Analisi delle malformazioni craniomaxillo-facciali nei topi mediante tomografia microcomputerizzata tridimensionale

Riepilogo

Qui, descriviamo in modo approfondito un metodo, che si basa sulla tomografia microcomputerizzata, per segmentare e misurare modelli 3D di ossa craniomaxillofacciali nei topi, per una migliore valutazione dello sviluppo osseo craniomaxillofacciale nei topi rispetto a quanto possibile con i metodi attuali.

Abstract

Per modellare le malformazioni craniofacciali causate da carenza di vitamina A (VAD), abbiamo espresso una mutazione dominante-negativa del recettore dei retinoidi negli osteoblasti per inibire specificamente l'attività trascrizionale di RAR nei topi. Questo approccio ci ha permesso di studiare gli effetti della VAD sull'ipomineralizzazione cranica, sulla deformità mandibolare e sull'ipoplasia clavicolare in casi clinici. In questo studio, la tomografia microcomputerizzata (microCT) della regione craniomaxillo-facciale dei topi ha rappresentato uno strumento prezioso per studiare la crescita e lo sviluppo di questo modello animale. La stima manuale delle immagini richiede tempo e non è accurata. Quindi, qui, presentiamo un approccio semplice, efficiente e accurato per segmentare e quantificare le immagini microCT di ciascun osso craniomaxillofacciale. Il software MicroCT è stato utilizzato per affettare la mandibola, l'osso frontale, l'osso parietale, l'osso nasale, la premascella, la mascella, l'osso interparietale e l'osso occipitale dei topi e misurare le lunghezze e le larghezze corrispondenti. Questo metodo di segmentazione può essere applicato per studiare la crescita e lo sviluppo nella biologia dello sviluppo, nella biomedicina e in altre scienze correlate e consente ai ricercatori di analizzare gli effetti delle mutazioni genetiche sulle singole ossa craniofacciali.

Introduzione

L'intricato sviluppo del cranio e del volto umano comprende un sofisticato processo morfogenetico 3D, orchestrato in modo intricato da numerosi geni. Questi geni svolgono un ruolo fondamentale nella regolazione degli intricati modelli, della proliferazione e della differenziazione dei tessuti derivati da diverse fonti embrionali. Questo processo altamente coordinato sottolinea la complessità della crescita e dello sviluppo craniofacciale umano. Le malformazioni craniofacciali (tra cui labiopalatoschisi, chiusura della sutura cranica e ipoplasia facciale) che si verificano a seguito di anomalie dello sviluppo rappresentano più di un terzo di tutti i difetti congeniti alla nascita. Come animale modello comunemente usato nella ricerca biomedica, il topo ha una struttura ossea craniomaxillo-facciale complessa e delicata che è molto simile all'osso craniomaxillo-facciale umano in termini di anatomia e fisiologia. Lo studio della biologia dello sviluppo craniomaxillo-facciale ha fatto molta strada negli ultimi anni con l'avvento di nuove tecniche nella genetica dei topi, in particolare nelle malformazioni¹.

L'acido retinoico (RA) è il metabolita in vivo della vitamina A². La carenza di vitamina A (VAD) è associata a una serie di gravi disturbi multisistemici, come scarso rimodellamento osseo, fratture, nonché malformazioni craniofacciali e malformazioni scheletriche caratterizzate da nanismo ^3,4 . I recettori dei retinoidi (RAR) sono fattori di trascrizione cruciali nella segnalazione dei retinoidi⁵. È stato progettato un mutante RARα403 dominante-negativo (dnRARα)⁶ e è stato stabilito un modello murino in cui gli osteoblasti esprimevano dnRARα. Ciò ha comportato che i topi mostrassero nanismo, deformità craniofacciali, formazione di osso corticale incompleto e aumento ma scarsamente rimodellato dell'osso trabecolare.

La tomografia microcomputerizzata (microCT) ha un grande potenziale per lo studio delle malformazioni craniomaxillo-facciali. Possiede la capacità di rilevare e tracciare l'evoluzione di anomalie scheletriche sia innate che acquisite nei modelli di roditori. L'analisi di imaging MicroCT offre un'esplorazione approfondita dei disturbi della crescita craniofacciale in modelli murini geneticamente modificati ^7,8 . Inoltre, l'imaging 3D emerge come uno strumento vitale per delineare i tratti morfologici, facilitando approcci di analisi e visualizzazione su misura⁹. La micro-CT è stata utilizzata in diversi studi per analizzare i fenotipi craniofacciali, tra cui la definizione di punti di riferimento anatomici nell'uomo e nei topi e l'analisi volumetrica di ciascun osso craniofacciale 10,11,12. Qui, descriviamo in dettaglio un metodo basato sulla tecnologia microCT per separare e misurare modelli 3D di ossa craniomaxillofacciali di topo per consentire una migliore valutazione e analisi dello sviluppo scheletrico craniomaxillofacciale di topo rispetto a quanto sia possibile con i metodi attuali.

Protocollo

Abbiamo rispettato tutte le normative etiche pertinenti per i test e la ricerca sugli animali. Tutte le procedure sperimentali sugli animali sono state approvate dal Comitato consultivo istituzionale per la cura e la ricerca degli animali del Nono Ospedale del Popolo di Shanghai, Scuola di Medicina, Università Jiaotong di Shanghai.

Sia il ceppo di topi Rosa26-loxp-stop-loxp-dnRARα403 (R26^dn/dn) che il ceppo di topi Osterix-Cre (Osx^Cre) (No.006361) utilizzati qui sono stati mantenuti sul fondo C57BL/6. I topi ^{R26 dn/dn} sono stati incrociati con i topi Osx^Cre per generare OSX^Cre; Topi R26^dn/dn. Tutti i topi sono stati allevati e mantenuti in condizioni specifiche prive di agenti patogeni (SPF).

1. Allevamento di topi

NOTA: F indica il numero di generazioni di topi; N indica il numero di generazioni di accoppiamento tra topi zigoti e topi di fondo. Pertanto, F2+N rappresenta la seconda generazione e tutti i successivi programmi di riproduzione dei topi. F0 significa topi primari.

1. Abbina un topo maschio sessualmente maturo con un paio di topi femmina di età comparabile. Iniziare le ispezioni giornaliere per i cuccioli appena nati dopo un periodo iniziale di 18 giorni. Dopo aver identificato le femmine gravide, isolarle se necessario per garantire un'assistenza materna ottimale. Nel caso in cui non si osservino gravidanze entro un mese dall'accoppiamento iniziale, considerare l'alternanza del topo maschio tra diverse configurazioni di riproduzione per favorire la fecondazione.
2. Incrocia i mouse R26^dn/dncon i mouse OSX^Cre (F0). Taglia le code per la genotipizzazione e mantieni il maschio OSX^Cre; R26^dn/+topi in gabbia fino alla maturità sessuale, ovvero ~6 settimane di età (F1).
3. Incrociare OSX^Cre, maschio di sei settimane; Topi R26^dn/+ con topi femmina R26^dn/dn(F2). Taglia le code per la genotipizzazione e sostituisci i vecchi topi da riproduzione con topi più giovani in tempo (F2+N).

2. Preparazione

1. Preparare quattro paia di Osx^Cre, OSX^Cre di 4 settimane; R26^dn/+ e OSX^Cre; Topi R26^dn/dn . Sopprimere individualmente i topi attraverso la somministrazione di asfissia da anidride carbonica.
   NOTA: Per garantire un'eutanasia efficiente, la portata di CO₂ deve essere regolata in modo da spostare circa il 30% del volume della gabbia ogni minuto. Ad esempio, in una gabbia di 45 cm x 30 cm x 30 cm, si consiglia una portata di 40 L/min.
2. Taglia il collo del topo con le forbici mentre tieni il suo corpo, lasciando intatto il cranio.
   NOTA: Per ottenere un cranio completo, aprire la bocca del topo, tagliare lungo l'angolo della bocca con le forbici oftalmiche, tirare entrambe le mani su entrambi i lati e ruotare per sbucciare la pelle della testa del topo.
3. Immergere i crani di topo in paraformaldeide al 4% per 48 ore, quindi conservarli in etanolo al 70%.
   ATTENZIONE: La paraformaldeide è tossica; Indossare una protezione adeguata.
4. Scansione dei crani raccolti con uno scanner microCT - risoluzione: 4,5 μm; tensione: 70 kV; corrente: 114 μA; filtro: 0,5 mm Al; passo di rotazione: 0,5°.
5. Memorizza le immagini della scansione TC. Le immagini in formato DICOM vengono selezionate per l'importazione nel software e analizzate.

3. Imaging MicroCT e ricostruzione 3D

NOTA: Tutte le ossa utilizzate in questo studio sono state segmentate manualmente.

1. Fare clic con il tasto destro del mouse sulla pagina MASCHERE e selezionare Nuova maschera; viene visualizzato un nuovo livello denominato Verde .
2. Selezionare l'intervallo di soglia 671-2.566 nella pagina Soglia che si apre. Ripetere questo processo per tutti i livelli correlati. (Figura 1A).
3. Utilizzare lo strumento Gomma nel menu Modifica per cancellare manualmente le ossa attaccate alla mandibola in ogni strato sul piano sagittale 2D (Figura 1B).
4. Selezionare la regione della mandibola sul piano sagittale 2D dopo aver fatto clic sull'opzione Crescita regione (Figura 1C).
   ATTENZIONE: Assicurarsi che la regione mandibolare sia selezionata completamente in ogni strato; In caso contrario, si tradurrà in una mandibola incompleta dopo la ricostruzione.
5. Fare clic sul livello Mandibola appena creato nella pagina MASCHERE e selezionare Calcola 3D dal menu a discesa (Figura 1D).
6. Nell'interfaccia degli oggetti 3D , fare clic con il pulsante destro del mouse su Mandibola e scegliere Proprietà. Fare clic per cambiare il colore. Codifica a colori tutti i modelli 3D ricostruiti con ossa diverse.
7. Fare clic su Misura nell'angolo in alto a sinistra e selezionare la distanza dal menu a discesa che appare. Calcolare la lunghezza contrassegnando i punti nell'immagine 3D (Figura 1E).
   ATTENZIONE: Il riferimento per misurare la larghezza dell'osso è la parte più larga dell'osso.
8. Nell'interfaccia degli oggetti 3D , fare clic con il pulsante destro del mouse su Mandibola e scegliere Proprietà. Modulo Properties-Info-Volume per leggere i valori di volume ricostruiti per ogni blocco osseo craniomaxillo-facciale. (Figura 1F).
9. Misurare la mandibola, l'osso frontale, l'osso parietale, l'osso nasale, la premascella, la mascella, l'osso interparietale e l'osso occipitale nello stesso modo di cui sopra e contrassegnarli singolarmente con colori diversi.

4. Analisi statistica

1. Esegui analisi statistiche utilizzando il software che preferisci. Esegui i test t di Student a due code (n = 4/gruppo).
2. Per tutti i grafici, utilizzare le barre di errore per rappresentare le deviazioni standard. Considera i valori P < 0,05 statisticamente significativi.

Risultati

Un'ampia ricerca sottolinea l'impatto multiforme delle mutazioni genetiche sulla crescita, lo sviluppo e i sistemi di organi dei topi. Una valutazione completa delle ossa craniofacciali nei topi mutanti richiede metodi che vanno oltre l'analisi di un singolo tessuto o di immagini 2D a causa delle loro limitazioni. Pertanto, chiarire lo sviluppo osseo craniofacciale è di fondamentale importanza per lo studio dei disturbi craniofacciali umani.

Discussione

La MicroCT è un potente strumento per ottenere informazioni 3D realistiche e isotrope da campioni biologici densi e opachi con risoluzione micrometrica. I dati ottenuti dalla microCT sono calibrati per geometria e intensità, il che la rende particolarmente utile per studi quantitativi 13,14,15,16,17. Viene utilizzato per stu...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
GraphPad Prism 6.01 Software	GraphPad Software Inc., La Jolla, CA, USA	/
Micro-CT	Quantum GX micro CT, PerkinElmer, Waltham, MA, USA	/
Mimics Medical 19.0	Materialise, Leuven, Belgium	/
Osterix-Cre (OsxCre)	/	/	from the Jackson Laboratory
Rosa26-loxp-stop-loxp-dnRARα403 strain	/	/	from the Columbia University, USA