camundongos zigóticos e camundongos de fundo. Assim, F2 + N representa a segunda geração, bem como quaisquer programas subsequentes de reprodução de camundongos. F0 significa camundongos primários.

  1. Emparelhe um camundongo macho sexualmente maduro com um par de camundongos fêmeas de idade comparável. Inicie inspeções diárias para filhotes recém-nascidos após um período inicial de 18 dias. Ao identificar mulheres grávidas, isole-as, se necessário, para garantir o cuidado materno ideal. No caso de nenhuma gravidez ser observada dentro de um mês após o emparelhamento inicial, considere alternar o camundongo macho entre diferentes configurações de reprodução para promover a fertilização.
  2. Cruze camundongos R26dn/dncom camundongosOSX Cre (F0). Corte as caudas para genotipagem e mantenha o macho OSXCre; R26dn/+camundongos em gaiolas até a maturidade sexual, que é ~ 6 semanas de idade (F1).
  3. Cruzamento macho de seis semanas OSXCre; R26dn/+ratinhos com ratinhos R26dn/dnfêmeas (F2). Corte as caudas para genotipagem e substitua os camundongos reprodutores antigos por camundongos mais jovens a tempo (F2 + N).

2. Preparação

  1. Prepare quatro pares de OsxCre de 4 semanas, OSXCre; R26dn/+ e OSXCre; Camundongos R26dn/dn . Eutanasiar individualmente os camundongos por meio da administração de asfixia por dióxido de carbono.
    NOTA: Para garantir uma eutanásia eficiente, a taxa de fluxo de CO2 deve ser ajustada para deslocar aproximadamente 30% do volume da gaiola a cada minuto. Por exemplo, em uma gaiola medindo 45 cm x 30 cm x 30 cm, recomenda-se uma vazão de 40 L/min.
  2. Corte o pescoço do rato com uma tesoura enquanto segura seu corpo, deixando o crânio intacto.
    NOTA: Para obter um crânio completo, abra a boca do rato, corte ao longo do canto da boca com uma tesoura oftálmica, puxe as duas mãos para os dois lados e gire para descascar a pele da cabeça do rato.
  3. Mergulhe os crânios de camundongos em paraformaldeído a 4% por 48 h e armazene-os em etanol a 70%.
    CUIDADO: O paraformaldeído é tóxico; Use proteção adequada.
  4. Escaneie os crânios coletados com um scanner microCT - resolução: 4,5 μm; voltagem: 70 kV; corrente: 114 μA; filtro: 0,5 mm Al; passo de rotação: 0,5°.
  5. Armazene imagens de tomografia computadorizada. As imagens no formato DICOM são selecionadas para importação para o software e analisadas.

3. Imagem MicroCT e reconstrução 3D

NOTA: Todos os ossos utilizados neste estudo foram segmentados manualmente.

  1. Clique com o botão direito do mouse na página MASKs e selecione Nova máscara; uma nova camada chamada Verde é exibida.
  2. Selecione o intervalo de limite de 671 a 2.566 na página Limite exibida. Repita esse processo para todas as camadas relacionadas. (Figura 1A).
  3. Use a ferramenta Borracha no menu Editar para apagar manualmente os ossos presos à mandíbula em cada camada no plano sagital 2D (Figura 1B).
  4. Selecione a região da mandíbula no plano sagital 2D após clicar na opção Região de crescimento (Figura 1C).
    CUIDADO: Certifique-se de que a região mandibular esteja completamente selecionada em cada camada; caso contrário, resultará em uma mandíbula incompleta após a reconstrução.
  5. Clique na camada recém-criada Mandíbula na página MASKS e selecione Calcular 3D no menu suspenso (Figura 1D).
  6. Na interface de objetos 3D , clique com o botão direito do mouse em Mandíbula e clique em Propriedades. Clique para alterar a cor. Codifique por cores todos os modelos 3D reconstruídos com ossos diferentes.
  7. Clique em Medir no canto superior esquerdo e selecione a distância no menu suspenso que aparece. Calcule o comprimento marcando pontos na imagem 3D (Figura 1E).
    CUIDADO: A referência para medir a largura óssea é a parte mais larga do osso.
  8. Na interface de objetos 3D , clique com o botão direito do mouse em Mandíbula e clique em Propriedades. Properties-Info-Volume para ler os valores de volume reconstruídos para cada bloco ósseo craniomaxilofacial. (Figura 1F).
  9. Meça a mandíbula, o osso frontal, o osso parietal, o osso nasal, a pré-maxila, a maxila, o osso interparietal e o osso occipital da mesma forma que acima e marque-os individualmente com cores diferentes.

4. Análise estatística

  1. Realize análises estatísticas usando o software de sua escolha. Realizar testes t de Student bicaudais (n = 4/grupo).
  2. Para todos os gráficos, use barras de erro para representar desvios padrão. Considere os valores de P < 0,05 estatisticamente significativos.

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Resultados

Uma extensa pesquisa ressalta o impacto multifacetado das mutações genéticas no crescimento, desenvolvimento e sistemas de órgãos de camundongos. Uma avaliação abrangente dos ossos craniofaciais em camundongos mutantes requer métodos além da análise de imagem 2D ou de tecido único devido às suas limitações. Portanto, elucidar o desenvolvimento ósseo craniofacial é de suma importância para a investigação de distúrbios craniofaciais huma...

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Discussão

O MicroCT é uma ferramenta poderosa para obter informações 3D realistas e isotrópicas de amostras biológicas densas e opacas com resolução micrométrica. Os dados obtidos da microCT são calibrados para geometria e intensidade, tornando-a especialmente útil para estudos quantitativos 13,14,15,16,17. É utilizada para e...

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Divulgações

Os autores não têm conflitos de interesse a divulgar.

Agradecimentos

Este trabalho foi apoiado em parte por doações da Fundação Provincial de Ciências Naturais de Hainan da China (824MS152).

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Materiais

NameCompanyCatalog NumberComments
GraphPad Prism 6.01 SoftwareGraphPad Software Inc., La Jolla, CA, USA/
Micro-CTQuantum GX micro CT, PerkinElmer,
Waltham, MA, USA		/
Mimics Medical 19.0 Materialise, Leuven, Belgium/
Osterix-Cre (OsxCre) //from the Jackson Laboratory
Rosa26-loxp-stop-loxp-dnRARα403 strain//from the Columbia University, USA

Referências

  1. Chai, Y., Maxson, R. E. Jr Recent advances in craniofacial morphogenesis. Dev Dyn. 235 (9), 2353-2375 (2006).
  2. Mason, J. B., et al. Should universal distribution of high dose vitamin A to children cease. BMJ. 360, k927(2018).
  3. Roulier, S., Rochette-Egly, C., Rebut-Bonneton, C., Porquet, D., Evain-Brion, D. Nuclear retinoic acid receptor characterization in cultured human trophoblast cells: Effect of retinoic acid on epidermal growth factor receptor expression. Mol Cell Endocrinol. 105 (2), 165-173 (1994).
  4. Hayes, K. C., Cousins, R. J. Vitamin A deficiency and bone growth. I. Altered drift patterns. Calcif Tissue Res. 6 (2), 120-132 (1970).
  5. Ghyselinck, N. B., Duester, G. Retinoic acid signaling pathways. Development. 146 (13), dev167502(2019).
  6. Damm, K., Heyman, R. A., Umesono, K., Evans, R. M. Functional inhibition of retinoic acid response by dominant negative retinoic acid receptor mutants. Proc Natl Acad Sci U S A. 90 (7), 2989-2993 (1993).
  7. Ford-Hutchinson, A. F., Cooper, D. M., Hallgrímsson, B., Jirik, F. R. Imaging skeletal pathology in mutant mice by microcomputed tomography. J Rheumatol. 30 (12), 2659-2665 (2003).
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  9. Wong, M. D., Dorr, A. E., Walls, J. R., Lerch, J. P., Henkelman, R. M. A novel 3d mouse embryo atlas based on micro-ct. Development. 139 (17), 3248-3256 (2012).
  10. Motch Perrine, S. M., et al. Craniofacial divergence by distinct prenatal growth patterns in fgfr2 mutant mice. BMC Dev Biol. 14, 8(2014).
  11. Percival, C. J., Huang, Y., Jabs, E. W., Li, R., Richtsmeier, J. T. Embryonic craniofacial bone volume and bone mineral density in fgfr2(+/p253r) and nonmutant mice. Dev Dyn. 243 (4), 541-551 (2014).
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  13. Mizutani, R., Suzuki, Y. X-ray microtomography in biology. Micron. 43 (2-3), 104-115 (2012).
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  23. Rajion, Z. A., et al. A three-dimensional computed tomographic analysis of the cervical spine in unoperated infants with cleft lip and palate. Cleft Palate Craniofac J. 43 (5), 513-518 (2006).

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